Bcl-2、C-myc在肝细胞癌中表达及其临床意义
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李华. 潘承恩. 刘青光. 于良. 马清涌.
肝细胞癌.原癌基因.免疫组织化学.预后.
参见附件(184kb)。
作者：李华 潘承恩 刘青光 于良 马清涌
单位：(西安医科大学第一附属医院肝胆外科 西安 710061)
关键词：肝细胞癌；原癌基因；免疫组织化学；预后
西安医科大学学报000223 摘要 目的 探讨肝细胞癌中Bcl-2、C-myc蛋白的表达，以及两者可能具有的协同性。方法 应用免疫组化双标记法检测肝癌组织、癌周组织及正常组织中两者的表达，并用图像分析系统加以定量分析。结果 Bcl-2在三种组织中的表达量(PU值)分别为21.097±3.460、8.635±1.384、3.059±0.128，C-myc分别为36.702±4.961、10.585±1.263、1.547±0.043，均具显著性差异(P<0.01)。在肝细胞癌无肿瘤被膜组中具有高Bcl-2表达(P<0.05)，而在有肝硬化、具有门脉癌栓、无肿瘤被膜、高病理分级及高TNM分期中具有高C-myc表达(P<0.05)。高Bcl-2或(和)C-myc表达均与预后较差有关(P<0.05)，经Cox比例风险模型回归分析C-myc为一独立的预后指标。结论 Bcl-2与肝细胞癌发生有关，C-myc与肝细胞癌发生、发展有关，并可独立判断预后。两癌基因具有一定协同致癌性。
中图分类号 R730.3 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0152-04
Exepression of Bcl-2、C-myc protein in hepatocellular carcinoma and its relation to prognosis
Li Hua Pan Cheng′en Liu Qingguang
(Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital,Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT Objective To evaluate the expression of Bcl-2、C-myx protein in hepatocellular carcinoma(HCC),and the correlativity of the 2 oncogenes .Methods Immunohistochemical double staining technique (SABC) was used to detect the expression of the two genes in HCC tissues,liver tissues adjacent to cancer and normal liver tissues, and also analysed quantitatively by using the image system.Results It showed that the positive unit(PU) of Bcl-2 protein in 3 kinds of tissues were 21.097±3.460,8.635±1.384,3.059±0.128, respectively (P<0.01);the PU of C-myc were 36.702±4.961,10.585±1.263,1.547±0.043, respectively (P<0.01).Exepression of Bcl-2 in tumor without capsule groups were significantly higher than that in the control(P<0.05).The higher positive-staining expression of C-myc were found in the case of cirrhosis and tumor thrombi in the portal vein(TTPV),as well as in the case of tumor without capsule, higher pathological grade and higher TNM stage(P<0.05).Higher expression of Bcl-2 or/and C-myc were associated with shorter post-operative surival(P<0.05).C-myc expression can be regarded as an independent prognostic factor though Cox proportional hazad model.Conclusion Bcl-2 might be closely related to the occurrence of the HCC, C-myc was associated with the occurrence and development of HCC, and also could evaluated the prognosis independently. 2 oncogenes have synergetic relationship in the process of occurrence of HCC.
