去甲万古霉素载药涤纶血管材料体外抗菌活性测定
【摘要】目的:评价去甲万古霉素(NV)载药涤纶血管材料体外抗菌活性。方法:血管材料剪成直径6mm圆形,分别制成空白涤纶材料和载药(NV)涤纶材料,分别于0,7,14,28d取样观察体外缓释性能。选用耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为试验菌,分别观察空白和载药涤纶血管材料0,7,14,28d和快慢相的抗菌效果。结果:两种细菌0,7,14,28d载药涤纶材料细菌混合培养液的菌落数显著少于空白涤纶材料细菌混合培养液(P均<0.001)。结论:体外试验证实载NV涤纶材料MRSE和MRSA具有抗菌作用,且可持续维持28d,提示该载药材料具有持久抗菌活性,可用于制备抗感染血管移植物。
【关键词】涤纶血管材料·去甲万古霉素·体外抗菌活性
Measurement of in vitro antibacterial activity of norvancomycinbonded Dacron prostheses
YU Weiping,JING Zaiping,BAO Junmin,ZHAO Zhiqing,ZHAO Jun,FENG Xiang,LU Qingsheng
Department of Vascular Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical Universtiy(Shanghai 200433,China)
【ABSTRACT】Objective:To evaluate in vitro antibacterial activity of norvancomycinbonded Dacron prostheses.Methods:With the use of methicillinresistant S.epidermidis(MRSE) and methicillinresistant S.aureus (MRSA) as test organisms,culture of the mixture of a piece of 6mmdiameter round prostheses (after soaking and shaking in PBS for 0,7,14 and 28 days),10ml broth containing 0.5ml bacterial suspension was performed to assess the quantity of bacteria grown,the colonyforming units (CFU) of staphylococcus were then platecounted after culturing.Statistical analysis was completed using the paired ttest.Results:Norvancomycinbonded Dacron prostheses produced significantly lower colony counts compared with unprotected Dacron prostheses for the two staphylococcus at 0,7,14 and 28 days.Conclusion:Norvancomycinbonded Dacron prostheses exhibits persistent in vitro antibacterial activity against the two bacteria for up to 28 days.These results suggeste the norvancomycinbonded Dacron prostheses as the promising infectionresistant vascular graft.
【KEY WORDS】Norvancomycin·Dacron prostheses·In vitro antibacterial activity
我们将去甲万古霉素(NV)制备成缓释微球后固载至涤纶血管材料表面研制成抗感染血管移植物材料,并已通过体外释放实验证实了该载药血管材料具有良好的药物缓释性能,可持续释药20d以上[1]。但在制备载药血管材料的过程中,经过了多步骤的化学处理,NV虽然能从血管材料释放,但其理化性能是否发生改变,抗菌作用是否受到影响,是否仍然具有抗菌活性还有待于进一步考察。本实验模拟生理条件实现载药血管材料的药物释放,将其浸泡于PBS中振荡不同时间后取出,选用对NV敏感的MRSE和MRSA作为试验菌进行体外抗菌试验,以确立该载药血管材料的应用前景。
1 材料和方法
1.1 涤纶血管材料
选用空白涤纶材料为对照组,载药涤纶材料为实验组。将上述两种血管材料剪成圆形,直径6mm。每12片装1包,密封后以环氧乙烷消毒,置于干燥处备用。载药材料按单位面积载药量(NV)计算,每片载药量(NV)平均为(0.1479±0.004)g。
1.2 培养基
上海伊华医学科技有限公司生产的营养肉汤培养基和血平板培养基。
1.3 菌种
