大鼠肝缺血/再灌注损伤时cfos、Bcl2在肝组织的表达及与肝细胞凋亡的关系
摘要: 目的： 观察大鼠肝缺血/再灌注损伤时cfos、Bcl2在肝组织中的表达及与肝细胞凋亡的关系，并探讨可能的机制。方法： 选健康雄性Wistar大鼠48只，随机分为对照组、缺血30 min组(I组)、 缺血30 min即刻再灌注组(I/R组)、缺血30 min再灌注1 h组(I/R 1 h组)、缺血30 min再灌注2 h组(I/R 2 h组)、缺血30 min再灌注后4 h组(I/R 4 h组)，每组8只。应用免疫组化法分别测定各组大鼠肝组织cfos、Bcl2的表达，应用原位细胞凋亡法测定肝细胞凋亡的情况，同时观察肝脏组织病理变化。结果： 肝脏I/R可出现肝细胞明显损伤、肝细胞水肿、炎性细胞浸润，甚至有细胞坏死。与对照组比较，cfos在I组表达就有增高﹙P<0.01)，I/R 4 h组达到高峰。I/R组与I组、I/R 4 h组与I/R 2 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)。肝组织Bcl2在I组表达增高(P<0.01)，I/R 2~4 h达到高峰。I/R 4 h组与I/R 2h组相比差异无统计学意义(P>0.01)。细胞凋亡指数：I组、I/R组与对照组比较明显增加(P<0.01)，随着时间的延长细胞凋亡指数逐渐增加。cfos与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.889, P<0.01)，Bcl2与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.901, P<0.01)。结论： 肝缺血/再灌注损伤可引起肝组织的损伤及肝细胞凋亡。肝细胞凋亡与cfos的表达有关。Bcl2在缺血期发挥了其抑凋亡作用，随着再灌注时间的延长，其抑凋亡作用减弱，肝细胞凋亡指数增加。
关键词： 肝缺血/再灌注损伤；细胞凋亡； cfos；Bcl2
The relation between the expression of cfos rotein and Bcl2 rotein in liver tissue and liver cell poptosis following liver schemiareperfusion injury in rats
WANG Lan， WANG Hongmei， ZHANG Jianlong， et al
(Department of Gastroenterology, Xinjiang Provincial People's Hospital, Urumqi 830001, China)
Abstract: Objective: To observe the changes of cfos protein and Bcl2 protein in liver tissue following liver ischemiareperfusion injury and evaluate the contribution of these two factors to liver cell apoptosis. Methods: A model of liver ischemiareperfusion injury was established by imitation. 48 healthy rats were randomly divided into 6 groups as following (n=8): the control group (the group of sham operation), simply ischemia 30 min without reperfusion (I group), reperfusion following ischemia 30 min (I/R group), 1 hr reperfusion following ischemia 30 min (I/R1 h group), 2 hrs reperfusion following ischemia 30 min (I/R2 h group) and 4 hrs reperfusion followingishcemia 30 min (I/R4 h group). Liver tissue were observed by HE staining. The expressions of cfos protein and Bcl2 protein in liver tissue were examined individually by immunohistochemical technique in each group. The changes of liver cell apoptosis were measured by TUNEL labelling technique. Results: Liver ischemia/reperfusion induced remarkable hepatic cell injury. The contents of cfos protein and Bcl2 protein increased in I group and reached to the peak in I/R4 h group. The index of apoptosis in liver cells showed increasing during different phase of liver ischemiareperfusion injury (P<0.01). Conclusion: The injury of liver tissue and liver cell apoptosis may be induced following the process of liver ischemia/reperfusion injury. cfos and Bcl2 showed increasing and may be involved into the mechanism of liver cell apoptosis. Bcl2 may play the role in antiliver cell apoptosis during the period of liver ischemiareperfusion.