KEY WORDS HCC proto-oncogene immunohistochemisty prognosis
原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，它的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因变异的病变过程。我们拟在蛋白水平初步探讨Bcl-2及C-myc基因联合表达与HCC临床表现特征及预后之间的关系。
1 材料和方法1.1 组织来源 收集我科1988年7月至1997年12月行肝癌根治性切除，术后病理证实为肝细胞癌，资料完整的病例56例。每例存档石蜡标本再次确认。癌周组织为距癌缘1.0cm处肝组织。正常肝组织9例取自不可逆脑外伤者。
1.2 临床资料 56例HCC患者中男46例，女10例，年龄24～70岁，平均48.8岁。术前均未行放、化疗。随访期1～8年。临床TNM分期按UICC(1987)标准，其中Ⅰ期1例、Ⅱ期20例、Ⅲ期32例、ⅣA期3例、ⅣB期0例。肝癌分化按Edmondson肝细胞癌分级(1956)标准，其中Ⅰ级4例、Ⅱ级20例、Ⅲ级26例、Ⅳ级6例。肿瘤最大瘤径12～200mm(83.16±37.49)mm,合并肝硬化者42例(75.00%)，合并镜下门静脉癌栓(Tumor thrombi in the portal vein,TTPV)者35例(62.5%)。镜下TTPV评定参照Hsu等[1]的方法。
1.3 双重免疫组化酶标法(SABC法) 石蜡切片4μm厚，常规脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇液室温下10min。PBS液冲洗，浸入10mmol/L，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波修复10min，自然冷却。以1∶50正常羊血清封闭20min后，依次加入1∶100鼠抗人Bcl-2单抗(Dake公司，丹麦)4℃过夜,1∶100生物素化羊抗鼠IgG及SABC复合物(博士德公司，武汉)。DAB显色。入0.1mol/L H2SO4室温下冲洗30min。第二次染色以1∶50正常山羊血清为封闭液，1∶250兔抗人C-myc单抗(Oncogene公司)为一抗，1∶100生物素化山羊抗兔IgG为二抗，AEC显色，自然晒干后甘油胶封固。以已知Bcl-2、C-myc均强阳性表达的小细胞肺癌存档石蜡切片为阳性对照。分别以PBS液替代第二次染色中一抗、二抗及SABC复合物，以三次均不出现第二染色(红)或混合色(红棕)为阴性对照。
1.4 结果评价 以出现棕褐色染色为Bcl-2阳性结果，出现红色为C-myc阳性结果。采用TAS-PIUS全自动图像分析系统(德国)，以阳性单位(PU)表示染色强度。随机选取5个高倍视野，选择灰度参数，用公式PU=｜Gα-Gβ｜/Cmax×100计算出染色强度，即PU值。(Gα为切片中所测内容的平均灰度，Gβ为切片中的背景灰度，Gmax为最大灰度值)。
1.5 统计学方法 结果以
±s表示，所有数据均经SPSS for window 6.0统计软件分析，P<0.05为显著性差异检验水平。
2 结 果
2.1 Bcl-2、C-myc阳性结果分布 Bcl-2阳性结果为棕褐色，定位于细胞浆和(或)细胞膜处。C-myc阳性染色为红色颗粒状，定位于细胞核组织。部分切片上Bcl-2及C-myc阳性表达细胞同时存在，绝大部分定位于不同细胞，整体上交叉分布，有部分集中趋势，偶可见同一细胞上两癌基因同时表达，阴性对照试验均无阳性信号出现。
2.2 Bcl-2、C-myc在不同肝组织中的定量表达 Bcl-2、C-myc在正常肝细胞、癌旁组织及肝癌组织中阳性表达呈递增趋势，表现出相当一致性，即正常肝组织<癌旁组织<癌组织，并有显著性差异(P<0.01)。见表1。
表1 Bcl-2及C-myc在不同肝组织中的表达 (±s) 组 别
n
Bcl-2
C-myc
正常肝组织
9
3.059±0.128
1.547±0.043
癌旁组织
56
8.635±1.384
10.585±1.263
肝癌组织
56
21.097±3.460
36.702±4.961
注：每两两比较P<0.05
2.3 Bcl-2、C-myc在进展期HCC中的表达与临床病理特征关系 本实验中，Bcl-2及C-myc的表达量均在有无包膜组中有显著性差异(P<0.05)。C-myc在合并肝硬化、TTPV及高病理分级、高TNM分期组中有较高表达(P<0.05)，而Bcl-2在以上各组中表达无显著性差异(P>0.05).Bcl-2、C-myc表达与患者性别、年龄、血清HBsAg及肿瘤大小无关(P>0.05)。见表2。
2.4 HCC中的Bcl-2、C-myc的表达与预后的关系