表皮葡萄球菌9070(丙押氧西林表皮葡萄球菌,MRSE)和金黄色葡萄球菌9047(鬲押氧西林金黄色葡萄球菌,MRSA),均由第二军医大学长海医院微生物实验室提供。两者均为临床分离的甲氧西林耐药菌株。
1.4 菌液的制备
实验前30min配制含MRSE或MRSA的细菌悬液,用分光光度滴定法将细菌浓度调至2×107CUF/ml,制备成标准的细菌悬液。
1.5 试验分组
空白血管材料和载药血管材料分别加入10ml的PBS(pH 7.4)中,置37℃水浴摇床100r/min振荡,分别于0,7,14,28d取样进行试验。试验每组包括6片血管材料,每天又分4组,分别为:空白材料+MRSE,载药材料+MRSE,空白材料+MRSA,载药材料+MRSA。
1.6 试验步骤
1.6.1 血管材料混合液
将实验组血管绦纶材料每片移植物分别置于盛有含0.5ml标准菌液和9.5ml肉汤培养基的试管中,摇匀,置37℃温箱培养48h取出。
1.6.2 肉眼观察
管内培养物清晰者,表示试管所含的血管材料能抑制细菌生长,混浊者则表明不能抑制细菌生长。
1.6.3 细菌总数测定
(1)以无菌方法吸取0.1ml上述充分混匀的移植物培养液,注入盛有1ml无菌水的试管中,混匀成10-1的稀释液。(2)吸取10-1的稀释液0.1ml注入盛有1ml无菌水的试管中,混匀成10-2稀释液。按同法依次10倍递增稀释成10-3、10-4、10-5……等稀释适度的稀释液备用。(3)用吸管从每个稀释液内吸取0.1ml均匀接种于血平板,每个稀释度两个平板。(4)将血平板置于37℃温箱中培养48h后取出,计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,得每个试管生长细菌总数,再求出每毫升培养液生长细菌数。
1.6.4 菌落计数方法
先进行肉眼观察,用记数器计算平板内菌落数目,然后再用放大镜检查有无遗漏的微小菌落。在记下各平板的菌落数目后,求出同一稀释度的各平板平均菌落数。
1.6.5 菌落计数结果判断
(1)1个稀释度两个平板,选取菌落30~300的平板作为菌落总数测定标准。(2)当只有1个稀释度的菌落数在此计数范围内时,按该稀释液的稀释倍数计算平均菌落数。(3)当有两个稀释度的菌落数均符合此范围时,先计算每个稀释液的平均菌落数,再求出两个稀释液的平均菌落数。
1.7 统计学分析
细菌培养菌落数以x±s表示,采用t检验,P<0.05表明差异有统计学意义。用SAS统计分析系统完成处理过程。
2 结果
2.1 血管材料对MRSE抗菌作用
两组材料的抗菌作用见表1。两个时相载药移植物的抗菌效果比较,处于快相的0和7d两者差异无统计学意义(P=0.2154),处于慢相的14d抗菌效果优于28d(P=1.36265×10-5),快相阶段抗菌效果显著优于慢相阶段(0与14d比较P=0.00068,0与28d比较P=1.36×10-5,7与14d比较P=0.000712,7与28d比较P=1.36×10-5)。表1 空白和载药血管材料对MRSE抗菌效果比较(略)
2.2 血管材料对MRSA抗菌作用
载药涤纶材料与空白涤纶材料的抗菌作用比较见表2。两个时相载药移植物的抗菌效果比较,处于快相0d的抗菌效果优于7d(P=0.004571),处于慢相的14和28d差别无统计学意义(P=0.13067),快相阶段抗菌效果显著优于慢相阶段(0与14d比较P=1.51×10-5,0与28d比较P=1.30×10-5,7与14d比较P=1.51×10-5,7与28d比较P=1.30×10-5)。表2 空白和载药血管材料对MRSA抗菌效果比较(略)
3 讨论
金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌分别是早期和后期血管移植物感染的最常见致病菌[2],近年来,各种病原菌对抗生素的耐药日益严重,具有多重耐药的MRSA和MRSE已成为血管移植物感染的主要致病菌[35]。
去甲万古霉素是一种糖肽类抗生素。国内由放线菌万23号所得的产品主要含N去甲基万古霉素,称为去甲万古霉素,去甲万古霉素的效价高于万古霉素。其作用机制是抑制细菌细胞壁糖肽聚合物的合成,从而妨碍细胞壁的形成。它对化脓性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等有强力的抗菌作用。该药结构特殊,与其他抗生素无交叉耐药性,它对多重耐药的MRSA和MRSE也同样具有良好的抗菌效果,是目前治疗耐甲氧西林葡萄球菌感染的首选药物,目前在国内尚未有耐万古霉素葡萄球菌的报道。
我们选用去甲万古霉素作为涤纶血管移植物材料载药的抗生素,将其制备成缓释微球并固载至血管材料,研制成抗生素载药涤纶血管材料,体外释放实验已证实了该载药血管材料具有良好的缓释性能。
本体外抗菌试验通过模拟生理条件,将血管材料水浴释放不同时间后取出,并选用临床导致血管移植物感染的上述两种最常见的致病菌为试验菌进行体外抗菌试验,验证了该载药移植物抗菌作用的效果。研究发现,该载药涤纶血管材料对MRSE和MRSA两种葡萄球菌均具有抗菌作用,抗菌活性持续达28d,其中药物释放的快相阶段(0和7d)抗菌作用更显著,表明该载药血管材料的抗菌活性与药物释放的速度呈正相关。本试验结果证明,该载药涤纶材料具有持久的抗菌活性。
参 考 文 献
[1]余维平,景在平,包俊敏,等.载药涤纶血管材料去甲万古霉素含量和体外释药量测定方法[J].中国现代普通外科进展,8(2):82
