肾衰口服液对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响
http://www.100md.com
周清发. 刘静. 席春生.
系膜细胞.增殖.肾衰口服液.实验研究.
参见附件(174kb)。
作者：周清发 刘静 席春生
单位：(西安医科大学第二临床医学院中医科 西安 710004)
关键词：系膜细胞；增殖；肾衰口服液；实验研究
西安医科大学学报000110摘要 为探讨肾衰口服液(SSOL)的作用机理，采用细胞培 养与细胞分子学技术相结合方法，在大鼠肾小球系膜细胞培养体系中加入该药，研究其对系 膜细胞(Mesangial cell,MC)增殖和肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响。结果： SSOL加入MC培养体系6d后，MC数(活细胞个数)为46700±3819，明显低于对照组147500±139 19(P<0.01)；该药抑制MC增殖作用亦较对照组显著(P<0.01)。MC上清液中TNF-α 含量对照组为(8.98±1.11)mg/L，治疗组(1.64±0.57)mg/L，有非常显著性差异(P <0.01)。提示SSOL对肾小球MC增殖有明显抑制作用。
中图分类号 R289.5，R364.3+3 文献标识码 A
文章编号 0258-065 9(2000)01-0026-02
Effect of shenshuai oral liquid on the proliferation of glomerularme s angial cell Zhou Qingfa,Liu Jing ,Xi Chunsheng
(De partment of Traditional Chinese Medicine, Second Affiliated Hospital,Xi′an Medical Universi ty, Xi′an 710004,China)
ABSTRACT To investigate the effect and mechanism of SSOL on th e proliferation of glomerular mesangial cell, by means of molecular biological t e chnique in connection with cell culture technique, added SSOL into the culture s y stem, then observed the effect of SSOL on Mcs proliferation and the secretion of TNF-α from MC.After 6d of culturing, the amount of alive Mcs of SSOL group wa s 46700±3819,markedly lower than that of control group 147500±13919(P<0.01 ).T he inhibition to Mcs proliferation of SSOL group was significantly higher than t hat of control group(P<0.01),the function was in dose-dependence.TNF-α le vels in supernate of SSOL group and control group were respectively as follows:1 .64±0.57,8.98±1.11(P<0.01).SSOL can significantly inhibit the proliferatio n of MC.
KEY WORDS mesangial cell(MC) proliferation shenshuai oral liqu id (SOOL) experimental research
肾小球系膜细胞(Mesangial cell, MC)过度增生、系膜基质增加是肾小球疾病的基本病变， 也是导致肾小球硬化的重要因素。如何防止系膜病变的发生、发展是肾小球疾病研究的重要 课题，目前主要集中在抗凝药物及细胞因子拮抗因素的研究[1，2]，尚未得到临 床推广应用。中医药在此方面研究相对较少，临床行之有效的中药复方对MC增殖的影响尚待 进一步探讨。本研究采用大鼠肾小球MC培养方法与细胞分子学技术相结合，观察肾衰口服液 (shen shuai oral liquid, SSOL)对肾小球MC生长、增殖和肿瘤TNF-α的影响，在细胞因 子水平，探讨其治疗慢性肾功能衰竭(Chronic renal failure, CRF)的作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验材料 药物：SSOL(由黄芪、大黄、附子、冬虫夏草、 丹参、川芎、牡蛎等组成方剂)具有温补脾肾、益气活血、祛毒降浊之功效。主要用于 治疗 各种原因引起的慢性肾功能衰竭。由第二临床医学院制剂室制备，含生药1.5kg/L。实验细 胞：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠肾小球MC(第5代)，由上海第二军医大学长征医院肾 内科提供。试剂：RPMI1640培养基，华美生物技术公司；噻唑蓝(MTT)华美生物技术公司； 胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物技术公司；胰蛋白酶，Difco公司产品；TNF-α放射免疫 分析药盒，北京东亚免疫技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)，院中心实验室提供。