喘消雾化液对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化模型SOD和MDA水平的影响
摘要: 目的: 观察喘消雾化液(CXW)对博莱霉素(BLM)诱导大鼠肺纤维化模型的影响，为肺纤维化的防治提供实验依据。方法: 90只雄性Wistar大鼠随机分为生理盐水(NS) 组、模型组(BLM组)、CXW组。BLM、CXW组经腹腔注入15 mg/kg BLM×10 d制作肺纤维化动物模型，分别于第1、14、28天每组各处死10只，留取血液,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞学计数及其分类；评价各组各时间点肺组织病理形态学变化，定量肺泡间隔宽度；检测肺组织匀浆中羟脯氨酸(HYP)含量；检测血清和肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量。结果: (1)与NS组比较，BLM组在第1、14、28天时的肺泡壁厚度、胸膜厚度和肺系数差异均有统计学意义(P均<0.05)，CXW组肺泡壁厚度、胸膜厚度明显增加，与BLM组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。(2)与同期NS组比较，BLM组第14、28天的HYP含量,第1、14天的细胞总数及炎性细胞比例和肺组织匀浆中MDA含量均明显升高(P均<0.05)，第1天肺组织匀浆中SOD活力明显降低(P<0.05)。同期CXW组改变不明显，与BLM组比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论: CXW可能通过提高大鼠肺纤维化模型中SOD活力，降低MDA含量，并在一定程度上阻止或延缓了胶原的沉积，起到了保护肺组织的作用。
关键词： 博莱霉素；喘消雾化液；肺纤维化
The effects of chuanxiaowuhuaye on the level of SOD and MDA in rats with bleomycininduced pulmonary fibrosis
Qimanguli, XIA Yu, Hamulati, et al
(Department of Respiratory Medicine, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)
Abstract: Objective: To observe the effect of chuanxiao wuhuaye (CXW) on the level of SOD and MDA in rats with bleomycininduced pulmonary fibrosis. Methods: Ninety male Wistar rats in good conditions were divided into three groups at random: control group (NS group), model group (BLM group). treatment group (CXW group). Rat pulmonary fibrosis was induced by intraperitoneal injection of bleomycin A5 (15 mg/kg body weight) for ten days. On the 1st, 14th, 28th day after administration, ten rats of each group were sacrificed respectively. On the 28th day, the lungs were harvested for histopathological examination, and the width of alveolar septa were measured. At the same time, the lung coefficients and the hydroxyproline (HYP) of lung tissues hemogenate were detected. On the 1st, 14th, 28th day, the contents of superoxide dismutase (SOD) and malonyldialdehyde (MDA) were detected respectively, and the changes of the number of cells and classification of the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were studied. Results: (1)The width of pleura depth, alveolar septa and lung coefficients of BLM group were significantly higher than those of NS group on 1st, 14th, 28th day (P<0.05), and the levels of HYP in BLM group significantly increased on 14th, 28th day compared with the NS group (P<0.05), those of the CXW group increased at some extent (P<0.05), but they were not significanter than BLM group (P<0.05). (2) Compared with those of the NS group, the percentage of inflammatory cells in BALF and the contents of MDA in lung tissues hemogenate of the BLM group increased significantly on the 1st, 14th days, and the contents of SOD in lung tissues hemogenate of the BLM group decreased significantly on the 1st day, (P<0.05). Those changes in CXW group were in a small extent. Conclusion: CXW may increases content of SOD, and decreases content of MDA. At the same time, it may inhibit collagen deposition in some extent and protect pulmonary tissues.