[2]Phaneuf MD,Ozaki CK,Bide MJ,et al.Application of the quinolone antibiotic ciprofloxacin to Dacron utilizing texitile dyeing technology[J].J Biomed Mater Res,1993,27:233237.
[3]Naylor AR,Hayes PD,Darke S.A prospective audit of complex wound and graft infections in Great Britain and Ireland:the emergence of MRSA[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2001,21:289294.
[4]Murphy GJ,Pararajasingam R,Nasim A,et al.Methicillinresistant Staphylococcus aureus infection in vascular surgical patients[J].Ann R Coll Surg Engl,2001,83:158163.
[5]Earnshaw JJ.Methicillinresistant Staphylococcus aureus:vascular surgeons should fight back[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2002,24:283286.
[基金项目]军队杰出人才基金项目(98J005),上海市卫生系统“百人计划”资助项目(97BR047)
余维平,等.去甲万古霉素载药涤纶血管材料体外抗菌活性测定
第二军医大学附属长海医院血管外科(上海 200433)
(收稿日期 20050324), http://www.100md.com(余维平 景在平 包俊敏 赵志青 赵珺 冯翔 陆清声)
【关键词】涤纶血管材料·去甲万古霉素·体外抗菌活性
Measurement of in vitro antibacterial activity of norvancomycinbonded Dacron prostheses
YU Weiping,JING Zaiping,BAO Junmin,ZHAO Zhiqing,ZHAO Jun,FENG Xiang,LU Qingsheng
Department of Vascular Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical Universtiy(Shanghai 200433,China)
【ABSTRACT】Objective:To evaluate in vitro antibacterial activity of norvancomycinbonded Dacron prostheses.Methods:With the use of methicillinresistant S.epidermidis(MRSE) and methicillinresistant S.aureus (MRSA) as test organisms,culture of the mixture of a piece of 6mmdiameter round prostheses (after soaking and shaking in PBS for 0,7,14 and 28 days),10ml broth containing 0.5ml bacterial suspension was performed to assess the quantity of bacteria grown,the colonyforming units (CFU) of staphylococcus were then platecounted after culturing.Statistical analysis was completed using the paired ttest.Results:Norvancomycinbonded Dacron prostheses produced significantly lower colony counts compared with unprotected Dacron prostheses for the two staphylococcus at 0,7,14 and 28 days.Conclusion:Norvancomycinbonded Dacron prostheses exhibits persistent in vitro antibacterial activity against the two bacteria for up to 28 days.These results suggeste the norvancomycinbonded Dacron prostheses as the promising infectionresistant vascular graft.