2.4.1 Bcl-2、C-myc的表达对预后的影响 本组实验测得的进展期HCC中的Bcl-2平均PU值为21.097±3.460，C-myc为36.702±4.961。两者分别以21.097和36.702为界分为高、低表达组，应用Kaplan-meier法制作累积生存曲线并经log-rank检验，结果显示Bcl-2高、低表达组术后生存曲线有显著性差异(P<0.05)，C-myc高、低表达组间也有显著性差异(P<0.05)。二者均高表达预后极显著不同于两者均低表达组(P<0.001)。见图1、2、3。
2.4.2 多因素分析(COX模型)结果 将性别、年龄及Bcl-2、C-myc等16项指标数量化后，经Cox比例风险模型分析，结果显示有三项与预后有关的独立影响因素：肿瘤包膜、C-myc蛋白表达及TTPV。各因素标准回归系数均为正数，即正相关。见表3。表2 Bcl-2及C-myc在HCC中的定量表达与临床病理特征的关系 (±s) 临床病理特征
n
Bcl-2
P值
C-myc
P值
合并肝硬化
+
42
20.843±2.972
37.796±4.082
-
14
21.179±3.645
>0.05
34.625±5.178
<0.05
TTPV
+
35
21.003±1.287
38.855±5.274
-
21
21.154±3.506
>0.05
34.671±4.169
<0.05
包 膜
完整
21
19.815±3.151
34.158±3.612
不完整
13
21.774±2.493
36.728±5.014
无
22
22.586±3.544
<0.05
38.995±3.302
<0.05
病理分级
Ⅰ～Ⅱ
24
21.293±3.457
35.057±3.285
Ⅲ～Ⅳ
32
20.861±2.804
>0.05
37.962±5.008
<0.05
TNM分期
Ⅰ～Ⅱ
21
20.365±2.180
34.250±4.766
Ⅲ
32
21.119±3.525
37.013±3.994
Ⅳ
3
20.838±3.491
>0.05
38.976±5.183
<0.05
注：为每两两比较结果表3 多因素Cox模型分析结果 变量名称
相对危险度(R)
回归系数(b)
标准误(s)
标准回归系数(b′)
WALD统计量
P值
肿瘤包膜
1.2271
1.1255
0.2920
3.0818
14.8578
0.0001
C-myc表达
1.1218
1.1340
0.4751
3.1081
5.6963
0.0270
门脉癌栓
1.1028
1.2828
0.5959
3.6067
4.6345
0.0313
方程总χ2=53.251;υ=3,P<0.001
图1 Bcl-2表达对HCC预后的影响(P<0.05)
A：Bcl-2<21.097 B：Bcl-2≥21.097
图2 C-myc表达对HCC预后的影响(P<0.05)
A：C-myc<36.702 B:C-myc≥36.702
图3 Bcl-2及C-myc共同表达对HCC
预后的影响(P<0.001)
A：Bcl-2<21.097及C-myc<36.702
B：Bcl-2≥21.097及C-myc≥36.702
C：Bcl-2≥21.097或C-myc≥36.702
3 讨 论
目前已发现在HCC中有多种癌基因、抑癌基因及凋亡调控基因的异常表达[2]。Bcl-2和C-myx基因作为其中的重要代表日益受到重视。
Bcl-2原癌基因最初是在Bcell淋巴瘤中t(14∶18)染色体易位点处发现的，随后大量的实验显示其为一种抗凋亡基因。研究表明Bcl-2在许多恶性肿瘤如胃癌、乳腺癌等中表达，并与肿瘤的发生、发展有关[3，4]。转基因动物实验表明，表达Bcl-2在肝细胞可免于抗Fas抗体介导的肝细胞凋亡，从而诱发肝癌发生[5]。Zhao等研究则认为，Bcl-2蛋白只在肝细胞癌组织中表达，癌旁不典型增生肝细胞并不表达，提示该基因可能与肝细胞分化、肿瘤发生无关[6]。还有学者认为Bcl-2在肝细胞癌中不表达。本组实验则显示出Bcl-2蛋白表达在正常肝组织、癌旁组织及肝癌组织中具有显著性差异，强烈提该基因对于HCC的发生可能所起的促进作用。但在进展期HCC中，Bcl-2蛋白表达与肿瘤大小、门脉癌栓及病理分级、TNM分期等肿瘤重要衡量指标无关，表明该基因对HCC的发展及晚期肝癌的形成似乎并不起决定性作用。我们认为并不是所有的程序化死亡都可用Bcl-2来阻止，还有独立于Bcl-2的其它引起细胞凋亡的途径和因素。
C-myc基因是较早发现并研究的癌基因之一，该基因除具有刺激细胞增生的功能外，还具有促进凋亡的作用，这种相互对立的作用依赖于关键性生长因子的存在与否[7]。在HCC研究中，C-myc基因异常表达可能与肿瘤的发生、发展有关，但结论并不完全一致[8，9]。本实验表明在HCC癌组织及癌周组织中，C-myc阳性表达水平显著升高(P<0.05)，显示该基因活化发生在肝癌的早期，可能参与了肝细胞的癌变。Tiniako等研究认为肝癌组织中C-myc蛋白表达增加与肝病背景密切相关[10]。本实验结果支持此观点，在伴有肝硬化组中C-myc蛋白表达水平明显增高，肝硬化组织细胞反复再生，使突变机会上升，癌基因变异水平增加，致癌变发生发展。本实验结果还显示在HCC中，C-myc在具有门脉癌栓、无肿瘤包膜及较低分化及高TNM分期者有较高表达水平，此与大多数研究结果相同[8]，同时也表明C-myc基因的异常活化在HCC发展过程中可能是决定性因素之一。