Key words: liver ischemia/reperfusion injury； apoptosis; cfos; Bcl2
近年来，随着临床治疗技术的发展，肝缺血后重新得到再灌注，使损伤的结构得以修复。但在有些情况下，缺血肝组织在得到血流再灌注时，其功能结构出现了明显障碍，导致原有的缺血性损伤进一步加重或出现新的损伤，即缺血/再灌注损伤(ischemiareperfusion injury; I/RI)[1]。已有研究表明，细胞凋亡(Apoptosis)是肝I/R损伤中的重要病理特征，是细胞死亡的重要方式[2]。
cfos基因是即刻早期原癌基因的一种，Fos蛋白为其表达产物。正常情况下，cfos基因表达的浓度是极低的，它与细胞的生长分化增殖密切相关[3]。多种刺激可诱导其表达，损伤的刺激是多种诱发因素之一[4]。研究证实，Fos蛋白是细胞对缺血反应的敏感指标，在缺血再灌注后的cfos基因转录及Fos蛋白又可使多种晚期基因激活，进而发挥包括增殖、修复或凋亡的生理功能[5]。Bcl2基因家族编码的蛋白质在凋亡的调节中起着重要的作用。这个家族的成员能促进或抑制凋亡[6]。关于肝I/R损伤后肝组织cfos、Bcl2的表达及与肝细胞凋亡的关系，目前尚未见报道。本研究观察肝I/RI过程中细胞凋亡相关基因cfos、Bcl2在肝组织的表达，探讨其与肝细胞凋亡的关系，为临床从细胞凋亡的角度防治肝I/RI提供理论依据。
1材料与方法
1.1动物模型的复制与分组健康雄性Wistar大鼠48只(由新疆医科大学动物实验中心提供),体重200~250 g,随机分成6组：假手术组(对照组)、缺血30 min组(I组)、缺血30 min即刻再灌注组(I/R组)、缺血30 min再灌注1 h组(I/R 1 h组)、缺血30 min再灌注2 h组(I/R 2 h组)、缺血30 min再灌注4 h组(I/R 4 h组),每组8只。操作过程：实验前12 h禁食，1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，清洁大鼠，取上腹部正中切口进入腹腔，暴露肝门部；除对照组外，其它各组大鼠均用无创血管钳于肝门部钳夹，阻断肝动脉和门静脉，造成100%实质性肝缺血，持续30 min后去除血管钳，形成再灌注；分别按分组要求的时点随后立即处死动物取材。在缺血期间及再灌注后均关腹。手术过程全部无菌操作。
1.2仪器设备与试验试剂 (1)免疫组化SP试剂盒EliVisionTM(浓缩型,从北京中山生物技术有限公司购置)，cfos(RAB0187)、Bcl2(BAO412)免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。(2)细胞凋亡的检测：细胞凋亡原位检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, PCD)由德国Boethringer Marmheim (B.M)公司提供。
1.3取材方法各组动物均在处死后立即取肝右叶置于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片(片厚6 μm)，HE染色。
1.4肝组织cfos、Bcl2免疫组化染色按SP法免疫组化试剂盒染色步骤进行，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5肝细胞原位细胞凋亡检测方法采用DNA缺口原位末端标记(TDTmediated dUTP biotion nick ending labeling, TUNEL)染色检测肝细胞凋亡。具体操作步骤： (1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES处理。(2)石蜡包埋的切片常规脱蜡至水。(3)蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白，室温孵育20 min,PBS洗3次。(4) 加入3%H2O2 37℃孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性。(5) 加入TUNEL反应液，湿盒中37℃孵育60 min,PBS洗3次。(6) 加入辣根过氧化物酶抗体，孵育30 min,PBS洗3次。(6) 加入DAB溶液显色10 min。(7) 苏木素复染，常规脱水，透明、中性树胶封片。
1.6切片观察及结果判定cfos阳性表达为细胞核内呈现棕黄色颗粒,细胞核内呈现蓝色颗粒为阴性细胞。Bcl2阳性表达为细胞膜或细胞胞浆内呈现棕黄色颗粒，细胞膜或细胞胞浆内呈现蓝色颗粒为阴性细胞。采用计算机图像系统分析摄片，光镜下肝组织连续取6个高倍视野(目镜×40),计数视野阳性细胞率(阳性细胞/视野内整个细胞数)。凋亡指数以凋亡细胞/100个细胞表示。
1.7统计学处理实验数据以均数±标准差(±s)表示，各指标分组间比较，方差齐时应用方差分析及两两比较的q检验;方差不齐时，采用秩和检验；指标间相关性分析应用简单相关分析。所有数据均采用SPSS11.0统计软件包进行分析。检验水准α=0.05。
2结果
2.1肝组织cfos的表达变化cfos在肝组织中的表达I组和I/R组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，I/R 2 h、I/R 4 h组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组、I/R 2 h组和I/R 1 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 2 h组相比差异有统计学意义(P<0.01) (表1)。