key words: bleomycin; chuanxiaowuhuaye; pulmonary fibrosis
间质性肺部疾病(interstitial lung disease,ILD)是以肺泡壁为主要病变所引起的众多异质性疾病组成的疾病谱，其临床症状、影像学表现和肺功能等都具有某些相似之处，发病机制、病理特征也具有某些共性的特点[1]。ILD早期以渗出性肺泡炎为主，晚期为肺间质性纤维化，其主要病理表现为早期弥漫性肺泡炎及后期大量间质细胞增生、基质胶原进行性聚集以致取代正常的肺组织结构，严重影响肺的通气和换气功能，最终导致呼吸功能衰竭而死亡。其中特发性肺纤维化(IPF)最为多见，确诊后平均存活2～4年，5年生存率30%～50%[2～4]。肺纤维化发病机理目前尚未阐明，大量研究表明与氧自由基所致损伤有关。喘消雾化液(CXW)是在新疆维药常用单方制剂的基础上，提取其有效成分研制而成，临床用于治疗咳喘病，具有显著的平喘、祛痰作用。动物实验表明，该药能抑制气道、肺及外周血中炎性细胞的趋化和聚集，可能参与抗氧化作用[5]。本实验予腹腔内注射博莱霉素(BLM)后的大鼠皮下注射CXW，检测其血清、肺组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等指标的变化以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数及其分类的变化，以研究CXW对BLM诱导大鼠肺纤维化的影响，为肺纤维化的防治提供实验依据。
1材料与方法
1.1试剂及仪器BLMA5(哈尔滨博莱制药有限公司，批号03080201)，CXW (新疆维吾尔医研究所研制，批号981109)，羟脯氨酸(HYP)、SOD、MDA试剂盒由南京建成公司提供，td600 version1.0真彩色病理细胞图像分析系统(北京天地公司)，721型可见光分光光度仪(上海第三分析仪器厂),LDZ52型离心机(北京)。
1.2实验动物与分组健康雄性Wistar大鼠90只，鼠龄8～10周，体重(250±50) g，由新疆医科大学动物实验中心提供，参照文献[6]的方法制作动物模型，将大鼠随机分为3组：生理盐水组(NS组)30只：每日腹腔内注射1 ml/kg无菌NS，同期给予1 ml/kg 0.9%NS；模型组(BLM组)30只：每日腹腔内注射15 mg/kg BLMA5，同期皮下注射1 ml/kg 0.9%NS；干预组(CXW组)30只：大鼠同模型组注射BLM 10 d，并同期皮下注射50 mg/kg CXW，以上3组大鼠在给药10 d后的第1、14、28天每组各处死10只留取标本。
1.3方法
1.3.1标本采集分别将大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，仰卧固定，逐层切开腹壁，由腹主动脉抽血4～5 ml，3 000 r/min离心10 min，取血清置-70℃冻存。将每组的5只取下双肺，剪去支气管后，冰盐水下冲洗3次，去血，滤纸尽量吸干水，称重(肺湿重)后，置-70℃冻存，留作匀浆。每组的另5只：将左肺以2 ml 0.9%NS进行支气管肺泡灌洗3次，回收液经双层无菌纱布过滤入离心管，记量后1 000 r/min离心10 min，取上清液置于-70℃冻存，留1 ml上清及沉淀物置-70℃冻存，待测细胞总数和分类。将右肺注入10%甲醛至胸膜展开为止，并固定于10%甲醛液中1周，石蜡包埋切片，HE染色，进行组织学评价。
1.3.2评价指标与方法(1)肺系数(g/g) [7]＝肺湿重/体重×1 000；(2)肺组织形态学定量观察[8]：平均肺泡壁厚度(μm)：用尺型微型测微器测定肺泡间隔宽度，每张切片观察10个视野，每个视野测3个肺泡壁厚度，取平均值。采用同样的方法测定胸膜厚度；(3)肺组织匀浆制作方法及步骤，HYP含量、SOD活力、MDA含量检测方法及步骤均参阅南京建成公司试剂盒说明书；(4)BALF细胞计数方法[9]：沉淀部分在白细胞计数板上计算BALF中细胞总数，涂片行HE染色，计数细胞分类。