有学者认为Bcl-2与C-myc共同表达可使肿瘤获得永生化[11]。本实验中Bcl-2、C-myc在正常肝组织、癌周组织及癌组织中相伴存在，表达平行增高，在多数组织中的分布有较强的一致性，显示两者在致癌的启动和演变过程中可能具有的协同作用。Bcl-2作为C-myc基因关键性调节因子之一，不但可阻断C-myc所诱导的凋亡而不影响其丝裂原活性，它自身所具有的抗凋亡机制在肿瘤发生中也发挥很大作用。从双重免疫组化染色显示的Bcl-2及C-myc蛋白阳性染色分布可推想，两癌基因在致癌因子的作用下，大部分分别在不同的细胞中发生变异，经过不同的途径发挥作用并通过某种中介达到协同致癌目的。
Bcl-2和(或)C-myc高表达与HCC预后不良有关，两者共同高表达预后更差(P<0.001)。由图3可见远期生存曲线间有部分交叉现象，这可能与我们资料中长期随访病例较少有关。多因素分析则显示C-myc可作为一个独立的预后因子，其高表达者具有高死亡率，对预后作用的强度仅次于“有无门脉癌栓”。而Bcl-2尚不能独立的准确判断预后，两基因联合检测可更加提高其预后判断价值。
另外我们还应注意到癌周组织中Bcl-2、C-myc基因表达均较正常肝组织有显著增高，这些近似“正常细胞”虽然在细胞形态上尚未出现改变，基因水平已非完全正常，并具备较高的潜在致癌状态。本实验所选距肿瘤1cm处的癌周组织显然已不能满足根治要求。
参考文献
1，Hsu HC, Shen JC,Lee CS et al.Prognostic histologic parameters in resected small hepatocellular carcinoma:a comparison with resected large hepatocellular carcinoma[J].Cancer ,1985;56∶672
2，李 华，潘承恩.多基因变异与肝细胞癌[J].实用肿瘤学杂志，1998；12(1)∶76
3，Lauwers GY,Scott GV, Karpeh MS.Immunohistochemical evaluation of Bcl-2 protein expression in gastric adenocarcinomas[J].Cancer, 1995;75∶2209
4，Charpin C, Garcia S,Bouvier C et al.Automated and quantitative immunocytochemical assays of Bcl-2 protein in breast carcinomas[J].Br J Cancer,1997;76∶340
5，闫庆国，王文亮，黄高升.原发性肝癌细胞凋亡的研究进展[J].国外医学外科学分册，1997；24(5)∶268
6，Zhao M, Zhang NX,Economou M et al.Immunohistochemical detection of Bcl-2 in liver lesions:Bcl-2 protein is express in hepatocellular carcinoma ,but not in liver cell dysplasia[J].Histopathology,1994;25∶237
7，Willims GT.Smith CA.Molecular regulation of apoptosis :genetic control on cell death[J].Cell,1993;74∶777
8，Yaswen P,Goyetta M,Shank P et al.Expression of C-Ki-ras,C-Ha-ras and C-myc in specific cell types during hepatocarcinogenesis[J].Mol Cell Biol,1985;5∶780
9，陈子华，吕新生，文继航等.原癌基因Jun/C-myc在原发性肝细胞癌中的表达及意义[J].中华实验外科杂志，1997；14(5)∶277
10，Tiniakos D,Spandidos DA, Yiagnisis M et al.Expression of ras and C-myc onco-protein and hepatitis B surface antigen in human liver disease[J].Hepatogastroenterology,1993;40∶56
11，Martin SJ,Green DR, Cotter TG.Dicing with death:dissecting the components of the apopotosis machinery[J].TIBS,1994;19∶26
(1999-10-12收稿 1999-11-23修回)
作者：李华 潘承恩 刘青光 于良 马清涌
单位：(西安医科大学第一附属医院肝胆外科 西安 710061)