2.2肝组织Bcl2的表达变化Bcl2在肝组织中的表达：I组和I/R组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，I/R 4 h、I/R 2 h组、I/R 1 h组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 1 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 2 h组、I/R 2 h组和I/R 1 h组相比差异无统计学意义(P>0.05) (表1)。
2.3肝细胞凋亡指数的变化I组肝细胞凋亡指数与对照组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；I/R与I组比较，差异有统计学意义(P<0.05)； I/R 4 h、I/R 2 h、I/R 1 h组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组、I/R 2 h组和I/R 1 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 2 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。
表1各组cfos 、Bcl2在肝组织的表达变化 (略)
表2各组肝细胞凋亡指数的变化 (略)
2.4各指标之间的相关性 cfos与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.889, P<0.01)，表明肝I/R损伤中肝细胞的凋亡可能与cfos基因的表达有关；Bcl2与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.901, P<0.01)。
2.5肝脏的HE染色切片观察对照组肝细胞形态正常，肝索排列整齐，肝血窦不扩张,肝组织中无中性粒细胞浸润。I组可见肝细胞轻度肿胀，肝组织结构基本完整，有少量散在的炎性细胞浸润；I/R 2 h组肝细胞明显肿胀，有的呈空泡状变性，肝血窦受压，但肝组织结构尚完整，此时炎性细胞在肝组织中大量散在分布；I/R 4 h组肝细胞呈气球样变，有点片状坏死区，肝血窦受压明显或不存在，肝界板破坏，炎性细胞在肝组织中聚集成团或大量散在分布，肝组织结构紊乱。
3讨论
肝脏遭受缺血/再灌注损伤时，组织受损不仅来自缺血/再灌注的直接作用，同时凋亡机制的启动与放大后造成的组织坏死同样也参与了肝组织的损伤过程[7]。导致肝细胞凋亡的细胞因子和受体结合后，通过细胞内信号转导引起肝细胞凋亡因子表达，同时还有各种抗凋亡因子表达，形成一种比较复杂的互相制约的网络。本实验从促凋亡与抑凋亡基因的表达着手，分析肝I/R过程中肝细胞凋亡的可能机制。
cfos是早期应答基因，其在细胞周期早期和生长相关步骤中起作用。Fos蛋白为其表达产物。正常情况下，cfos基因的表达是极低的。本实验的结果表明，在肝缺血期cfos蛋白的表达就明显增高，提示肝缺血后细胞凋亡受凋亡调控基因如cfos的调节。随着再灌注时间的延长，cfos蛋白的表达逐渐增高，且与细胞凋亡呈正相关(r=0.889，P<0.01)， 表明cfos表达的增高与细胞凋亡密切相关。Bcl2是抑凋亡基因，其抑凋亡机制非常复杂。近年来发现Bcl2对凋亡的作用是有选择性的，并非所有的凋亡均能被Bcl2抑制[8]。本实验结果显示，肝缺血期Bcl2蛋白的表达就有增高，随着再灌注时间的延长，Bcl2蛋白的表达在肝I/R 2~4 h达高峰。但升高的幅度明显低于cfos蛋白。Bcl2与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.901，P<0.01)，表明肝I/R过程中，随着细胞凋亡的增加，肝组织中Bcl2蛋白的表达逐渐升高，从而发挥抑凋亡作用。但由于再灌注后期，肝Kupffer细胞被大量激活，产生更多的氧自由基和细胞因子，以及钙超载机制直接损伤DNA，导致许多具有酶活性的蛋白质功能丧失，并且影响核基因的转录，使细胞膜脂质过氧化，从而影响信号转导途径，释放出大量促凋亡物质，如细胞色素C等，使Bcl2的抑凋亡作用难以发挥。
总之，随着对肝缺血/再灌注引起的细胞损伤分子机制研究的不断深入，从细胞凋亡的角度探索有效方法，必将为肝缺血/再灌注引起细胞损伤的防治提供新的思路。
参考文献:
[1]金惠铭.病理生理学[M].北京：人民卫生出版社，2001.150162.
[2]李绍强，梁力建.缺血预处理对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌中肝细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2002，18(1)：5558.
[3]王曦, 王百忍, 段晓莉. 正常生活状态下的大鼠中Fos的基础表达[J].神经解剖学杂志, 2000, 16(4):353358.
[4]Lü SY, Zhou SS, Zhu MZ, et al. Effect of anthracene9carboxylic acid on cfos expression in isolated rat heart[J]. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1999, 20:478481.