1.4统计学处理采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学处理，各组数据均采用±s表示，各组间比较采用单因素方差分析,检验水准α＝0.05。
2结果
2.1不同时间各组肺系数的比较与NS组相比，第1、14、28天BLM组和CXW组肺系数均明显增加(P均<0.05)，BLM组第1天最高，第14天有所下降，第28天时最低。CXW组没有BLM组增加明显，两组差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
表1不同时间各组肺系数比较(略)注： 与NS组比较，*P<0.052.2肺组织形态学观察
2.2.1肉眼观察NS组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好。BLM组第1天双肺散在点状出血灶状淤斑，肺体积增大；第14天双呈肺灰白色，局部可见大小不等的结节样改变及陈旧出血点；第28天双肺苍白，体积缩小，硬度增加，表面结节样改变。CXW组表现较BLM组减轻。
2.2.2光镜观察BLM组第1、14天出现肺泡间隔水肿，炎性细胞浸润，以中性粒细胞、单核巨噬细胞及淋巴细胞为主，肺泡腔内分泌物增多，呈急性炎症样改变。第28天时肺泡壁内的炎性细胞数目虽有所减少，但呈现成纤维细胞增生，胶原基质明显增多，肺泡壁间隔仍增宽，肺内及胸膜下多发性纤维化灶形成明显。CXW组炎症反应趋势有所减轻，仅有轻度的间质水肿、炎症细胞的浸润及纤维化灶。NS组的肺组织学结构未见以上改变。
2.2.3肺组织形态学定量指标观察结果与NS组比较，BLM组不同时间段的肺泡壁厚度和胸膜厚度均明显增加(P均<0.05)，CXW组不同时间段肺泡壁厚度增加明显(P均<0.05)，第14、28天胸膜厚度增加明显(P均<0.05),与BLM组相比，CXW组不同时间段肺泡壁厚度和胸膜厚度均明显降低(P均<0.05)(表2)。
表2不同时间各组肺泡壁和胸膜厚度的比较(略)
表3不同时间各组肺组织匀浆中HYP含量的比较(略)注：与NS组比较， *P<0.05；与BLM组比较， ▲P<0.052.4各组BALF中细胞计数及其分类各组各时间点平均BALF回收率均达60%以上,差异无统计学意义。BLM组细胞总数第1天明显升高，达高峰,第14、28天逐步下降,各时间点与NS组、CXW组相比均有统计学意义(P均<0.05)。CXW组细胞总数在各时间点与NS组相比均有增加，在第1、14天差异有统计学意义(P均<0.05)。BLM组中性粒细胞比例从第1天明显增高，至第28天回降，与同期NS组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。CXW组中性粒细胞比例也呈现与BLM组相似的趋势,但比BLM组明显降低(P<0.05)。淋巴细胞、巨噬细胞也与中性粒细胞类似(表4)。
表4不同时间各组BALF中细胞计数及其分类的变化(略)
2.5.1血清中SOD活力和MDA含量的测定3组血清中SOD活力和MDA含量差异均无统计学意义(P均>0.05)(表5)。
2.5.2肺组织匀浆中SOD活力和MDA含量的测定BLM组SOD活力第1天明显低于NS组(P<0.05)，此后逐步回升，至第28天接近NS组。CXW组第1天也明显低于NS组(P<0.05)，但不如BLM组明显，第14天基本接近NS组。BLM组MDA含量第1天与NS组相比，明显升高(P<0.05)，此后虽有下降，但仍在第28天高于NS组。CXW组第1天也有升高，但与NS组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(表6)。
表5不同时间各组血清中SOD活力和MDA含量的比较(略)
表6不同时间各组肺组织匀浆中SOD活力和MDA含量的比较(略)注：与NS组比较， *P<0.05；与BLM组比较， ▲P<0.05
3讨论
