微流控进样阿达玛变换显微荧光成像单细胞分析
第32 卷
2004 年5 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第5 期
579～581
微流控进样阿达玛变换显微荧光成像单细胞分析
李 涛 唐宏武3 周锦松 陈观铨
(武汉大学化学与分子科学学院测试中心,武汉430072)
摘 要 将微流控芯片用于单细胞进样,以自制阿达玛变换显微荧光成像分析系统进行成像检测,讨论了影
响单细胞进样和荧光成像的主要因素,并对花粉细胞DNA 含量进行定量分析。结果表明:微流控进样技术
与HT 显微成像技术相结合,可有效可靠地应用于单细胞分析中,所测定的三个玉帘花粉的DNA 含量分别为
124. 4 、123. 9 和62. 9 pg。
关键词 阿达玛变换,微流控芯片,荧光成像,单细胞分析
2003206210 收稿;2003212219 接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20075019)
1 引 言
微流控芯片的加工制作及其在样品进样分离、单成分检测、PCR 扩增及DNA 测序等领域中的应
用,是一个十分活跃的研究领域。方肇伦等1 ,2 以玻璃刻蚀法及高分子材料模塑法制作微流控芯片,并
用来进行氨基酸分离和PCR 扩增实验,这种芯片加工技术日趋成熟。最近,作者成功研制了高分辨阿
达玛变换(HT) 显微图像分析系统,并已将其应用于细胞DNA 定量分析及肿瘤倍性分析领域3 ,4 。本
实验根据文献5 ,6 , 利用聚甲基丙烯酸甲酯( PMMA) 片基制作芯片,并利用该芯片为HT 成像系统提
供动态进样技术,结合前者进样体积小、快速有效及后者高分辨率、高信噪比图像探测能力等特点,以实
现单细胞流动进样及停留成像检测,并对玉帘花粉细胞DNA 含量进行分析讨论。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
阿达玛变换显微图像分析仪(自行研制) ,其工作原理参见文献3 , 4 。
单细胞悬浮液:将AO 染色的细胞试样振荡分散在50 %缓冲甘油中,实验前临时配制。
2. 2 芯片制作
在PMMA 基片上相距1 cm 处打两个小孔(1 mm , i. d. ) ,将另一个150μm 厚片基热切两等分,用三氯
甲烷将其相距200μm 平行粘贴在基片上的两孔间并盖过小孔,形成一个1 cm ×200μm ×150μm 微通道,再用三氯甲烷封接盖玻片与带微通道的基片,用硅橡胶将小孔两端封严,室温下固化24 h ,备用。
2. 3 分析过程
微流控分析装置如图1 所示。实验时,打开进出口阀,压缩空气,细胞样品液进入微通道内,停止施
压,关上进出口阀,在选定波长下,以HT 成像系统采集信号,获得细胞HT 荧光图像。以单细胞总荧光
强度对细胞内荧光标记成分进行定量分析。
3 结果与讨论
3. 1 单细胞进样及成像检测能力
芯片通道尺寸、细胞样品液浓度及其在微通道内的流速,是影响单细胞进样的主要因素。实验采用
自制合适通道尺寸的芯片,并配制足够稀的细胞样品溶液,调节进样压力使样品溶液以合适的速度流过
微通道,实现单细胞进样。图2 (a) 为3 个AO 标记的玉帘花粉细胞通过检测区时的HT 透射光图像。
由图可见,在实验条件下,细胞呈单个或单列通过检测区。
在40 ×物镜下,对图2 (a) 中的花粉细胞进行HT 显微荧光成像,见图2 (b) 。结果表明:检测区内
图1 微流控分析系统装置示意图
Fig. 1 Schematic diagram of the microfluidic analysis system
a. 微流控芯片示意图(illustration of the microchip) ; b. 单细胞进样成像检测微流控系统(the mi2
crofluidic system for single2cell sampling and detection) 。
各个细胞,可同时在成像系统获得高清晰度、高分辨率的HT 显微荧光图像,说明HT 成像系统与微流
控技术结合,具有较强的单细胞成像检测能力。
3. 2 影响成像质量的主要因素
3. 2. 1 光源稳定性和细胞移动影响 光源的稳定性及细胞微小移动,都会对成像质量造成重要影响。
本实验采用恒压恒流和自动反馈调节的高压汞灯和溴钨灯等恒定光源照明,利用进出口阀限流及缓冲
甘油粘滞等手段减小样品移动,实验效果令人满意。
3. 2. 2 芯片质量影响 芯片质量也是影响HT 成像效果的重要因素。其透光性影响信号强弱,而芯片
表面至通道底部距离决定了通道内细胞是否能清晰成像。本实验选用透光性好的玻璃盖片及PMMA