【KEY WORDS】Norvancomycin·Dacron prostheses·In vitro antibacterial activity
我们将去甲万古霉素(NV)制备成缓释微球后固载至涤纶血管材料表面研制成抗感染血管移植物材料,并已通过体外释放实验证实了该载药血管材料具有良好的药物缓释性能,可持续释药20d以上[1]。但在制备载药血管材料的过程中,经过了多步骤的化学处理,NV虽然能从血管材料释放,但其理化性能是否发生改变,抗菌作用是否受到影响,是否仍然具有抗菌活性还有待于进一步考察。本实验模拟生理条件实现载药血管材料的药物释放,将其浸泡于PBS中振荡不同时间后取出,选用对NV敏感的MRSE和MRSA作为试验菌进行体外抗菌试验,以确立该载药血管材料的应用前景。
1 材料和方法
1.1 涤纶血管材料
选用空白涤纶材料为对照组,载药涤纶材料为实验组。将上述两种血管材料剪成圆形,直径6mm。每12片装1包,密封后以环氧乙烷消毒,置于干燥处备用。载药材料按单位面积载药量(NV)计算,每片载药量(NV)平均为(0.1479±0.004)g。
1.2 培养基
上海伊华医学科技有限公司生产的营养肉汤培养基和血平板培养基。
1.3 菌种
表皮葡萄球菌9070(丙押氧西林表皮葡萄球菌,MRSE)和金黄色葡萄球菌9047(鬲押氧西林金黄色葡萄球菌,MRSA),均由第二军医大学长海医院微生物实验室提供。两者均为临床分离的甲氧西林耐药菌株。
1.4 菌液的制备
实验前30min配制含MRSE或MRSA的细菌悬液,用分光光度滴定法将细菌浓度调至2×107CUF/ml,制备成标准的细菌悬液。
1.5 试验分组
空白血管材料和载药血管材料分别加入10ml的PBS(pH 7.4)中,置37℃水浴摇床100r/min振荡,分别于0,7,14,28d取样进行试验。试验每组包括6片血管材料,每天又分4组,分别为:空白材料+MRSE,载药材料+MRSE,空白材料+MRSA,载药材料+MRSA。
1.6 试验步骤
1.6.1 血管材料混合液
将实验组血管绦纶材料每片移植物分别置于盛有含0.5ml标准菌液和9.5ml肉汤培养基的试管中,摇匀,置37℃温箱培养48h取出。
1.6.2 肉眼观察
管内培养物清晰者,表示试管所含的血管材料能抑制细菌生长,混浊者则表明不能抑制细菌生长。
1.6.3 细菌总数测定
(1)以无菌方法吸取0.1ml上述充分混匀的移植物培养液,注入盛有1ml无菌水的试管中,混匀成10-1的稀释液。(2)吸取10-1的稀释液0.1ml注入盛有1ml无菌水的试管中,混匀成10-2稀释液。按同法依次10倍递增稀释成10-3、10-4、10-5……等稀释适度的稀释液备用。(3)用吸管从每个稀释液内吸取0.1ml均匀接种于血平板,每个稀释度两个平板。(4)将血平板置于37℃温箱中培养48h后取出,计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,得每个试管生长细菌总数,再求出每毫升培养液生长细菌数。
1.6.4 菌落计数方法
先进行肉眼观察,用记数器计算平板内菌落数目,然后再用放大镜检查有无遗漏的微小菌落。在记下各平板的菌落数目后,求出同一稀释度的各平板平均菌落数。
1.6.5 菌落计数结果判断
(1)1个稀释度两个平板,选取菌落30~300的平板作为菌落总数测定标准。(2)当只有1个稀释度的菌落数在此计数范围内时,按该稀释液的稀释倍数计算平均菌落数。(3)当有两个稀释度的菌落数均符合此范围时,先计算每个稀释液的平均菌落数,再求出两个稀释液的平均菌落数。
1.7 统计学分析
细菌培养菌落数以x±s表示,采用t检验,P<0.05表明差异有统计学意义。用SAS统计分析系统完成处理过程。
2 结果
2.1 血管材料对MRSE抗菌作用
两组材料的抗菌作用见表1。两个时相载药移植物的抗菌效果比较,处于快相的0和7d两者差异无统计学意义(P=0.2154),处于慢相的14d抗菌效果优于28d(P=1.36265×10-5),快相阶段抗菌效果显著优于慢相阶段(0与14d比较P=0.00068,0与28d比较P=1.36×10-5,7与14d比较P=0.000712,7与28d比较P=1.36×10-5)。表1 空白和载药血管材料对MRSE抗菌效果比较(略)
2.2 血管材料对MRSA抗菌作用
