卡托普利预适应对人内皮细胞ICAM-1表达的影响
【摘要】 目的 本研究是探讨卡托普利预适应对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧(H/R)时ICAM-1表达的影响，并探讨其作用机制。 方法 首先建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧复氧损伤模型，将细胞分为对照组，缺氧复氧组，卡托普利预适应组，以及应用缓激肽β 2 受体阻滞剂、PKC阻滞剂、一氧化氮合酶阻滞剂和NF-κB阻滞剂，分别与卡托普利共同孵育细胞组，再对内皮细胞行缺氧2h/复氧6h方案，用流式细胞仪检测细胞表面ICAM-1的含量。 结果 缺氧复氧组可使内皮细胞存活率下降、ICAM-1的表达增加，与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，卡托普利预适应组可使内皮细胞存活率增加、ICAM-1的表达减少，与缺氧复氧组相比差异有显著性(P<0.05)，但给予上述四种阻滞剂后，此作用可被清除，与卡托普利预适应组相比差异有显著性(P<0.05)。 结论 缺氧复氧可以使内皮细胞ICAM-1的表达增加，卡托普利预适应可使内皮细胞ICAM-1的表达减少，此种变化具有剂量依赖性，此过程涉及缓激肽β 2 受体，PKC途径，一氧化氮和核因子等多种因素参与。
关键词 内皮细胞 缺氧复氧损伤 卡托普利 预适应ICAM-1
反复短暂的缺血刺激使心肌对随后较长时间的持续缺血产生适应的现象称为缺血预适应(Ischemic Precondition-ing，IPC)，这是Murry等在1986年提出的 [1] 。现大量的研究表明，IPC的保护作用不仅存在于心肌细胞，还存在于机体实质脏器的血管内皮细胞 [2～5] 。目前的研究认为IPC对ECs的保护作用与氧自由基、腺苷、热休克蛋白、K ATP 通道的开放、钙基因相关肽、细胞凋亡相关基因等有关。但是经典缺血预适应的反复短暂缺血本身是对机体的一种损伤，根据IPC的机制，人们相继又开展了缺氧预适应、快速起搏预适应和药物预适应 [6～8] 。ICAM-1在缺血再灌注损伤(is-chemic reperfusion injury，IRI)中发挥着主要的作用，随着各种预适应的开展，可使其在I/R中表达下调，使其介导的内皮细胞和中性粒细胞的粘附聚集作用减弱，减少炎性反应，从而达到保护内皮细胞及脏器实质细胞的作用，为临床开辟新的治疗前景。我们采用卡托普利药物预适应的方法，在细胞水平上观察卡托普利药物预适应对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧复氧(Hypoxia/Reoxygenationing，H/R)时细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的变化，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人脐静脉内皮细胞株ECV304(中科院上海细胞库);IMDM培养基(含青霉素100U/ml+链霉素100U/ml+10%胎牛血清)(Sigma Chemical Co.USA);卡托普利纯品(中美上海施贵宝公司馈赠);缓激肽β 2 受体阻滞剂(HOE140)，PKC阻滞剂(Chelerythrine)，一氧化氮合酶阻滞剂(L-NAME)和NF-κB阻滞剂(PDTC)(Sigma.USA);ICAM-1荧光抗体(eBioscience公司，USA);二氧化碳孵箱(RKI日本);流式细胞仪(Becton Dickinson Facscalibur，USA)。
1.2 方法 取ECV304细胞培养于IMDM培养基中，放于37.0℃、5%CO 2 饱和湿度培养箱培养，每2～3天换液1次，倒置显微镜下观察呈单层铺路石状镶嵌排列，即可传代。取培养至第3代的ECV304细胞，弃去培养液，换缺氧培养液 [9] 每瓶0.6ml，用高纯度的氮气饱和，将充满氮气的细胞培养瓶的瓶盖儿拧紧，放于37.0℃、5%CO 2 饱和湿度培养箱内缺氧培育2h。然后弃去缺氧培养液，更换预先有氧平衡的复氧培养液 [9] 0.6ml，放于37.0℃、5%CO 2 饱和湿度培养箱内复氧培育6h，建立缺氧复氧模型。