仪器：18 25 TCCO2孵育箱，谢尔 登国际有限公司产品：DG-3022A型酶联免疫检测仪 ，南京华东有限 公司产品；XSZ-D倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品；KYKY-1000型相差显微镜，中科院 科学仪器厂产品；24孔、96孔细胞培养板，Corning公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 活细胞计数 将培养的MC用胰蛋白酶消化后，按 104个/ml接种在24孔培养板上(0.2ml/孔)，待细胞贴壁后，用含0.4%FBS的培养液使细 胞生长同期静止(G0期)72h，分两组换液，治疗组12孔换20%FBS培养液+SSOL(浓度为35μ g/ml)；对照组12孔仅换20%FBS培养液，不加任何药物，作为对照。培养后第2、4、6、8天 ，各组每次取3孔，经台盼蓝染色，计MC活性细胞数。
1.2.2 MC增殖测定 采用MTT法。将MC接种于96孔培养 板生长至亚融合状态后，用含0.4%FBS的培养液使其静止72h，分组更换培养液，对照组 仍用20% FBS的正常培养液；治疗组分为4个亚组，分别将SSOL对倍稀释(1∶1，1∶2，1∶4 ，1∶8)，即35.00、17.50、8.75、4.38μg/ml(每种浓度设3个孔)。培养6d后，每孔加 入5g/L MTT原液20ml，继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各 孔吸光值(OD值)。
1.2.3 TNF-α活性测定 液相竞争法，按试剂盒说明 操作。按上述方法在24孔板使MC同步于G0期，分为两组(各组n=4)，治疗组用SSOL 3 5.0 0μg/ml+培养液，对照组不加任何药物，仅用培养液，两组细胞同时培养6d后，收集各组MC 上清检测TNF-α含量。
1.2.4 统计学处理 所有数据均按均数±标准差(
±s)表示，采用方差分析及q检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异 非常显著。
2 结 果
2.1 SSOL对肾小球MC生长的影响 比较两组第2、4d MC台盼蓝 染色细胞计数，无统计学差异(P>0.05)。第6d治疗组MC活细胞个数为46700±3819， 对照 组为147500±13919，两组比较，有非常显著性差异(P<0.01)。说明SSOL有抑制MC生长 作用。
2.2 SSOL对肾小球MC增殖的影响 从附表可以看出，SSO L不同浓度组其吸光度值均明显低于对照组(P<0.01)。说明SSOL对MC增殖有抑制作用， 并且这种抑制作用随药物浓度升高而增强。
附表 两组细胞OD值的比较 (±s) 组别
n
稀 释 度
1∶1
1∶2
1∶4
1∶8
治疗组
3
0.017±0.0006*
0.0 23±0.012*
0.027±0.012*
0.030±0.017*
对照组
3
0.143±0.021
0.237±0.031
0.363±0.065
0.417±0.049)
*与对照组比较P<0.01
2.3 肾小球MC上清中TNF-α活性含量分析 通过取MC上清检测结果，治疗组为(1.64±0.57)mg/L；对照组为(8.98±1.11)mg /L，对照组TNF-α含量显著高于治疗组(P<0.01)。说明SSOL有拮抗MC分泌TNF-α活性 物质作用，提示其抑制MC增殖的作用机理，可能与抑制MC自分泌TNF-α等有关。
3 讨 论
3.1 MC增殖与肾功能的关系 MC作为肾小球固有细胞，它的生理 、病理作用近年来受到重视，研究发现MC具有吞噬、收缩、分泌胶原及一些活性物质，参与 免疫调节等功能。在病理状态下，肾小球MC增生肥大，早期是肾小球高滤过，高灌注代偿阶 段，后期则致肾小球毛细血管阻塞、萎缩、单个肾小球滤过率降低，出现功能性肾单位进一 步减少以及剩余功能性肾小球的进一步代偿，最终导致肾小球硬化，肾功能丧失[3] 。因此，若能抑制MC异常增生，有利于减缓慢性肾衰的发展，防止肾功能恶化。
3.2 SSOL抑制MC增殖的作用 本实验证明，SSOL有明显 抑制体外肾小球MC生长，同时还能抑制MC增殖作用，效果优于对照组(P<0.01)，而且呈 剂量依赖性。MTT法读数的高低不仅与细胞数量有关，其与细胞的活性(尤其是线粒体酶的活 性)亦密切相关[4]，说明SSOL不仅对MC增殖有抑制作用，其对MC代谢活性也有一 定抑制作用。进一步证明该药可以减轻或延缓肾小球系膜病变的发生和发展。这为临床应用 SSOL治疗以MC增殖为主要病变的肾小球疾病和慢性肾衰提供了理论依据。
3.3 SSOL有拮抗TNF-α的作用 肾小球MC增殖及系膜基 质增加是各种类型进行性肾小球疾病的共同病理过程。研究发现一些细胞因子和生长因子在 肾小球 继发性病理发展过程中起关键作用，这些活性物质(如TNF-α和IL-1,6等)作用于MC，使之 肥大，增殖或使MC合成、分泌细胞外基质的代谢加强，加速病变进展[5]。该制剂 中大黄、川芎、丹参、黄芪等中药，具有抑制MC增殖作用。大黄、川芎不仅改善系膜增殖性 肾炎大鼠系膜及基质的堆积，还能抑制MC分泌IL-1,6的作用[6，7]。丹参能抑 制人肾成纤维细胞生长和促其凋亡，降低MC分泌细胞因子作用[8]。黄芪、冬虫夏 草有调节免疫功能，阻抑肾病发展的作用。方中诸药合用，发挥其综合治疗作用。本试验表 明，SSOL能明显降低大鼠肾小球MC培养上清中TNF-α活性物质，认为其抑制MC增殖的机理 ，可能与其拮抗MC自分泌或旁分泌细胞因子，调节细胞因子网络平衡，中和肿瘤坏死因子等 细胞因子，所触发的细胞反应以及防止细胞因子引起的组织损伤，从而发挥其阻止系膜增殖 、硬化的作用有关。
(本实验得到本院宋长锁等老师、上海长征医院肾内科梅长林老师的大力支持和帮助 ，在此表示衷心感谢!)