片基作为芯片上下片基,有效厚度不超过500μm ,满足实验要求。
3. 2. 3 其他 背景光及通道位置等因素也会影响成像效果,因此宜采用最佳条件。
3. 3 分析方法可行性及优越性
对图2 中3 个细胞进行11 次平行成像,并测定它们的总荧光强度,细胞1 、2 、3 的荧光强度RSD 值
分别为1. 66 %、2. 78 %和3. 63 % ,这一结果表明测量数据稳定可靠。
图2 在40 倍物镜下于530 nm 处获得的微通道(L 10 ×W 0. 2 ×D 0. 15
mm) 内3 个玉帘花粉细胞HT 显微图像
Fig. 2 Hadamard transform ( HT) microscopic images of three pollen cells ob2
tained at 530 nm in a microchannel (L 10 ×W 0. 2 ×D 0. 15 mm) under 40 ×
objective
a. 亮场图像(bright2field image) ; b. 荧光图像(fluorescence image) 。
传统的显微分析技术一般将样品制成玻璃涂片,操作简单方便。但是细胞在盖玻片压力下形态会
发生微小变化,这对细胞形态观测不利;此外,玻璃涂片制作过程会给实验带来人为的偏差。微流控进
样单细胞分析不但具有传统方法成像清晰、操作快速方便等特点,而且保持了细胞原有形状,利于细胞
形态分析;样品均在同一条件下测定,减小了人为偏差。
0 8 5 分析化学第32 卷
3. 4 玉帘花粉细胞DNA 含量分析
经AO 染色的玉帘花粉细胞荧光主要来自与AO2DNA 复合物。我们曾报道了以已知DNA 含量的
洋葱2 倍体细胞为标准,测量花粉细胞DNA 含量的方法7 ;依此方法测定图2 中1 、2 和3 三个花粉粒
DNA 含量分别为:124. 4 、123. 9 和62. 9 pg。结果表明:花粉1 和2 的DNA 含量相同,为花粉3 的两倍。
由此推测,玉帘花粉细胞可能是由DNA 含量相差1 倍的两种花粉构成。
4 结 论
微流控进样阿达玛变换显微荧光成像检测单细胞分析具有操作快速、成像清晰、重复性好等特点,适合于单细胞样品的定量分析。在此基础上,再制作不同通道尺寸的芯片。该方法不但可用来定量分
析各种动植物细胞,还可与其他方法结合,进行荧光微球免疫分析、肿瘤倍性分析及抗癌药物与细胞相
互作用等研究,相关工作将在以后进一步报道。
References
1 Yin Xuefeng (殷学锋) , Shen Hong (沈 宏) , Fang Zhaolun (方肇伦) . Chinese J . A nal . Chem. (分析化学) , 2003 ,31 (1) :116～119
2 Ye Meiying (叶美英) , Fang Qun (方 群) , Yin Xuefeng (殷学锋) , Fang Zhaolun (方肇伦) . Chem. J . Chinese Uni2
versities (高等学校化学学报) , 2002 , 23 (12) : 2243～2246
3 Tang H W , Chen G Q , Zhou J S , Wu Q S. A nal . Chim. Acta , 2002 , 248 : 27～34
4 Tang Hongwu (唐宏武) , Zhou Jinsong (周锦松) , Chen Guanquan (陈观铨) , Wu Qiongshui (吴琼水) . Chem. J . Chi2
nese Universities (高等学校化学学报) , 2002 , 23 (12) : 2250～2252
5 Nakanishi H , Nishimoto T , Nakamura N , Nagamachi S. I EEE , 1997 : 299～304
6 Eiichiro T , Kiichi S , Manabu T , Kae S , Makoto A , Takehiko K. A nal . Chem. , 2002 , 74 : 1560～1564
7 Tang H W , Chen G Q , Zeng Y E. Microchemical J . , 1999 , 61 : 177～182
Microfluidic Sampl ing and Hadamard Transform Microscopic
Fluorescence Image Analysis for Single Cells
Li Tao , Tang Hongwu
3
, Zhou Jinsong , Chen Guanquan