动物实验已表明，BLM诱导产生的肺纤维化动物模型病理组织学与病理生理学改变与人类肺纤维化相似[10,11],因此被作为肺纤维化经典动物模型广泛应用于至今。其病理早期表现为渗出性肺泡炎，炎症细胞在病变处聚集增多，晚期为肺间质纤维化，间质细胞增生，基质胶原(如HYP)聚集取代正常的肺组织结构。本实验BLM组第1天BLAF中细胞总数及炎性细胞比例明显升高，提示肺泡炎病变存在；第28天肺内及胸膜下多发性纤维化灶的形成明显，肺泡壁间隔增宽明显，肺组织匀浆中HYP含量和肺系数均增高明显，提示有纤维化形成。这种改变与Taooka等[6]研究一致，提示模型复制成功。肺纤维化发病机制至今尚不清楚,目前许多实验表明[14]，在肺纤维化发病过程中存在着下呼吸道氧化/抗氧化失衡。生物体在正常生命活动过程中伴随着氧代谢会产生活性氧(如超氧负离子自由基等)，同时机体也具有活性氧清除体系,包括各种抗氧化酶类(如SOD等)和抗氧化物,故正常生理条件下机体的活性氧处于动态平衡状态。SOD能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基,是机体有效清除活性氧的重要酶类之一,被称为生物体抗氧化系统的第一道防线[12]。在病理状态下，活性氧大量增加，与DNA、蛋白质和多元不饱和脂肪酸作用, 造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白—蛋白交联、蛋白—DNA交联和脂质过氧化[13]。MDA是过氧化脂质降解产物，其含量常可反映机体内脂质过氧化的程度。同时当活性氧过量生成时，体内的防卫功能往往也受到抑制，使SOD等酶消耗增加，组织中活力降低。同样肺组织也存在着氧化/抗氧化平衡，在受到各种损害时也会出现失衡。本实验结果显示BLM组第1天肺组织匀浆MDA含量明显增高，SOD活力明显降低，此后MDA含量和SOD活力逐渐恢复正常水平，提示BLM致肺纤维化早期炎症时存在氧化/抗氧化失衡，机体抗氧化损伤的防卫功能下降。
目前认为下呼吸道氧化/抗氧化失衡的发生可能与中性粒细胞等炎性细胞在下呼吸道聚集有密切的关系。当肺组织受到损伤发生炎症时，中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎性细胞会聚集在下呼吸道，引起肺脏氧负荷过重。中性粒细胞可释放大量的氧自由基、花生四烯酸代谢产物和蛋白水解酶等，造成炎症持续和肺组织的损伤 [15]。本实验显示，BLM组第1天BLAF中细胞总数及炎性细胞比例明显升高，同时肺组织匀浆中MDA含量明显增高，SOD活性明显降低；第14天、28天BLAF中细胞总数及炎性细胞比例逐渐下降，肺组织匀浆MDA含量和SOD活性逐渐恢复正常水平，提示中性粒细胞等炎性细胞在氧自由基释放过程中起到了重要的作用，与Weiss[15]研究一致。CXW是在新疆维药常用单方制剂矢车菊的基础上，提取其有效成分黄酮类和内酯类研制而成，临床用于咳喘病，具有明显的平喘、祛痰作用。动物实验表明，该药可能是通过抑制气道、肺及外周血中炎性细胞的趋化和聚集而起作用[5]。本实验结果显示，用CXW处理后，第1天肺组织匀浆中MDA含量有一定程度增高，SOD活性有一定程度降低，但均无BLM组改变明显，提示CXW可以在一定程度上抑制肺组织的氧化损伤，提高肺组织的抗氧化能力。实验结果显示，CXW可以降低BLAF中细胞总数及炎性细胞比例升高程度，提示CXW有抑制炎性细胞趋化和聚集的作用，斯拉甫等[5]认为是通过抑制炎症组织中前列腺素E2(PGE2)、前列腺素E1a(PGE1a)等炎性介质的合成和释放而起作用的，提示在肺纤维化肺泡炎时，CXW在一定程度上抑制了中性粒细胞等炎性细胞在肺组织内聚集，减少了中性粒细胞释放氧自由基和SOD的消耗，提高肺脏抗氧化能力，可能阻止或延缓了肺纤维化的程度。第28天CXW在一定程度减轻了肺泡壁间隔增宽和肺组织匀浆中HYP含量增高的程度，提示CXW的干预使肺内胶原的沉积得到了一定程度的缓解或延缓，也可以推测CXW抑制了肺内胶原代谢，其机理有待于进一步探讨。
参考文献:
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[15]Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils[J]. N Engl J Med, 1989,320:365376.