1.3 实验分组 实验共随机分7组:(1)对照组(C):细胞置IMDM培养基中于5%CO 2 、37.0℃饱和湿度培养箱中培养。(2)缺氧复氧组(H/R):细胞于上述缺氧条件下缺氧2h后，全量换以复氧液，并恢复5%CO 2 气体环境分别培养6h。(3)卡托普利预处理组(CAP):不同浓度的卡托普利(10 -2 ，10 -3 ，10 -4 mol/L)加入实验组细胞培养瓶中，刺激24h后对ECs行缺氧2h复氧6h方案。(4)卡托普利+HOE140(浓度为10 -5 mol/L)组。(5)卡托普利+PKC阻滞剂(浓度为10 -5 mol/L)组。(6)卡托普利+L-NAME(浓度为10 -5 mol/L)组。(7)卡托普利+PDTC(浓度为10 -5 mol/L)组。(4～7组)四种阻滞剂分别加入实验组细胞培养瓶中，30min后再加入卡托普利，卡托普利终浓度为10 -2 mol/L，与阻滞剂共同孵育ECs，24h后行缺氧2h复氧6h方案。
1.4 观察指标
1.4.1 细胞计数 取待测的细胞悬液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml(死细胞着色)，混合后滴入血球计数盘内，按WBC计数法，于低倍镜下计数4角的4个大格内的活细胞(透明未着色)总数，然后按下式计数:细胞浓度(细胞数/ml)=4个大格内的活细胞总数÷4×10 4 ×稀释倍数(10);细胞存活率(%)=活细胞数÷(活细胞数+死细胞数)×100%。
1.4.2 ICAM-1蛋白表达测定 结束实验时，弃去复氧液，用0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合液消化，PBS收集细胞，调整细胞浓度为1×10 6 个/ml的细胞悬液加入试管中，1200～1600r/min离心10min，弃上清，在每个试管中加入ICAM-1单克隆荧光抗体20μl重悬细胞，其中一试管用抗鼠IgG代替抗体做阴性对照。4℃孵育1h，10倍量PBS重悬，离心弃上清;0.5ml PBS重悬细胞，上机测定前将细胞悬液充分震荡，使细胞分散成单个，用流式细胞仪(激光光源为氩离子液光，波长为488nm)检测其平均荧光强度，每个观察值检测3次。用平均荧光强度表示着色细胞的阳性值，每一样品的检测均设阴性对照，阳性值为:(待测样品平均荧光强度-阴性对照平均荧光强度)÷阴性对照平均荧光强度。
1.5 统计学处理 结果以均数±标准差(ˉx±s)表示，数据处理采用t检验，P<0.05表示统计学上差异有显著性。
2 结果
2.1 缺氧复氧组使HUVEC的存活率明显下降(C组:89.5±5.7%;H/R组:62.1±1.9%;n=3;P<0.05)。卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)与缺氧复氧组相比使HUVEC的存活率增加(86.7±4.6%，P<0.05)，见表1。
表1 缺氧复氧损伤对内皮细胞存活率的影响 (略)
2.2 正常培养的对照组HUVEC的ICAM-1呈持续低水平表达(3.9±0.5)，缺氧复氧组使HUVEC的ICAM-1表达较对照组明显增加(10.2±0.6)(P<0.05)。卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)使HUVEC的ICAM-1表达(5.9±0.3)较单纯缺氧复氧组(10.0±0.6)明显降低(P<0.05)，且卡托普利预适应组(10 -3 mol/L)使HUVEC的ICAM-1表达(6.9±0.3)、卡托普利预适应组(10 -4 mol/L)使HUVEC的ICAM-1表达(7.2±0.6)分别与缺氧复氧组比较P均<0.05，卡托普利预适应组(10 -4 mol/L)(7.2±0.6)与卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)(5.9±0.3)比较P值亦<0.05，但卡托普利预适应组(10 -4 mol/L)与卡托普利预适应组(10 -3 mol/L)比较以及卡托普利预适应组(10 -3 mol/L)与卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)比较没有统计学意义。给予上述四种阻滞剂缓激肽β 2 受体阻滞剂(HOE140)，PKC阻滞剂(Chelery-thrine)，一氧化氮合酶阻滞剂(L-NAME)和NF-κB阻滞剂(PDTC)后上述卡托普利预适应的作用被清除，ICAM-1的表达明显增加(P<0.05)。见表2。