( Center of A nalysis and Measurements , College of Chemist ry and Molecular Science , Wuhan University , Wuhan 430072)
Abstract A microchip was applied to the sampling of single cell , the domestic2made Hadamard t ransform
(HT) microscopic fluorescence imaging analysis system was used for imaging detection. The factors that af2
fect single2cell sampling and imaging were discussed , and the deoxyribonucleic acid content s of the single
pollens were measured quantitatively. The result shows that the system of microchip sampling combining
with the HT microscopic imaging technique can be applied effectively and reliably for single2cell analysis ,and the DNA content s in three measured Zephy ranthes candida (Lindl. ) Herb. pollens are 124. 4 , 123. 9
and 62. 9 pg , repectively.
Keywords Hadamard t ransform , microchip , fluorescence imaging , single2cell analysis
(Received 10 J une 2003 ; accepted 19 December 2003)
1 8 5 第5 期李 涛等:微流控进样阿达玛变换显微荧光成像单细胞分析, 百拇医药(李 涛 唐宏武 周锦松 陈观铨)
2004 年5 月
分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第5 期
579～581
微流控进样阿达玛变换显微荧光成像单细胞分析
李 涛 唐宏武3 周锦松 陈观铨
(武汉大学化学与分子科学学院测试中心,武汉430072)
摘 要 将微流控芯片用于单细胞进样,以自制阿达玛变换显微荧光成像分析系统进行成像检测,讨论了影
响单细胞进样和荧光成像的主要因素,并对花粉细胞DNA 含量进行定量分析。结果表明:微流控进样技术
与HT 显微成像技术相结合,可有效可靠地应用于单细胞分析中,所测定的三个玉帘花粉的DNA 含量分别为
124. 4 、123. 9 和62. 9 pg。
关键词 阿达玛变换,微流控芯片,荧光成像,单细胞分析
2003206210 收稿;2003212219 接受
本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20075019)
1 引 言
微流控芯片的加工制作及其在样品进样分离、单成分检测、PCR 扩增及DNA 测序等领域中的应
用,是一个十分活跃的研究领域。方肇伦等1 ,2 以玻璃刻蚀法及高分子材料模塑法制作微流控芯片,并
用来进行氨基酸分离和PCR 扩增实验,这种芯片加工技术日趋成熟。最近,作者成功研制了高分辨阿
达玛变换(HT) 显微图像分析系统,并已将其应用于细胞DNA 定量分析及肿瘤倍性分析领域3 ,4 。本
实验根据文献5 ,6 , 利用聚甲基丙烯酸甲酯( PMMA) 片基制作芯片,并利用该芯片为HT 成像系统提
供动态进样技术,结合前者进样体积小、快速有效及后者高分辨率、高信噪比图像探测能力等特点,以实
现单细胞流动进样及停留成像检测,并对玉帘花粉细胞DNA 含量进行分析讨论。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
阿达玛变换显微图像分析仪(自行研制) ,其工作原理参见文献3 , 4 。
单细胞悬浮液:将AO 染色的细胞试样振荡分散在50 %缓冲甘油中,实验前临时配制。
2. 2 芯片制作
在PMMA 基片上相距1 cm 处打两个小孔(1 mm , i. d. ) ,将另一个150μm 厚片基热切两等分,用三氯