(新疆医科大学第一附属医院呼吸科， 新疆乌鲁木齐830054), http://www.100md.com(齐曼古丽·吾守尔 夏宇 哈木拉提·吾甫尔 刘晖 刘丽娟)
关键词： 博莱霉素；喘消雾化液；肺纤维化
The effects of chuanxiaowuhuaye on the level of SOD and MDA in rats with bleomycininduced pulmonary fibrosis
Qimanguli, XIA Yu, Hamulati, et al
(Department of Respiratory Medicine, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China)
Abstract: Objective: To observe the effect of chuanxiao wuhuaye (CXW) on the level of SOD and MDA in rats with bleomycininduced pulmonary fibrosis. Methods: Ninety male Wistar rats in good conditions were divided into three groups at random: control group (NS group), model group (BLM group). treatment group (CXW group). Rat pulmonary fibrosis was induced by intraperitoneal injection of bleomycin A5 (15 mg/kg body weight) for ten days. On the 1st, 14th, 28th day after administration, ten rats of each group were sacrificed respectively. On the 28th day, the lungs were harvested for histopathological examination, and the width of alveolar septa were measured. At the same time, the lung coefficients and the hydroxyproline (HYP) of lung tissues hemogenate were detected. On the 1st, 14th, 28th day, the contents of superoxide dismutase (SOD) and malonyldialdehyde (MDA) were detected respectively, and the changes of the number of cells and classification of the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were studied. Results: (1)The width of pleura depth, alveolar septa and lung coefficients of BLM group were significantly higher than those of NS group on 1st, 14th, 28th day (P<0.05), and the levels of HYP in BLM group significantly increased on 14th, 28th day compared with the NS group (P<0.05), those of the CXW group increased at some extent (P<0.05), but they were not significanter than BLM group (P<0.05). (2) Compared with those of the NS group, the percentage of inflammatory cells in BALF and the contents of MDA in lung tissues hemogenate of the BLM group increased significantly on the 1st, 14th days, and the contents of SOD in lung tissues hemogenate of the BLM group decreased significantly on the 1st day, (P<0.05). Those changes in CXW group were in a small extent. Conclusion: CXW may increases content of SOD, and decreases content of MDA. At the same time, it may inhibit collagen deposition in some extent and protect pulmonary tissues.