表2 缺氧复氧损伤对内皮细胞ICAM-1表达的影响 (略)
3 讨论
氧自由基损伤、钙超载和炎症浸润是目前缺血再灌注损伤比较公认的机制 [10，11] 。缺血再灌注导致内皮功能障碍，内源性NO生成减少，抑制中性粒细胞(Polymorphonucle-ar Neutrophil Leukocyte，PMN)粘附聚集作用减弱 [12] ，PMN机械性阻塞毛细血管，诱发氧耗量增加及氧自由基产生 [13] ，导致再灌注损伤。白细胞、内皮细胞粘附机制是炎症反应的重要环节。而ICAM-1是介导PMN与内皮细胞粘附的主要粘附分子，在IRI中起重要作用。通过阻断粘附分子ICAM-1而有效地保护内皮细胞是预防和治疗再灌注损伤的关键。故我们的实验用HUVEC代表血管内皮细胞，使之在缺氧(2h)/复氧(6h)环境中观察ICAM-1的表达及卡托普利预适应对此表达的影响和作用机制。我们的实验结果为:(1)缺氧复氧组使ECs的存活率明显下降(C组:89.5±5.7%;H/R组:62.1±1.9%;n=3;P<0.05)，卡托普利预适应组与缺氧复氧组相比使ECs的存活率增加(86.7±4.6%，P<0.05)，这与Fujita等 [14] 的实验相符，ACEI能减轻缺氧再氧化引起的细胞损伤和细胞凋亡。(2)对照组ECs的ICAM-1呈持续低水平表达(3.9±0.5)，缺氧复氧组使ECs的ICAM-1表达明显增加(10.2±0.6)，与对照组相比较增加约3倍(P<0.05)，卡托普利预适应组(CAP)(10 -2 mol/L)使ECs的ICAM-1表达(5.9±0.3)较单纯缺氧复氧组明显降低(P<0.05)，且有剂量依赖性，但给予缓激肽β 2 受体阻滞剂HOE140后，ICAM-1的表达(8.8±0.7)较CAP组增加，说明卡托普利使ECs在H/R时ICAM-1表达减少有缓激肽的作用。同理在应用PKC阻滞剂Chelerythrine、一氧化氮合酶阻滞剂L-NAME、NF-κB阻滞剂PDTC后上述卡托普利预适应的作用亦被清除。表明，卡托普利预适应可以使ECs在缺氧及复氧时ICAM-1的表达减少，它是由PKC和NO途径介导的，核因子亦参与此作用。
通过本实验，可以表明卡托普利预适应对内皮细胞有保护作用，使内皮细胞在缺氧复氧时ICAM-1的表达减少。其作用机制为:(1)卡托普利为血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，能抑制AngⅠ的转化，减少AngⅡ的生成，有效地阻断AngⅡ的生物学效应。AngⅡ可损伤血管ECs，使一氧化氮合酶(NOS)活性下降，NO合成减少。研究发现NO可扩张血管，抑制血小板及中性粒细胞在内皮细胞上的粘附和聚集，减少自由基生成，防止钙超载等。AngⅡ还可通过调节前炎性因子TNF-α、白细胞介素(IL)的分泌，参与炎症过程调控，促进粘附分子表达 [15] 。Pastore等 [16] 用AngⅡ(1mol/L-1μmol/L)与HUVEC共同培育2h后发现，ECs表面ICAM-1mRNA明显增高，培养基可溶性ICAM-1释放也增高(P<0.002)。上述实验和我们的研究表明卡托普利可以使ECs在缺氧/复氧时ICAM-1表达减少，有可能是通过阻断AngⅡ的生物学效应而实现的。因为我们未做AngⅡ受体拮抗剂对H/R时ICAM-1表达的对照无法下肯定结论。(2)血管紧张素转换酶和缓激肽酶Ⅱ实质上为同一种酶，ACEI不仅抑制AngⅡ的生成，而且阻止缓激肽的分解而增加内源性缓激肽水平，内源性缓激肽通过缓激肽β 2 受体刺激PGI 2 和NO的产生，BK、PGI 2 、NO有抑制PMN和血小板聚集作用 [17] 。