参考文献
1.Coffey AK,Karnovsky MJ.Heparin inhibits mesangial cell prol iferation in habll venom induced glomerular injury[J].Am J Pathol, 1985;120(2) ∶248
2.张明，郭慕依.肝素对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响[J].中华医学杂志，1 995；75(5)∶273
3.邹万忠.肾脏疾病进行性损伤的病理机制[J].肾脏病与透析肾移植杂志，199 2；1(1)∶115
4.Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial:app l ication to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Method s,1983;65(1)∶55
5.江黎明.细胞因子、生长因子与肾小球硬化[J].国外医学.泌尿系统分册 .1995；15(3)∶130
6.魏建冬，黎磊石，姚建等.大黄治疗大鼠系膜增殖性肾炎的实验研究[J].中 华内科杂志，1997；36(2)∶87
7.孙林，易著文，虞佩兰.川芎嗪对人胎肾小球系膜细胞增殖的影响及其机理探讨 [J].中西医结合杂志，1995；15(3)∶134
8.张国强，叶任高，孔庆瑜等.丹参对培养中狼疮性肾炎成纤维细胞的影响[J] .中国医药学报，1997；12(1)∶19
(1999-04-28收稿 1999-07-05修回)
作者：周清发 刘静 席春生
单位：(西安医科大学第二临床医学院中医科 西安 710004)
关键词：系膜细胞；增殖；肾衰口服液；实验研究
西安医科大学学报000110摘要 为探讨肾衰口服液(SSOL)的作用机理，采用细胞培 养与细胞分子学技术相结合方法，在大鼠肾小球系膜细胞培养体系中加入该药，研究其对系 膜细胞(Mesangial cell,MC)增殖和肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响。结果： SSOL加入MC培养体系6d后，MC数(活细胞个数)为46700±3819，明显低于对照组147500±139 19(P<0.01)；该药抑制MC增殖作用亦较对照组显著(P<0.01)。MC上清液中TNF-α 含量对照组为(8.98±1.11)mg/L，治疗组(1.64±0.57)mg/L，有非常显著性差异(P <0.01)。提示SSOL对肾小球MC增殖有明显抑制作用。
中图分类号 R289.5，R364.3+3 文献标识码 A
文章编号 0258-065 9(2000)01-0026-02
Effect of shenshuai oral liquid on the proliferation of glomerularme s angial cell Zhou Qingfa,Liu Jing ,Xi Chunsheng
(De partment of Traditional Chinese Medicine, Second Affiliated Hospital,Xi′an Medical Universi ty, Xi′an 710004,China)
ABSTRACT To investigate the effect and mechanism of SSOL on th e proliferation of glomerular mesangial cell, by means of molecular biological t e chnique in connection with cell culture technique, added SSOL into the culture s y stem, then observed the effect of SSOL on Mcs proliferation and the secretion of TNF-α from MC.After 6d of culturing, the amount of alive Mcs of SSOL group wa s 46700±3819,markedly lower than that of control group 147500±13919(P<0.01 ).T he inhibition to Mcs proliferation of SSOL group was significantly higher than t hat of control group(P<0.01),the function was in dose-dependence.TNF-α le vels in supernate of SSOL group and control group were respectively as follows:1 .64±0.57,8.98±1.11(P<0.01).SSOL can significantly inhibit the proliferatio n of MC.