[5]Li Y, Wang TC, Gong WQ, et al. Effects of tetramethylpyr
azine on Fos protein expression of myocardial ischemia reperfusion in rats[J]. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1999, 20:515518.
[6]Selzner M, Rudiger HA, Selzner N. Transgenic mice overexpressing human Bcl2 are resistant to hepatic ichemia and reperfusion[J]. Hepatology,2002,36(2):218225.
[7]马毅，何晓顺，陈规划.肝脏缺血再灌注损伤与细胞凋亡[J].中国病理生理杂志，2003，19(7)：10051008.
[8]Ito T, Deng X, Carr B, et al. Bcl2 phosphorylation required for antiapoptosis function[J]. Biol Chem,1997,272(18):11671.
1新疆维吾尔自治区人民医院消化科；
2新疆医科大学基础医学院生理学教研室, 新疆乌鲁木齐830000, 百拇医药(王兰 王红梅 张建龙 孙湛)
关键词： 肝缺血/再灌注损伤；细胞凋亡； cfos；Bcl2
The relation between the expression of cfos rotein and Bcl2 rotein in liver tissue and liver cell poptosis following liver schemiareperfusion injury in rats
WANG Lan， WANG Hongmei， ZHANG Jianlong， et al
(Department of Gastroenterology, Xinjiang Provincial People's Hospital, Urumqi 830001, China)
Abstract: Objective: To observe the changes of cfos protein and Bcl2 protein in liver tissue following liver ischemiareperfusion injury and evaluate the contribution of these two factors to liver cell apoptosis. Methods: A model of liver ischemiareperfusion injury was established by imitation. 48 healthy rats were randomly divided into 6 groups as following (n=8): the control group (the group of sham operation), simply ischemia 30 min without reperfusion (I group), reperfusion following ischemia 30 min (I/R group), 1 hr reperfusion following ischemia 30 min (I/R1 h group), 2 hrs reperfusion following ischemia 30 min (I/R2 h group) and 4 hrs reperfusion followingishcemia 30 min (I/R4 h group). Liver tissue were observed by HE staining. The expressions of cfos protein and Bcl2 protein in liver tissue were examined individually by immunohistochemical technique in each group. The changes of liver cell apoptosis were measured by TUNEL labelling technique. Results: Liver ischemia/reperfusion induced remarkable hepatic cell injury. The contents of cfos protein and Bcl2 protein increased in I group and reached to the peak in I/R4 h group. The index of apoptosis in liver cells showed increasing during different phase of liver ischemiareperfusion injury (P<0.01). Conclusion: The injury of liver tissue and liver cell apoptosis may be induced following the process of liver ischemia/reperfusion injury. cfos and Bcl2 showed increasing and may be involved into the mechanism of liver cell apoptosis. Bcl2 may play the role in antiliver cell apoptosis during the period of liver ischemiareperfusion.
Key words: liver ischemia/reperfusion injury； apoptosis; cfos; Bcl2