Guba等 [18] 在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型中发现，在细胞培养液中加入IL-2或对细胞进行缺O 2 处理可使ECs表达ICAM-1增多，但是事先用Enalapril加入培养液，然后再进行上述处理，可使ECs表达的ICAM-1明显下降，用Losartan预处理却无上述作用。Enalapril为血管紧张素酶抑制剂，减少Ang-Ⅱ的生成，还可减少缓激肽的降解而增加内源性缓激肽的水平，而后者可通过缓激肽β 2 受体刺激NO的生成，而起到预适应的保护作用，而Losartan为Ang-Ⅱ受体拮抗剂，不能使BK生成增多，故无预适应的保护作用。上述实验和我们的研究表明卡托普利可以使ECs在缺氧/复氧时ICAM-1表达减少，应用缓激肽β 2 受体阻滞剂HOE140和NOS阻滞剂L-NAME后，卡托普利的上述作用消失，说明卡托普利使H/R时ICAM-1表达减少主要是通过缓激肽起作用的。(3)H/R使ICAM-1的表达增加是由于H/R时内皮细胞产生大量的氧自由基 [19] ，而卡托普利为含巯基(-SH)的ACEI能直接清除氧自由基，防止脂质过氧化 [20] ，卡托普利还可以保护清除氧自由基的酶系统，减轻其毒性作用，同时抑制其炎性因子释放，使粘附分子表达下调，抑制PMN和单核细胞的粘附聚集和激活以及释放氧自由基，阻断炎性反应致再灌注损伤这一途径。(4)H/R使内皮细胞产生大量的超氧阴离子和H 2 O 2 ，激活NF-κB，使ICAM-1表达增加 [21，22] ，我们的研究证实应用NF-κB阻滞剂PDTC可使卡托普利的保护作用消失，表明卡托普利预适应可以使ECs在缺氧及复氧时ICAM-1的表达减少，核因子NF-κB在此也起作用。
通过本实验可以证实缺氧复氧可使ECs的存活率明显下降，并且ICAM-1表达增高，卡托普利预适应可以使ECs的存活率增加，表达ICAM-1减少，对ECs有保护作用，此种作用具有剂量依赖性。应用缓激肽β 2 受体阻滞剂、PKC阻滞剂、一氧化氮合酶阻滞剂和NF-κB阻滞剂后，卡托普利预适应的保护作用消失。卡托普利预适应使H/R时ECs表达ICAM-1减少，此过程涉及缓激肽β 2 受体，PKC途径，一氧化氮和核因子等多种因素参与。
参考文献
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作者单位:1 132002吉林省吉林市二医院心内科
2 吉林大学第一临床医院心内科
3 吉林省吉林市肿瘤医院内科
(收稿日期:2004-09-08) (编辑黄 杰), http://www.100md.com(庄玉红 郑杨 陈彤宇)
关键词 内皮细胞 缺氧复氧损伤 卡托普利 预适应ICAM-1
反复短暂的缺血刺激使心肌对随后较长时间的持续缺血产生适应的现象称为缺血预适应(Ischemic Precondition-ing，IPC)，这是Murry等在1986年提出的 [1] 。现大量的研究表明，IPC的保护作用不仅存在于心肌细胞，还存在于机体实质脏器的血管内皮细胞 [2～5] 。目前的研究认为IPC对ECs的保护作用与氧自由基、腺苷、热休克蛋白、K ATP 通道的开放、钙基因相关肽、细胞凋亡相关基因等有关。但是经典缺血预适应的反复短暂缺血本身是对机体的一种损伤，根据IPC的机制，人们相继又开展了缺氧预适应、快速起搏预适应和药物预适应 [6～8] 。ICAM-1在缺血再灌注损伤(is-chemic reperfusion injury，IRI)中发挥着主要的作用，随着各种预适应的开展，可使其在I/R中表达下调，使其介导的内皮细胞和中性粒细胞的粘附聚集作用减弱，减少炎性反应，从而达到保护内皮细胞及脏器实质细胞的作用，为临床开辟新的治疗前景。我们采用卡托普利药物预适应的方法，在细胞水平上观察卡托普利药物预适应对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧复氧(Hypoxia/Reoxygenationing，H/R)时细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的变化，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 人脐静脉内皮细胞株ECV304(中科院上海细胞库);IMDM培养基(含青霉素100U/ml+链霉素100U/ml+10%胎牛血清)(Sigma Chemical Co.USA);卡托普利纯品(中美上海施贵宝公司馈赠);缓激肽β 2 受体阻滞剂(HOE140)，PKC阻滞剂(Chelerythrine)，一氧化氮合酶阻滞剂(L-NAME)和NF-κB阻滞剂(PDTC)(Sigma.USA);ICAM-1荧光抗体(eBioscience公司，USA);二氧化碳孵箱(RKI日本);流式细胞仪(Becton Dickinson Facscalibur，USA)。