关键词：肝细胞癌；原癌基因；免疫组织化学；预后
西安医科大学学报000223 摘要 目的 探讨肝细胞癌中Bcl-2、C-myc蛋白的表达，以及两者可能具有的协同性。方法 应用免疫组化双标记法检测肝癌组织、癌周组织及正常组织中两者的表达，并用图像分析系统加以定量分析。结果 Bcl-2在三种组织中的表达量(PU值)分别为21.097±3.460、8.635±1.384、3.059±0.128，C-myc分别为36.702±4.961、10.585±1.263、1.547±0.043，均具显著性差异(P<0.01)。在肝细胞癌无肿瘤被膜组中具有高Bcl-2表达(P<0.05)，而在有肝硬化、具有门脉癌栓、无肿瘤被膜、高病理分级及高TNM分期中具有高C-myc表达(P<0.05)。高Bcl-2或(和)C-myc表达均与预后较差有关(P<0.05)，经Cox比例风险模型回归分析C-myc为一独立的预后指标。结论 Bcl-2与肝细胞癌发生有关，C-myc与肝细胞癌发生、发展有关，并可独立判断预后。两癌基因具有一定协同致癌性。
中图分类号 R730.3 文献标识码 A 文章编号 0258-0659(2000)02-0152-04
Exepression of Bcl-2、C-myc protein in hepatocellular carcinoma and its relation to prognosis
Li Hua Pan Cheng′en Liu Qingguang
(Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital,Xi′an Medical University, Xi′an 710061，China)
ABSTRACT Objective To evaluate the expression of Bcl-2、C-myx protein in hepatocellular carcinoma(HCC),and the correlativity of the 2 oncogenes .Methods Immunohistochemical double staining technique (SABC) was used to detect the expression of the two genes in HCC tissues,liver tissues adjacent to cancer and normal liver tissues, and also analysed quantitatively by using the image system.Results It showed that the positive unit(PU) of Bcl-2 protein in 3 kinds of tissues were 21.097±3.460,8.635±1.384,3.059±0.128, respectively (P<0.01);the PU of C-myc were 36.702±4.961,10.585±1.263,1.547±0.043, respectively (P<0.01).Exepression of Bcl-2 in tumor without capsule groups were significantly higher than that in the control(P<0.05).The higher positive-staining expression of C-myc were found in the case of cirrhosis and tumor thrombi in the portal vein(TTPV),as well as in the case of tumor without capsule, higher pathological grade and higher TNM stage(P<0.05).Higher expression of Bcl-2 or/and C-myc were associated with shorter post-operative surival(P<0.05).C-myc expression can be regarded as an independent prognostic factor though Cox proportional hazad model.Conclusion Bcl-2 might be closely related to the occurrence of the HCC, C-myc was associated with the occurrence and development of HCC, and also could evaluated the prognosis independently. 2 oncogenes have synergetic relationship in the process of occurrence of HCC.