近年来，随着临床治疗技术的发展，肝缺血后重新得到再灌注，使损伤的结构得以修复。但在有些情况下，缺血肝组织在得到血流再灌注时，其功能结构出现了明显障碍，导致原有的缺血性损伤进一步加重或出现新的损伤，即缺血/再灌注损伤(ischemiareperfusion injury; I/RI)[1]。已有研究表明，细胞凋亡(Apoptosis)是肝I/R损伤中的重要病理特征，是细胞死亡的重要方式[2]。
cfos基因是即刻早期原癌基因的一种，Fos蛋白为其表达产物。正常情况下，cfos基因表达的浓度是极低的，它与细胞的生长分化增殖密切相关[3]。多种刺激可诱导其表达，损伤的刺激是多种诱发因素之一[4]。研究证实，Fos蛋白是细胞对缺血反应的敏感指标，在缺血再灌注后的cfos基因转录及Fos蛋白又可使多种晚期基因激活，进而发挥包括增殖、修复或凋亡的生理功能[5]。Bcl2基因家族编码的蛋白质在凋亡的调节中起着重要的作用。这个家族的成员能促进或抑制凋亡[6]。关于肝I/R损伤后肝组织cfos、Bcl2的表达及与肝细胞凋亡的关系，目前尚未见报道。本研究观察肝I/RI过程中细胞凋亡相关基因cfos、Bcl2在肝组织的表达，探讨其与肝细胞凋亡的关系，为临床从细胞凋亡的角度防治肝I/RI提供理论依据。
1材料与方法
1.1动物模型的复制与分组健康雄性Wistar大鼠48只(由新疆医科大学动物实验中心提供),体重200~250 g,随机分成6组：假手术组(对照组)、缺血30 min组(I组)、缺血30 min即刻再灌注组(I/R组)、缺血30 min再灌注1 h组(I/R 1 h组)、缺血30 min再灌注2 h组(I/R 2 h组)、缺血30 min再灌注4 h组(I/R 4 h组),每组8只。操作过程：实验前12 h禁食，1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，清洁大鼠，取上腹部正中切口进入腹腔，暴露肝门部；除对照组外，其它各组大鼠均用无创血管钳于肝门部钳夹，阻断肝动脉和门静脉，造成100%实质性肝缺血，持续30 min后去除血管钳，形成再灌注；分别按分组要求的时点随后立即处死动物取材。在缺血期间及再灌注后均关腹。手术过程全部无菌操作。
1.2仪器设备与试验试剂 (1)免疫组化SP试剂盒EliVisionTM(浓缩型,从北京中山生物技术有限公司购置)，cfos(RAB0187)、Bcl2(BAO412)免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。(2)细胞凋亡的检测：细胞凋亡原位检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, PCD)由德国Boethringer Marmheim (B.M)公司提供。
1.3取材方法各组动物均在处死后立即取肝右叶置于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片(片厚6 μm)，HE染色。
1.4肝组织cfos、Bcl2免疫组化染色按SP法免疫组化试剂盒染色步骤进行，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5肝细胞原位细胞凋亡检测方法采用DNA缺口原位末端标记(TDTmediated dUTP biotion nick ending labeling, TUNEL)染色检测肝细胞凋亡。具体操作步骤： (1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES处理。(2)石蜡包埋的切片常规脱蜡至水。(3)蛋白酶K消化膜蛋白及核蛋白，室温孵育20 min,PBS洗3次。(4) 加入3%H2O2 37℃孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性。(5) 加入TUNEL反应液，湿盒中37℃孵育60 min,PBS洗3次。(6) 加入辣根过氧化物酶抗体，孵育30 min,PBS洗3次。(6) 加入DAB溶液显色10 min。(7) 苏木素复染，常规脱水，透明、中性树胶封片。
1.6切片观察及结果判定cfos阳性表达为细胞核内呈现棕黄色颗粒,细胞核内呈现蓝色颗粒为阴性细胞。Bcl2阳性表达为细胞膜或细胞胞浆内呈现棕黄色颗粒，细胞膜或细胞胞浆内呈现蓝色颗粒为阴性细胞。采用计算机图像系统分析摄片，光镜下肝组织连续取6个高倍视野(目镜×40),计数视野阳性细胞率(阳性细胞/视野内整个细胞数)。凋亡指数以凋亡细胞/100个细胞表示。
1.7统计学处理实验数据以均数±标准差(±s)表示，各指标分组间比较，方差齐时应用方差分析及两两比较的q检验;方差不齐时，采用秩和检验；指标间相关性分析应用简单相关分析。所有数据均采用SPSS11.0统计软件包进行分析。检验水准α=0.05。
2结果
2.1肝组织cfos的表达变化cfos在肝组织中的表达I组和I/R组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，I/R 2 h、I/R 4 h组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组、I/R 2 h组和I/R 1 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 2 h组相比差异有统计学意义(P<0.01) (表1)。
2.2肝组织Bcl2的表达变化Bcl2在肝组织中的表达：I组和I/R组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，I/R 4 h、I/R 2 h组、I/R 1 h组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 1 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 2 h组、I/R 2 h组和I/R 1 h组相比差异无统计学意义(P>0.05) (表1)。