KEY WORDS mesangial cell(MC) proliferation shenshuai oral liqu id (SOOL) experimental research
肾小球系膜细胞(Mesangial cell, MC)过度增生、系膜基质增加是肾小球疾病的基本病变， 也是导致肾小球硬化的重要因素。如何防止系膜病变的发生、发展是肾小球疾病研究的重要 课题，目前主要集中在抗凝药物及细胞因子拮抗因素的研究[1，2]，尚未得到临 床推广应用。中医药在此方面研究相对较少，临床行之有效的中药复方对MC增殖的影响尚待 进一步探讨。本研究采用大鼠肾小球MC培养方法与细胞分子学技术相结合，观察肾衰口服液 (shen shuai oral liquid, SSOL)对肾小球MC生长、增殖和肿瘤TNF-α的影响，在细胞因 子水平，探讨其治疗慢性肾功能衰竭(Chronic renal failure, CRF)的作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验材料 药物：SSOL(由黄芪、大黄、附子、冬虫夏草、 丹参、川芎、牡蛎等组成方剂)具有温补脾肾、益气活血、祛毒降浊之功效。主要用于 治疗 各种原因引起的慢性肾功能衰竭。由第二临床医学院制剂室制备，含生药1.5kg/L。实验细 胞：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠肾小球MC(第5代)，由上海第二军医大学长征医院肾 内科提供。试剂：RPMI1640培养基，华美生物技术公司；噻唑蓝(MTT)华美生物技术公司； 胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物技术公司；胰蛋白酶，Difco公司产品；TNF-α放射免疫 分析药盒，北京东亚免疫技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)，院中心实验室提供。仪器：18 25 TCCO2孵育箱，谢尔 登国际有限公司产品：DG-3022A型酶联免疫检测仪 ，南京华东有限 公司产品；XSZ-D倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品；KYKY-1000型相差显微镜，中科院 科学仪器厂产品；24孔、96孔细胞培养板，Corning公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 活细胞计数 将培养的MC用胰蛋白酶消化后，按 104个/ml接种在24孔培养板上(0.2ml/孔)，待细胞贴壁后，用含0.4%FBS的培养液使细 胞生长同期静止(G0期)72h，分两组换液，治疗组12孔换20%FBS培养液+SSOL(浓度为35μ g/ml)；对照组12孔仅换20%FBS培养液，不加任何药物，作为对照。培养后第2、4、6、8天 ，各组每次取3孔，经台盼蓝染色，计MC活性细胞数。
1.2.2 MC增殖测定 采用MTT法。将MC接种于96孔培养 板生长至亚融合状态后，用含0.4%FBS的培养液使其静止72h，分组更换培养液，对照组 仍用20% FBS的正常培养液；治疗组分为4个亚组，分别将SSOL对倍稀释(1∶1，1∶2，1∶4 ，1∶8)，即35.00、17.50、8.75、4.38μg/ml(每种浓度设3个孔)。培养6d后，每孔加 入5g/L MTT原液20ml，继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各 孔吸光值(OD值)。
1.2.3 TNF-α活性测定 液相竞争法，按试剂盒说明 操作。按上述方法在24孔板使MC同步于G0期，分为两组(各组n=4)，治疗组用SSOL 3 5.0 0μg/ml+培养液，对照组不加任何药物，仅用培养液，两组细胞同时培养6d后，收集各组MC 上清检测TNF-α含量。
1.2.4 统计学处理 所有数据均按均数±标准差(
±s)表示，采用方差分析及q检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异 非常显著。2 结 果
2.1 SSOL对肾小球MC生长的影响 比较两组第2、4d MC台盼蓝 染色细胞计数，无统计学差异(P>0.05)。第6d治疗组MC活细胞个数为46700±3819， 对照 组为147500±13919，两组比较，有非常显著性差异(P<0.01)。说明SSOL有抑制MC生长 作用。
2.2 SSOL对肾小球MC增殖的影响 从附表可以看出，SSO L不同浓度组其吸光度值均明显低于对照组(P<0.01)。说明SSOL对MC增殖有抑制作用， 并且这种抑制作用随药物浓度升高而增强。
附表 两组细胞OD值的比较 (
±s) 组别n