key words: bleomycin; chuanxiaowuhuaye; pulmonary fibrosis
间质性肺部疾病(interstitial lung disease,ILD)是以肺泡壁为主要病变所引起的众多异质性疾病组成的疾病谱，其临床症状、影像学表现和肺功能等都具有某些相似之处，发病机制、病理特征也具有某些共性的特点[1]。ILD早期以渗出性肺泡炎为主，晚期为肺间质性纤维化，其主要病理表现为早期弥漫性肺泡炎及后期大量间质细胞增生、基质胶原进行性聚集以致取代正常的肺组织结构，严重影响肺的通气和换气功能，最终导致呼吸功能衰竭而死亡。其中特发性肺纤维化(IPF)最为多见，确诊后平均存活2～4年，5年生存率30%～50%[2～4]。肺纤维化发病机理目前尚未阐明，大量研究表明与氧自由基所致损伤有关。喘消雾化液(CXW)是在新疆维药常用单方制剂的基础上，提取其有效成分研制而成，临床用于治疗咳喘病，具有显著的平喘、祛痰作用。动物实验表明，该药能抑制气道、肺及外周血中炎性细胞的趋化和聚集，可能参与抗氧化作用[5]。本实验予腹腔内注射博莱霉素(BLM)后的大鼠皮下注射CXW，检测其血清、肺组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等指标的变化以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数及其分类的变化，以研究CXW对BLM诱导大鼠肺纤维化的影响，为肺纤维化的防治提供实验依据。
1材料与方法
1.1试剂及仪器BLMA5(哈尔滨博莱制药有限公司，批号03080201)，CXW (新疆维吾尔医研究所研制，批号981109)，羟脯氨酸(HYP)、SOD、MDA试剂盒由南京建成公司提供，td600 version1.0真彩色病理细胞图像分析系统(北京天地公司)，721型可见光分光光度仪(上海第三分析仪器厂),LDZ52型离心机(北京)。
1.2实验动物与分组健康雄性Wistar大鼠90只，鼠龄8～10周，体重(250±50) g，由新疆医科大学动物实验中心提供，参照文献[6]的方法制作动物模型，将大鼠随机分为3组：生理盐水组(NS组)30只：每日腹腔内注射1 ml/kg无菌NS，同期给予1 ml/kg 0.9%NS；模型组(BLM组)30只：每日腹腔内注射15 mg/kg BLMA5，同期皮下注射1 ml/kg 0.9%NS；干预组(CXW组)30只：大鼠同模型组注射BLM 10 d，并同期皮下注射50 mg/kg CXW，以上3组大鼠在给药10 d后的第1、14、28天每组各处死10只留取标本。
1.3方法
1.3.1标本采集分别将大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，仰卧固定，逐层切开腹壁，由腹主动脉抽血4～5 ml，3 000 r/min离心10 min，取血清置-70℃冻存。将每组的5只取下双肺，剪去支气管后，冰盐水下冲洗3次，去血，滤纸尽量吸干水，称重(肺湿重)后，置-70℃冻存，留作匀浆。每组的另5只：将左肺以2 ml 0.9%NS进行支气管肺泡灌洗3次，回收液经双层无菌纱布过滤入离心管，记量后1 000 r/min离心10 min，取上清液置于-70℃冻存，留1 ml上清及沉淀物置-70℃冻存，待测细胞总数和分类。将右肺注入10%甲醛至胸膜展开为止，并固定于10%甲醛液中1周，石蜡包埋切片，HE染色，进行组织学评价。
1.3.2评价指标与方法(1)肺系数(g/g) [7]＝肺湿重/体重×1 000；(2)肺组织形态学定量观察[8]：平均肺泡壁厚度(μm)：用尺型微型测微器测定肺泡间隔宽度，每张切片观察10个视野，每个视野测3个肺泡壁厚度，取平均值。采用同样的方法测定胸膜厚度；(3)肺组织匀浆制作方法及步骤，HYP含量、SOD活力、MDA含量检测方法及步骤均参阅南京建成公司试剂盒说明书；(4)BALF细胞计数方法[9]：沉淀部分在白细胞计数板上计算BALF中细胞总数，涂片行HE染色，计数细胞分类。