KEY WORDS HCC proto-oncogene immunohistochemisty prognosis
原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，它的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因变异的病变过程。我们拟在蛋白水平初步探讨Bcl-2及C-myc基因联合表达与HCC临床表现特征及预后之间的关系。
1 材料和方法1.1 组织来源 收集我科1988年7月至1997年12月行肝癌根治性切除，术后病理证实为肝细胞癌，资料完整的病例56例。每例存档石蜡标本再次确认。癌周组织为距癌缘1.0cm处肝组织。正常肝组织9例取自不可逆脑外伤者。
1.2 临床资料 56例HCC患者中男46例，女10例，年龄24～70岁，平均48.8岁。术前均未行放、化疗。随访期1～8年。临床TNM分期按UICC(1987)标准，其中Ⅰ期1例、Ⅱ期20例、Ⅲ期32例、ⅣA期3例、ⅣB期0例。肝癌分化按Edmondson肝细胞癌分级(1956)标准，其中Ⅰ级4例、Ⅱ级20例、Ⅲ级26例、Ⅳ级6例。肿瘤最大瘤径12～200mm(83.16±37.49)mm,合并肝硬化者42例(75.00%)，合并镜下门静脉癌栓(Tumor thrombi in the portal vein,TTPV)者35例(62.5%)。镜下TTPV评定参照Hsu等[1]的方法。
1.3 双重免疫组化酶标法(SABC法) 石蜡切片4μm厚，常规脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇液室温下10min。PBS液冲洗，浸入10mmol/L，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波修复10min，自然冷却。以1∶50正常羊血清封闭20min后，依次加入1∶100鼠抗人Bcl-2单抗(Dake公司，丹麦)4℃过夜,1∶100生物素化羊抗鼠IgG及SABC复合物(博士德公司，武汉)。DAB显色。入0.1mol/L H2SO4室温下冲洗30min。第二次染色以1∶50正常山羊血清为封闭液，1∶250兔抗人C-myc单抗(Oncogene公司)为一抗，1∶100生物素化山羊抗兔IgG为二抗，AEC显色，自然晒干后甘油胶封固。以已知Bcl-2、C-myc均强阳性表达的小细胞肺癌存档石蜡切片为阳性对照。分别以PBS液替代第二次染色中一抗、二抗及SABC复合物，以三次均不出现第二染色(红)或混合色(红棕)为阴性对照。
1.4 结果评价 以出现棕褐色染色为Bcl-2阳性结果，出现红色为C-myc阳性结果。采用TAS-PIUS全自动图像分析系统(德国)，以阳性单位(PU)表示染色强度。随机选取5个高倍视野，选择灰度参数，用公式PU=｜Gα-Gβ｜/Cmax×100计算出染色强度，即PU值。(Gα为切片中所测内容的平均灰度，Gβ为切片中的背景灰度，Gmax为最大灰度值)。
1.5 统计学方法 结果以
±s表示，所有数据均经SPSS for window 6.0统计软件分析，P<0.05为显著性差异检验水平。2 结 果
2.1 Bcl-2、C-myc阳性结果分布 Bcl-2阳性结果为棕褐色，定位于细胞浆和(或)细胞膜处。C-myc阳性染色为红色颗粒状，定位于细胞核组织。部分切片上Bcl-2及C-myc阳性表达细胞同时存在，绝大部分定位于不同细胞，整体上交叉分布，有部分集中趋势，偶可见同一细胞上两癌基因同时表达，阴性对照试验均无阳性信号出现。
2.2 Bcl-2、C-myc在不同肝组织中的定量表达 Bcl-2、C-myc在正常肝细胞、癌旁组织及肝癌组织中阳性表达呈递增趋势，表现出相当一致性，即正常肝组织<癌旁组织<癌组织，并有显著性差异(P<0.01)。见表1。
表1 Bcl-2及C-myc在不同肝组织中的表达 (
±s) 组 别n
Bcl-2
C-myc
正常肝组织
9
3.059±0.128
1.547±0.043
癌旁组织
56
8.635±1.384
10.585±1.263
肝癌组织
56
21.097±3.460
36.702±4.961
注：每两两比较P<0.05
2.3 Bcl-2、C-myc在进展期HCC中的表达与临床病理特征关系 本实验中，Bcl-2及C-myc的表达量均在有无包膜组中有显著性差异(P<0.05)。C-myc在合并肝硬化、TTPV及高病理分级、高TNM分期组中有较高表达(P<0.05)，而Bcl-2在以上各组中表达无显著性差异(P>0.05).Bcl-2、C-myc表达与患者性别、年龄、血清HBsAg及肿瘤大小无关(P>0.05)。见表2。