甲烷将其相距200μm 平行粘贴在基片上的两孔间并盖过小孔,形成一个1 cm ×200μm ×150μm 微通道,再用三氯甲烷封接盖玻片与带微通道的基片,用硅橡胶将小孔两端封严,室温下固化24 h ,备用。
2. 3 分析过程
微流控分析装置如图1 所示。实验时,打开进出口阀,压缩空气,细胞样品液进入微通道内,停止施
压,关上进出口阀,在选定波长下,以HT 成像系统采集信号,获得细胞HT 荧光图像。以单细胞总荧光
强度对细胞内荧光标记成分进行定量分析。
3 结果与讨论
3. 1 单细胞进样及成像检测能力
芯片通道尺寸、细胞样品液浓度及其在微通道内的流速,是影响单细胞进样的主要因素。实验采用
自制合适通道尺寸的芯片,并配制足够稀的细胞样品溶液,调节进样压力使样品溶液以合适的速度流过
微通道,实现单细胞进样。图2 (a) 为3 个AO 标记的玉帘花粉细胞通过检测区时的HT 透射光图像。
由图可见,在实验条件下,细胞呈单个或单列通过检测区。
在40 ×物镜下,对图2 (a) 中的花粉细胞进行HT 显微荧光成像,见图2 (b) 。结果表明:检测区内
图1 微流控分析系统装置示意图
Fig. 1 Schematic diagram of the microfluidic analysis system
a. 微流控芯片示意图(illustration of the microchip) ; b. 单细胞进样成像检测微流控系统(the mi2
crofluidic system for single2cell sampling and detection) 。
各个细胞,可同时在成像系统获得高清晰度、高分辨率的HT 显微荧光图像,说明HT 成像系统与微流
控技术结合,具有较强的单细胞成像检测能力。
3. 2 影响成像质量的主要因素
3. 2. 1 光源稳定性和细胞移动影响 光源的稳定性及细胞微小移动,都会对成像质量造成重要影响。
本实验采用恒压恒流和自动反馈调节的高压汞灯和溴钨灯等恒定光源照明,利用进出口阀限流及缓冲
甘油粘滞等手段减小样品移动,实验效果令人满意。
3. 2. 2 芯片质量影响 芯片质量也是影响HT 成像效果的重要因素。其透光性影响信号强弱,而芯片
表面至通道底部距离决定了通道内细胞是否能清晰成像。本实验选用透光性好的玻璃盖片及PMMA
片基作为芯片上下片基,有效厚度不超过500μm ,满足实验要求。
3. 2. 3 其他 背景光及通道位置等因素也会影响成像效果,因此宜采用最佳条件。
3. 3 分析方法可行性及优越性
对图2 中3 个细胞进行11 次平行成像,并测定它们的总荧光强度,细胞1 、2 、3 的荧光强度RSD 值
分别为1. 66 %、2. 78 %和3. 63 % ,这一结果表明测量数据稳定可靠。
图2 在40 倍物镜下于530 nm 处获得的微通道(L 10 ×W 0. 2 ×D 0. 15
mm) 内3 个玉帘花粉细胞HT 显微图像
Fig. 2 Hadamard transform ( HT) microscopic images of three pollen cells ob2
tained at 530 nm in a microchannel (L 10 ×W 0. 2 ×D 0. 15 mm) under 40 ×
objective
a. 亮场图像(bright2field image) ; b. 荧光图像(fluorescence image) 。
传统的显微分析技术一般将样品制成玻璃涂片,操作简单方便。但是细胞在盖玻片压力下形态会
发生微小变化,这对细胞形态观测不利;此外,玻璃涂片制作过程会给实验带来人为的偏差。微流控进
样单细胞分析不但具有传统方法成像清晰、操作快速方便等特点,而且保持了细胞原有形状,利于细胞
形态分析;样品均在同一条件下测定,减小了人为偏差。
0 8 5 分析化学第32 卷
3. 4 玉帘花粉细胞DNA 含量分析
经AO 染色的玉帘花粉细胞荧光主要来自与AO2DNA 复合物。我们曾报道了以已知DNA 含量的
洋葱2 倍体细胞为标准,测量花粉细胞DNA 含量的方法7 ;依此方法测定图2 中1 、2 和3 三个花粉粒
DNA 含量分别为:124. 4 、123. 9 和62. 9 pg。结果表明:花粉1 和2 的DNA 含量相同,为花粉3 的两倍。
由此推测,玉帘花粉细胞可能是由DNA 含量相差1 倍的两种花粉构成。
4 结 论
微流控进样阿达玛变换显微荧光成像检测单细胞分析具有操作快速、成像清晰、重复性好等特点,适合于单细胞样品的定量分析。在此基础上,再制作不同通道尺寸的芯片。该方法不但可用来定量分