1.2 方法 取ECV304细胞培养于IMDM培养基中，放于37.0℃、5%CO 2 饱和湿度培养箱培养，每2～3天换液1次，倒置显微镜下观察呈单层铺路石状镶嵌排列，即可传代。取培养至第3代的ECV304细胞，弃去培养液，换缺氧培养液 [9] 每瓶0.6ml，用高纯度的氮气饱和，将充满氮气的细胞培养瓶的瓶盖儿拧紧，放于37.0℃、5%CO 2 饱和湿度培养箱内缺氧培育2h。然后弃去缺氧培养液，更换预先有氧平衡的复氧培养液 [9] 0.6ml，放于37.0℃、5%CO 2 饱和湿度培养箱内复氧培育6h，建立缺氧复氧模型。
1.3 实验分组 实验共随机分7组:(1)对照组(C):细胞置IMDM培养基中于5%CO 2 、37.0℃饱和湿度培养箱中培养。(2)缺氧复氧组(H/R):细胞于上述缺氧条件下缺氧2h后，全量换以复氧液，并恢复5%CO 2 气体环境分别培养6h。(3)卡托普利预处理组(CAP):不同浓度的卡托普利(10 -2 ，10 -3 ，10 -4 mol/L)加入实验组细胞培养瓶中，刺激24h后对ECs行缺氧2h复氧6h方案。(4)卡托普利+HOE140(浓度为10 -5 mol/L)组。(5)卡托普利+PKC阻滞剂(浓度为10 -5 mol/L)组。(6)卡托普利+L-NAME(浓度为10 -5 mol/L)组。(7)卡托普利+PDTC(浓度为10 -5 mol/L)组。(4～7组)四种阻滞剂分别加入实验组细胞培养瓶中，30min后再加入卡托普利，卡托普利终浓度为10 -2 mol/L，与阻滞剂共同孵育ECs，24h后行缺氧2h复氧6h方案。
1.4 观察指标
1.4.1 细胞计数 取待测的细胞悬液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml(死细胞着色)，混合后滴入血球计数盘内，按WBC计数法，于低倍镜下计数4角的4个大格内的活细胞(透明未着色)总数，然后按下式计数:细胞浓度(细胞数/ml)=4个大格内的活细胞总数÷4×10 4 ×稀释倍数(10);细胞存活率(%)=活细胞数÷(活细胞数+死细胞数)×100%。
1.4.2 ICAM-1蛋白表达测定 结束实验时，弃去复氧液，用0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合液消化，PBS收集细胞，调整细胞浓度为1×10 6 个/ml的细胞悬液加入试管中，1200～1600r/min离心10min，弃上清，在每个试管中加入ICAM-1单克隆荧光抗体20μl重悬细胞，其中一试管用抗鼠IgG代替抗体做阴性对照。4℃孵育1h，10倍量PBS重悬，离心弃上清;0.5ml PBS重悬细胞，上机测定前将细胞悬液充分震荡，使细胞分散成单个，用流式细胞仪(激光光源为氩离子液光，波长为488nm)检测其平均荧光强度，每个观察值检测3次。用平均荧光强度表示着色细胞的阳性值，每一样品的检测均设阴性对照，阳性值为:(待测样品平均荧光强度-阴性对照平均荧光强度)÷阴性对照平均荧光强度。
1.5 统计学处理 结果以均数±标准差(ˉx±s)表示，数据处理采用t检验，P<0.05表示统计学上差异有显著性。
2 结果
2.1 缺氧复氧组使HUVEC的存活率明显下降(C组:89.5±5.7%;H/R组:62.1±1.9%;n=3;P<0.05)。卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)与缺氧复氧组相比使HUVEC的存活率增加(86.7±4.6%，P<0.05)，见表1。
表1 缺氧复氧损伤对内皮细胞存活率的影响 (略)