2.4 HCC中的Bcl-2、C-myc的表达与预后的关系
2.4.1 Bcl-2、C-myc的表达对预后的影响 本组实验测得的进展期HCC中的Bcl-2平均PU值为21.097±3.460，C-myc为36.702±4.961。两者分别以21.097和36.702为界分为高、低表达组，应用Kaplan-meier法制作累积生存曲线并经log-rank检验，结果显示Bcl-2高、低表达组术后生存曲线有显著性差异(P<0.05)，C-myc高、低表达组间也有显著性差异(P<0.05)。二者均高表达预后极显著不同于两者均低表达组(P<0.001)。见图1、2、3。
2.4.2 多因素分析(COX模型)结果 将性别、年龄及Bcl-2、C-myc等16项指标数量化后，经Cox比例风险模型分析，结果显示有三项与预后有关的独立影响因素：肿瘤包膜、C-myc蛋白表达及TTPV。各因素标准回归系数均为正数，即正相关。见表3。表2 Bcl-2及C-myc在HCC中的定量表达与临床病理特征的关系 (
±s) 临床病理特征n
Bcl-2
P值
C-myc
P值
合并肝硬化
+
42
20.843±2.972
37.796±4.082
-
14
21.179±3.645
>0.05
34.625±5.178
<0.05
TTPV
+
35
21.003±1.287
38.855±5.274
-
21
21.154±3.506
>0.05
34.671±4.169
<0.05
包 膜
完整
21
19.815±3.151
34.158±3.612
不完整
13
21.774±2.493
36.728±5.014
无
22
22.586±3.544
<0.05
38.995±3.302
<0.05
病理分级
Ⅰ～Ⅱ
24
21.293±3.457
35.057±3.285
Ⅲ～Ⅳ
32
20.861±2.804
>0.05
37.962±5.008
<0.05
TNM分期
Ⅰ～Ⅱ
21
20.365±2.180
34.250±4.766
Ⅲ
32
21.119±3.525
37.013±3.994
Ⅳ
3
20.838±3.491
>0.05
38.976±5.183
<0.05
注：为每两两比较结果表3 多因素Cox模型分析结果 变量名称
相对危险度(R)
回归系数(b)
标准误(s
)标准回归系数(b′)
WALD统计量
P值
肿瘤包膜
1.2271
1.1255
0.2920
3.0818
14.8578
0.0001
C-myc表达
1.1218
1.1340
0.4751
3.1081
5.6963
0.0270
门脉癌栓
1.1028
1.2828
0.5959
3.6067
4.6345
0.0313
方程总χ2=53.251;υ=3,P<0.001
图1 Bcl-2表达对HCC预后的影响(P<0.05)
A：Bcl-2<21.097 B：Bcl-2≥21.097
图2 C-myc表达对HCC预后的影响(P<0.05)
A：C-myc<36.702 B:C-myc≥36.702
图3 Bcl-2及C-myc共同表达对HCC
预后的影响(P<0.001)
A：Bcl-2<21.097及C-myc<36.702
B：Bcl-2≥21.097及C-myc≥36.702
C：Bcl-2≥21.097或C-myc≥36.702
3 讨 论
目前已发现在HCC中有多种癌基因、抑癌基因及凋亡调控基因的异常表达[2]。Bcl-2和C-myx基因作为其中的重要代表日益受到重视。
Bcl-2原癌基因最初是在Bcell淋巴瘤中t(14∶18)染色体易位点处发现的，随后大量的实验显示其为一种抗凋亡基因。研究表明Bcl-2在许多恶性肿瘤如胃癌、乳腺癌等中表达，并与肿瘤的发生、发展有关[3，4]。转基因动物实验表明，表达Bcl-2在肝细胞可免于抗Fas抗体介导的肝细胞凋亡，从而诱发肝癌发生[5]。Zhao等研究则认为，Bcl-2蛋白只在肝细胞癌组织中表达，癌旁不典型增生肝细胞并不表达，提示该基因可能与肝细胞分化、肿瘤发生无关[6]。还有学者认为Bcl-2在肝细胞癌中不表达。本组实验则显示出Bcl-2蛋白表达在正常肝组织、癌旁组织及肝癌组织中具有显著性差异，强烈提该基因对于HCC的发生可能所起的促进作用。但在进展期HCC中，Bcl-2蛋白表达与肿瘤大小、门脉癌栓及病理分级、TNM分期等肿瘤重要衡量指标无关，表明该基因对HCC的发展及晚期肝癌的形成似乎并不起决定性作用。我们认为并不是所有的程序化死亡都可用Bcl-2来阻止，还有独立于Bcl-2的其它引起细胞凋亡的途径和因素。