析各种动植物细胞,还可与其他方法结合,进行荧光微球免疫分析、肿瘤倍性分析及抗癌药物与细胞相
互作用等研究,相关工作将在以后进一步报道。
References
1 Yin Xuefeng (殷学锋) , Shen Hong (沈 宏) , Fang Zhaolun (方肇伦) . Chinese J . A nal . Chem. (分析化学) , 2003 ,31 (1) :116～119
2 Ye Meiying (叶美英) , Fang Qun (方 群) , Yin Xuefeng (殷学锋) , Fang Zhaolun (方肇伦) . Chem. J . Chinese Uni2
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3 Tang H W , Chen G Q , Zhou J S , Wu Q S. A nal . Chim. Acta , 2002 , 248 : 27～34
4 Tang Hongwu (唐宏武) , Zhou Jinsong (周锦松) , Chen Guanquan (陈观铨) , Wu Qiongshui (吴琼水) . Chem. J . Chi2
nese Universities (高等学校化学学报) , 2002 , 23 (12) : 2250～2252
5 Nakanishi H , Nishimoto T , Nakamura N , Nagamachi S. I EEE , 1997 : 299～304
6 Eiichiro T , Kiichi S , Manabu T , Kae S , Makoto A , Takehiko K. A nal . Chem. , 2002 , 74 : 1560～1564
7 Tang H W , Chen G Q , Zeng Y E. Microchemical J . , 1999 , 61 : 177～182
Microfluidic Sampl ing and Hadamard Transform Microscopic
Fluorescence Image Analysis for Single Cells
Li Tao , Tang Hongwu
3
, Zhou Jinsong , Chen Guanquan
( Center of A nalysis and Measurements , College of Chemist ry and Molecular Science , Wuhan University , Wuhan 430072)
Abstract A microchip was applied to the sampling of single cell , the domestic2made Hadamard t ransform
(HT) microscopic fluorescence imaging analysis system was used for imaging detection. The factors that af2
fect single2cell sampling and imaging were discussed , and the deoxyribonucleic acid content s of the single
pollens were measured quantitatively. The result shows that the system of microchip sampling combining
with the HT microscopic imaging technique can be applied effectively and reliably for single2cell analysis ,and the DNA content s in three measured Zephy ranthes candida (Lindl. ) Herb. pollens are 124. 4 , 123. 9
and 62. 9 pg , repectively.
Keywords Hadamard t ransform , microchip , fluorescence imaging , single2cell analysis
(Received 10 J une 2003 ; accepted 19 December 2003)
1 8 5 第5 期李 涛等:微流控进样阿达玛变换显微荧光成像单细胞分析, 百拇医药(李 涛 唐宏武 周锦松 陈观铨)