2.3肝细胞凋亡指数的变化I组肝细胞凋亡指数与对照组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；I/R与I组比较，差异有统计学意义(P<0.05)； I/R 4 h、I/R 2 h、I/R 1 h组与I/R组比较差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组、I/R 2 h组和I/R 1 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)。I/R 4 h组和I/R 2 h组相比差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。
表1各组cfos 、Bcl2在肝组织的表达变化 (略)
表2各组肝细胞凋亡指数的变化 (略)
2.4各指标之间的相关性 cfos与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.889, P<0.01)，表明肝I/R损伤中肝细胞的凋亡可能与cfos基因的表达有关；Bcl2与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.901, P<0.01)。
2.5肝脏的HE染色切片观察对照组肝细胞形态正常，肝索排列整齐，肝血窦不扩张,肝组织中无中性粒细胞浸润。I组可见肝细胞轻度肿胀，肝组织结构基本完整，有少量散在的炎性细胞浸润；I/R 2 h组肝细胞明显肿胀，有的呈空泡状变性，肝血窦受压，但肝组织结构尚完整，此时炎性细胞在肝组织中大量散在分布；I/R 4 h组肝细胞呈气球样变，有点片状坏死区，肝血窦受压明显或不存在，肝界板破坏，炎性细胞在肝组织中聚集成团或大量散在分布，肝组织结构紊乱。
3讨论
肝脏遭受缺血/再灌注损伤时，组织受损不仅来自缺血/再灌注的直接作用，同时凋亡机制的启动与放大后造成的组织坏死同样也参与了肝组织的损伤过程[7]。导致肝细胞凋亡的细胞因子和受体结合后，通过细胞内信号转导引起肝细胞凋亡因子表达，同时还有各种抗凋亡因子表达，形成一种比较复杂的互相制约的网络。本实验从促凋亡与抑凋亡基因的表达着手，分析肝I/R过程中肝细胞凋亡的可能机制。
cfos是早期应答基因，其在细胞周期早期和生长相关步骤中起作用。Fos蛋白为其表达产物。正常情况下，cfos基因的表达是极低的。本实验的结果表明，在肝缺血期cfos蛋白的表达就明显增高，提示肝缺血后细胞凋亡受凋亡调控基因如cfos的调节。随着再灌注时间的延长，cfos蛋白的表达逐渐增高，且与细胞凋亡呈正相关(r=0.889，P<0.01)， 表明cfos表达的增高与细胞凋亡密切相关。Bcl2是抑凋亡基因，其抑凋亡机制非常复杂。近年来发现Bcl2对凋亡的作用是有选择性的，并非所有的凋亡均能被Bcl2抑制[8]。本实验结果显示，肝缺血期Bcl2蛋白的表达就有增高，随着再灌注时间的延长，Bcl2蛋白的表达在肝I/R 2~4 h达高峰。但升高的幅度明显低于cfos蛋白。Bcl2与细胞凋亡指数呈正相关(r=0.901，P<0.01)，表明肝I/R过程中，随着细胞凋亡的增加，肝组织中Bcl2蛋白的表达逐渐升高，从而发挥抑凋亡作用。但由于再灌注后期，肝Kupffer细胞被大量激活，产生更多的氧自由基和细胞因子，以及钙超载机制直接损伤DNA，导致许多具有酶活性的蛋白质功能丧失，并且影响核基因的转录，使细胞膜脂质过氧化，从而影响信号转导途径，释放出大量促凋亡物质，如细胞色素C等，使Bcl2的抑凋亡作用难以发挥。
总之，随着对肝缺血/再灌注引起的细胞损伤分子机制研究的不断深入，从细胞凋亡的角度探索有效方法，必将为肝缺血/再灌注引起细胞损伤的防治提供新的思路。
参考文献:
[1]金惠铭.病理生理学[M].北京：人民卫生出版社，2001.150162.
[2]李绍强，梁力建.缺血预处理对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌中肝细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2002，18(1)：5558.
[3]王曦, 王百忍, 段晓莉. 正常生活状态下的大鼠中Fos的基础表达[J].神经解剖学杂志, 2000, 16(4):353358.
[4]Lü SY, Zhou SS, Zhu MZ, et al. Effect of anthracene9carboxylic acid on cfos expression in isolated rat heart[J]. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1999, 20:478481.
[5]Li Y, Wang TC, Gong WQ, et al. Effects of tetramethylpyr
azine on Fos protein expression of myocardial ischemia reperfusion in rats[J]. Disi Junyi Daxue Xuebao, 1999, 20:515518.
[6]Selzner M, Rudiger HA, Selzner N. Transgenic mice overexpressing human Bcl2 are resistant to hepatic ichemia and reperfusion[J]. Hepatology,2002,36(2):218225.
[7]马毅，何晓顺，陈规划.肝脏缺血再灌注损伤与细胞凋亡[J].中国病理生理杂志，2003，19(7)：10051008.
[8]Ito T, Deng X, Carr B, et al. Bcl2 phosphorylation required for antiapoptosis function[J]. Biol Chem,1997,272(18):11671.
1新疆维吾尔自治区人民医院消化科；
2新疆医科大学基础医学院生理学教研室, 新疆乌鲁木齐830000, 百拇医药(王兰 王红梅 张建龙 孙湛)