C-myc基因是较早发现并研究的癌基因之一，该基因除具有刺激细胞增生的功能外，还具有促进凋亡的作用，这种相互对立的作用依赖于关键性生长因子的存在与否[7]。在HCC研究中，C-myc基因异常表达可能与肿瘤的发生、发展有关，但结论并不完全一致[8，9]。本实验表明在HCC癌组织及癌周组织中，C-myc阳性表达水平显著升高(P<0.05)，显示该基因活化发生在肝癌的早期，可能参与了肝细胞的癌变。Tiniako等研究认为肝癌组织中C-myc蛋白表达增加与肝病背景密切相关[10]。本实验结果支持此观点，在伴有肝硬化组中C-myc蛋白表达水平明显增高，肝硬化组织细胞反复再生，使突变机会上升，癌基因变异水平增加，致癌变发生发展。本实验结果还显示在HCC中，C-myc在具有门脉癌栓、无肿瘤包膜及较低分化及高TNM分期者有较高表达水平，此与大多数研究结果相同[8]，同时也表明C-myc基因的异常活化在HCC发展过程中可能是决定性因素之一。
有学者认为Bcl-2与C-myc共同表达可使肿瘤获得永生化[11]。本实验中Bcl-2、C-myc在正常肝组织、癌周组织及癌组织中相伴存在，表达平行增高，在多数组织中的分布有较强的一致性，显示两者在致癌的启动和演变过程中可能具有的协同作用。Bcl-2作为C-myc基因关键性调节因子之一，不但可阻断C-myc所诱导的凋亡而不影响其丝裂原活性，它自身所具有的抗凋亡机制在肿瘤发生中也发挥很大作用。从双重免疫组化染色显示的Bcl-2及C-myc蛋白阳性染色分布可推想，两癌基因在致癌因子的作用下，大部分分别在不同的细胞中发生变异，经过不同的途径发挥作用并通过某种中介达到协同致癌目的。
Bcl-2和(或)C-myc高表达与HCC预后不良有关，两者共同高表达预后更差(P<0.001)。由图3可见远期生存曲线间有部分交叉现象，这可能与我们资料中长期随访病例较少有关。多因素分析则显示C-myc可作为一个独立的预后因子，其高表达者具有高死亡率，对预后作用的强度仅次于“有无门脉癌栓”。而Bcl-2尚不能独立的准确判断预后，两基因联合检测可更加提高其预后判断价值。
另外我们还应注意到癌周组织中Bcl-2、C-myc基因表达均较正常肝组织有显著增高，这些近似“正常细胞”虽然在细胞形态上尚未出现改变，基因水平已非完全正常，并具备较高的潜在致癌状态。本实验所选距肿瘤1cm处的癌周组织显然已不能满足根治要求。
参考文献
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5，闫庆国，王文亮，黄高升.原发性肝癌细胞凋亡的研究进展[J].国外医学外科学分册，1997；24(5)∶268
6，Zhao M, Zhang NX,Economou M et al.Immunohistochemical detection of Bcl-2 in liver lesions:Bcl-2 protein is express in hepatocellular carcinoma ,but not in liver cell dysplasia[J].Histopathology,1994;25∶237
7，Willims GT.Smith CA.Molecular regulation of apoptosis :genetic control on cell death[J].Cell,1993;74∶777
8，Yaswen P,Goyetta M,Shank P et al.Expression of C-Ki-ras,C-Ha-ras and C-myc in specific cell types during hepatocarcinogenesis[J].Mol Cell Biol,1985;5∶780
9，陈子华，吕新生，文继航等.原癌基因Jun/C-myc在原发性肝细胞癌中的表达及意义[J].中华实验外科杂志，1997；14(5)∶277
10，Tiniakos D,Spandidos DA, Yiagnisis M et al.Expression of ras and C-myc onco-protein and hepatitis B surface antigen in human liver disease[J].Hepatogastroenterology,1993;40∶56
11，Martin SJ,Green DR, Cotter TG.Dicing with death:dissecting the components of the apopotosis machinery[J].TIBS,1994;19∶26
(1999-10-12收稿 1999-11-23修回)
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