稀 释 度
1∶1
1∶2
1∶4
1∶8
治疗组
3
0.017±0.0006*
0.0 23±0.012*
0.027±0.012*
0.030±0.017*
对照组
3
0.143±0.021
0.237±0.031
0.363±0.065
0.417±0.049)
*与对照组比较P<0.01
2.3 肾小球MC上清中TNF-α活性含量分析 通过取MC上清检测结果，治疗组为(1.64±0.57)mg/L；对照组为(8.98±1.11)mg /L，对照组TNF-α含量显著高于治疗组(P<0.01)。说明SSOL有拮抗MC分泌TNF-α活性 物质作用，提示其抑制MC增殖的作用机理，可能与抑制MC自分泌TNF-α等有关。
3 讨 论
3.1 MC增殖与肾功能的关系 MC作为肾小球固有细胞，它的生理 、病理作用近年来受到重视，研究发现MC具有吞噬、收缩、分泌胶原及一些活性物质，参与 免疫调节等功能。在病理状态下，肾小球MC增生肥大，早期是肾小球高滤过，高灌注代偿阶 段，后期则致肾小球毛细血管阻塞、萎缩、单个肾小球滤过率降低，出现功能性肾单位进一 步减少以及剩余功能性肾小球的进一步代偿，最终导致肾小球硬化，肾功能丧失[3] 。因此，若能抑制MC异常增生，有利于减缓慢性肾衰的发展，防止肾功能恶化。
3.2 SSOL抑制MC增殖的作用 本实验证明，SSOL有明显 抑制体外肾小球MC生长，同时还能抑制MC增殖作用，效果优于对照组(P<0.01)，而且呈 剂量依赖性。MTT法读数的高低不仅与细胞数量有关，其与细胞的活性(尤其是线粒体酶的活 性)亦密切相关[4]，说明SSOL不仅对MC增殖有抑制作用，其对MC代谢活性也有一 定抑制作用。进一步证明该药可以减轻或延缓肾小球系膜病变的发生和发展。这为临床应用 SSOL治疗以MC增殖为主要病变的肾小球疾病和慢性肾衰提供了理论依据。
3.3 SSOL有拮抗TNF-α的作用 肾小球MC增殖及系膜基 质增加是各种类型进行性肾小球疾病的共同病理过程。研究发现一些细胞因子和生长因子在 肾小球 继发性病理发展过程中起关键作用，这些活性物质(如TNF-α和IL-1,6等)作用于MC，使之 肥大，增殖或使MC合成、分泌细胞外基质的代谢加强，加速病变进展[5]。该制剂 中大黄、川芎、丹参、黄芪等中药，具有抑制MC增殖作用。大黄、川芎不仅改善系膜增殖性 肾炎大鼠系膜及基质的堆积，还能抑制MC分泌IL-1,6的作用[6，7]。丹参能抑 制人肾成纤维细胞生长和促其凋亡，降低MC分泌细胞因子作用[8]。黄芪、冬虫夏 草有调节免疫功能，阻抑肾病发展的作用。方中诸药合用，发挥其综合治疗作用。本试验表 明，SSOL能明显降低大鼠肾小球MC培养上清中TNF-α活性物质，认为其抑制MC增殖的机理 ，可能与其拮抗MC自分泌或旁分泌细胞因子，调节细胞因子网络平衡，中和肿瘤坏死因子等 细胞因子，所触发的细胞反应以及防止细胞因子引起的组织损伤，从而发挥其阻止系膜增殖 、硬化的作用有关。
(本实验得到本院宋长锁等老师、上海长征医院肾内科梅长林老师的大力支持和帮助 ，在此表示衷心感谢!)
参考文献
1.Coffey AK,Karnovsky MJ.Heparin inhibits mesangial cell prol iferation in habll venom induced glomerular injury[J].Am J Pathol, 1985;120(2) ∶248
2.张明，郭慕依.肝素对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响[J].中华医学杂志，1 995；75(5)∶273
3.邹万忠.肾脏疾病进行性损伤的病理机制[J].肾脏病与透析肾移植杂志，199 2；1(1)∶115
4.Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial:app l ication to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Method s,1983;65(1)∶55
5.江黎明.细胞因子、生长因子与肾小球硬化[J].国外医学.泌尿系统分册 .1995；15(3)∶130
6.魏建冬，黎磊石，姚建等.大黄治疗大鼠系膜增殖性肾炎的实验研究[J].中 华内科杂志，1997；36(2)∶87
7.孙林，易著文，虞佩兰.川芎嗪对人胎肾小球系膜细胞增殖的影响及其机理探讨 [J].中西医结合杂志，1995；15(3)∶134
8.张国强，叶任高，孔庆瑜等.丹参对培养中狼疮性肾炎成纤维细胞的影响[J] .中国医药学报，1997；12(1)∶19
(1999-04-28收稿 1999-07-05修回)
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