载药涤纶材料与空白涤纶材料的抗菌作用比较见表2。两个时相载药移植物的抗菌效果比较,处于快相0d的抗菌效果优于7d(P=0.004571),处于慢相的14和28d差别无统计学意义(P=0.13067),快相阶段抗菌效果显著优于慢相阶段(0与14d比较P=1.51×10-5,0与28d比较P=1.30×10-5,7与14d比较P=1.51×10-5,7与28d比较P=1.30×10-5)。表2 空白和载药血管材料对MRSA抗菌效果比较(略)
3 讨论
金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌分别是早期和后期血管移植物感染的最常见致病菌[2],近年来,各种病原菌对抗生素的耐药日益严重,具有多重耐药的MRSA和MRSE已成为血管移植物感染的主要致病菌[35]。
去甲万古霉素是一种糖肽类抗生素。国内由放线菌万23号所得的产品主要含N去甲基万古霉素,称为去甲万古霉素,去甲万古霉素的效价高于万古霉素。其作用机制是抑制细菌细胞壁糖肽聚合物的合成,从而妨碍细胞壁的形成。它对化脓性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等有强力的抗菌作用。该药结构特殊,与其他抗生素无交叉耐药性,它对多重耐药的MRSA和MRSE也同样具有良好的抗菌效果,是目前治疗耐甲氧西林葡萄球菌感染的首选药物,目前在国内尚未有耐万古霉素葡萄球菌的报道。
我们选用去甲万古霉素作为涤纶血管移植物材料载药的抗生素,将其制备成缓释微球并固载至血管材料,研制成抗生素载药涤纶血管材料,体外释放实验已证实了该载药血管材料具有良好的缓释性能。
本体外抗菌试验通过模拟生理条件,将血管材料水浴释放不同时间后取出,并选用临床导致血管移植物感染的上述两种最常见的致病菌为试验菌进行体外抗菌试验,验证了该载药移植物抗菌作用的效果。研究发现,该载药涤纶血管材料对MRSE和MRSA两种葡萄球菌均具有抗菌作用,抗菌活性持续达28d,其中药物释放的快相阶段(0和7d)抗菌作用更显著,表明该载药血管材料的抗菌活性与药物释放的速度呈正相关。本试验结果证明,该载药涤纶材料具有持久的抗菌活性。
参 考 文 献
[1]余维平,景在平,包俊敏,等.载药涤纶血管材料去甲万古霉素含量和体外释药量测定方法[J].中国现代普通外科进展,8(2):82
[2]Phaneuf MD,Ozaki CK,Bide MJ,et al.Application of the quinolone antibiotic ciprofloxacin to Dacron utilizing texitile dyeing technology[J].J Biomed Mater Res,1993,27:233237.
[3]Naylor AR,Hayes PD,Darke S.A prospective audit of complex wound and graft infections in Great Britain and Ireland:the emergence of MRSA[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2001,21:289294.
[4]Murphy GJ,Pararajasingam R,Nasim A,et al.Methicillinresistant Staphylococcus aureus infection in vascular surgical patients[J].Ann R Coll Surg Engl,2001,83:158163.
[5]Earnshaw JJ.Methicillinresistant Staphylococcus aureus:vascular surgeons should fight back[J].Eur J Vasc Endovasc Surg,2002,24:283286.
[基金项目]军队杰出人才基金项目(98J005),上海市卫生系统“百人计划”资助项目(97BR047)
余维平,等.去甲万古霉素载药涤纶血管材料体外抗菌活性测定
第二军医大学附属长海医院血管外科(上海 200433)
(收稿日期 20050324), http://www.100md.com(余维平 景在平 包俊敏 赵志青 赵珺 冯翔 陆清声)