1.4统计学处理采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学处理，各组数据均采用±s表示，各组间比较采用单因素方差分析,检验水准α＝0.05。
2结果
2.1不同时间各组肺系数的比较与NS组相比，第1、14、28天BLM组和CXW组肺系数均明显增加(P均<0.05)，BLM组第1天最高，第14天有所下降，第28天时最低。CXW组没有BLM组增加明显，两组差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
表1不同时间各组肺系数比较(略)注： 与NS组比较，*P<0.052.2肺组织形态学观察
2.2.1肉眼观察NS组双肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好。BLM组第1天双肺散在点状出血灶状淤斑，肺体积增大；第14天双呈肺灰白色，局部可见大小不等的结节样改变及陈旧出血点；第28天双肺苍白，体积缩小，硬度增加，表面结节样改变。CXW组表现较BLM组减轻。
2.2.2光镜观察BLM组第1、14天出现肺泡间隔水肿，炎性细胞浸润，以中性粒细胞、单核巨噬细胞及淋巴细胞为主，肺泡腔内分泌物增多，呈急性炎症样改变。第28天时肺泡壁内的炎性细胞数目虽有所减少，但呈现成纤维细胞增生，胶原基质明显增多，肺泡壁间隔仍增宽，肺内及胸膜下多发性纤维化灶形成明显。CXW组炎症反应趋势有所减轻，仅有轻度的间质水肿、炎症细胞的浸润及纤维化灶。NS组的肺组织学结构未见以上改变。
2.2.3肺组织形态学定量指标观察结果与NS组比较，BLM组不同时间段的肺泡壁厚度和胸膜厚度均明显增加(P均<0.05)，CXW组不同时间段肺泡壁厚度增加明显(P均<0.05)，第14、28天胸膜厚度增加明显(P均<0.05),与BLM组相比，CXW组不同时间段肺泡壁厚度和胸膜厚度均明显降低(P均<0.05)(表2)。
表2不同时间各组肺泡壁和胸膜厚度的比较(略)
表3不同时间各组肺组织匀浆中HYP含量的比较(略)注：与NS组比较， *P<0.05；与BLM组比较， ▲P<0.052.4各组BALF中细胞计数及其分类各组各时间点平均BALF回收率均达60%以上,差异无统计学意义。BLM组细胞总数第1天明显升高，达高峰,第14、28天逐步下降,各时间点与NS组、CXW组相比均有统计学意义(P均<0.05)。CXW组细胞总数在各时间点与NS组相比均有增加，在第1、14天差异有统计学意义(P均<0.05)。BLM组中性粒细胞比例从第1天明显增高，至第28天回降，与同期NS组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。CXW组中性粒细胞比例也呈现与BLM组相似的趋势,但比BLM组明显降低(P<0.05)。淋巴细胞、巨噬细胞也与中性粒细胞类似(表4)。
表4不同时间各组BALF中细胞计数及其分类的变化(略)
2.5.1血清中SOD活力和MDA含量的测定3组血清中SOD活力和MDA含量差异均无统计学意义(P均>0.05)(表5)。
2.5.2肺组织匀浆中SOD活力和MDA含量的测定BLM组SOD活力第1天明显低于NS组(P<0.05)，此后逐步回升，至第28天接近NS组。CXW组第1天也明显低于NS组(P<0.05)，但不如BLM组明显，第14天基本接近NS组。BLM组MDA含量第1天与NS组相比，明显升高(P<0.05)，此后虽有下降，但仍在第28天高于NS组。CXW组第1天也有升高，但与NS组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(表6)。
表5不同时间各组血清中SOD活力和MDA含量的比较(略)
表6不同时间各组肺组织匀浆中SOD活力和MDA含量的比较(略)注：与NS组比较， *P<0.05；与BLM组比较， ▲P<0.05
3讨论
动物实验已表明，BLM诱导产生的肺纤维化动物模型病理组织学与病理生理学改变与人类肺纤维化相似[10,11],因此被作为肺纤维化经典动物模型广泛应用于至今。其病理早期表现为渗出性肺泡炎，炎症细胞在病变处聚集增多，晚期为肺间质纤维化，间质细胞增生，基质胶原(如HYP)聚集取代正常的肺组织结构。本实验BLM组第1天BLAF中细胞总数及炎性细胞比例明显升高，提示肺泡炎病变存在；第28天肺内及胸膜下多发性纤维化灶的形成明显，肺泡壁间隔增宽明显，肺组织匀浆中HYP含量和肺系数均增高明显，提示有纤维化形成。这种改变与Taooka等[6]研究一致，提示模型复制成功。肺纤维化发病机制至今尚不清楚,目前许多实验表明[14]，在肺纤维化发病过程中存在着下呼吸道氧化/抗氧化失衡。生物体在正常生命活动过程中伴随着氧代谢会产生活性氧(如超氧负离子自由基等)，同时机体也具有活性氧清除体系,包括各种抗氧化酶类(如SOD等)和抗氧化物,故正常生理条件下机体的活性氧处于动态平衡状态。SOD能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基,是机体有效清除活性氧的重要酶类之一,被称为生物体抗氧化系统的第一道防线[12]。在病理状态下，活性氧大量增加，与DNA、蛋白质和多元不饱和脂肪酸作用, 造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白—蛋白交联、蛋白—DNA交联和脂质过氧化[13]。MDA是过氧化脂质降解产物，其含量常可反映机体内脂质过氧化的程度。同时当活性氧过量生成时，体内的防卫功能往往也受到抑制，使SOD等酶消耗增加，组织中活力降低。同样肺组织也存在着氧化/抗氧化平衡，在受到各种损害时也会出现失衡。本实验结果显示BLM组第1天肺组织匀浆MDA含量明显增高，SOD活力明显降低，此后MDA含量和SOD活力逐渐恢复正常水平，提示BLM致肺纤维化早期炎症时存在氧化/抗氧化失衡，机体抗氧化损伤的防卫功能下降。
目前认为下呼吸道氧化/抗氧化失衡的发生可能与中性粒细胞等炎性细胞在下呼吸道聚集有密切的关系。当肺组织受到损伤发生炎症时，中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎性细胞会聚集在下呼吸道，引起肺脏氧负荷过重。中性粒细胞可释放大量的氧自由基、花生四烯酸代谢产物和蛋白水解酶等，造成炎症持续和肺组织的损伤 [15]。本实验显示，BLM组第1天BLAF中细胞总数及炎性细胞比例明显升高，同时肺组织匀浆中MDA含量明显增高，SOD活性明显降低；第14天、28天BLAF中细胞总数及炎性细胞比例逐渐下降，肺组织匀浆MDA含量和SOD活性逐渐恢复正常水平，提示中性粒细胞等炎性细胞在氧自由基释放过程中起到了重要的作用，与Weiss[15]研究一致。CXW是在新疆维药常用单方制剂矢车菊的基础上，提取其有效成分黄酮类和内酯类研制而成，临床用于咳喘病，具有明显的平喘、祛痰作用。动物实验表明，该药可能是通过抑制气道、肺及外周血中炎性细胞的趋化和聚集而起作用[5]。本实验结果显示，用CXW处理后，第1天肺组织匀浆中MDA含量有一定程度增高，SOD活性有一定程度降低，但均无BLM组改变明显，提示CXW可以在一定程度上抑制肺组织的氧化损伤，提高肺组织的抗氧化能力。实验结果显示，CXW可以降低BLAF中细胞总数及炎性细胞比例升高程度，提示CXW有抑制炎性细胞趋化和聚集的作用，斯拉甫等[5]认为是通过抑制炎症组织中前列腺素E2(PGE2)、前列腺素E1a(PGE1a)等炎性介质的合成和释放而起作用的，提示在肺纤维化肺泡炎时，CXW在一定程度上抑制了中性粒细胞等炎性细胞在肺组织内聚集，减少了中性粒细胞释放氧自由基和SOD的消耗，提高肺脏抗氧化能力，可能阻止或延缓了肺纤维化的程度。第28天CXW在一定程度减轻了肺泡壁间隔增宽和肺组织匀浆中HYP含量增高的程度，提示CXW的干预使肺内胶原的沉积得到了一定程度的缓解或延缓，也可以推测CXW抑制了肺内胶原代谢，其机理有待于进一步探讨。
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(新疆医科大学第一附属医院呼吸科， 新疆乌鲁木齐830054), http://www.100md.com(齐曼古丽·吾守尔 夏宇 哈木拉提·吾甫尔 刘晖 刘丽娟)