2.2 正常培养的对照组HUVEC的ICAM-1呈持续低水平表达(3.9±0.5)，缺氧复氧组使HUVEC的ICAM-1表达较对照组明显增加(10.2±0.6)(P<0.05)。卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)使HUVEC的ICAM-1表达(5.9±0.3)较单纯缺氧复氧组(10.0±0.6)明显降低(P<0.05)，且卡托普利预适应组(10 -3 mol/L)使HUVEC的ICAM-1表达(6.9±0.3)、卡托普利预适应组(10 -4 mol/L)使HUVEC的ICAM-1表达(7.2±0.6)分别与缺氧复氧组比较P均<0.05，卡托普利预适应组(10 -4 mol/L)(7.2±0.6)与卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)(5.9±0.3)比较P值亦<0.05，但卡托普利预适应组(10 -4 mol/L)与卡托普利预适应组(10 -3 mol/L)比较以及卡托普利预适应组(10 -3 mol/L)与卡托普利预适应组(10 -2 mol/L)比较没有统计学意义。给予上述四种阻滞剂缓激肽β 2 受体阻滞剂(HOE140)，PKC阻滞剂(Chelery-thrine)，一氧化氮合酶阻滞剂(L-NAME)和NF-κB阻滞剂(PDTC)后上述卡托普利预适应的作用被清除，ICAM-1的表达明显增加(P<0.05)。见表2。
表2 缺氧复氧损伤对内皮细胞ICAM-1表达的影响 (略)
3 讨论
氧自由基损伤、钙超载和炎症浸润是目前缺血再灌注损伤比较公认的机制 [10，11] 。缺血再灌注导致内皮功能障碍，内源性NO生成减少，抑制中性粒细胞(Polymorphonucle-ar Neutrophil Leukocyte，PMN)粘附聚集作用减弱 [12] ，PMN机械性阻塞毛细血管，诱发氧耗量增加及氧自由基产生 [13] ，导致再灌注损伤。白细胞、内皮细胞粘附机制是炎症反应的重要环节。而ICAM-1是介导PMN与内皮细胞粘附的主要粘附分子，在IRI中起重要作用。通过阻断粘附分子ICAM-1而有效地保护内皮细胞是预防和治疗再灌注损伤的关键。故我们的实验用HUVEC代表血管内皮细胞，使之在缺氧(2h)/复氧(6h)环境中观察ICAM-1的表达及卡托普利预适应对此表达的影响和作用机制。我们的实验结果为:(1)缺氧复氧组使ECs的存活率明显下降(C组:89.5±5.7%;H/R组:62.1±1.9%;n=3;P<0.05)，卡托普利预适应组与缺氧复氧组相比使ECs的存活率增加(86.7±4.6%，P<0.05)，这与Fujita等 [14] 的实验相符，ACEI能减轻缺氧再氧化引起的细胞损伤和细胞凋亡。(2)对照组ECs的ICAM-1呈持续低水平表达(3.9±0.5)，缺氧复氧组使ECs的ICAM-1表达明显增加(10.2±0.6)，与对照组相比较增加约3倍(P<0.05)，卡托普利预适应组(CAP)(10 -2 mol/L)使ECs的ICAM-1表达(5.9±0.3)较单纯缺氧复氧组明显降低(P<0.05)，且有剂量依赖性，但给予缓激肽β 2 受体阻滞剂HOE140后，ICAM-1的表达(8.8±0.7)较CAP组增加，说明卡托普利使ECs在H/R时ICAM-1表达减少有缓激肽的作用。同理在应用PKC阻滞剂Chelerythrine、一氧化氮合酶阻滞剂L-NAME、NF-κB阻滞剂PDTC后上述卡托普利预适应的作用亦被清除。表明，卡托普利预适应可以使ECs在缺氧及复氧时ICAM-1的表达减少，它是由PKC和NO途径介导的，核因子亦参与此作用。
通过本实验，可以表明卡托普利预适应对内皮细胞有保护作用，使内皮细胞在缺氧复氧时ICAM-1的表达减少。其作用机制为:(1)卡托普利为血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，能抑制AngⅠ的转化，减少AngⅡ的生成，有效地阻断AngⅡ的生物学效应。AngⅡ可损伤血管ECs，使一氧化氮合酶(NOS)活性下降，NO合成减少。研究发现NO可扩张血管，抑制血小板及中性粒细胞在内皮细胞上的粘附和聚集，减少自由基生成，防止钙超载等。AngⅡ还可通过调节前炎性因子TNF-α、白细胞介素(IL)的分泌，参与炎症过程调控，促进粘附分子表达 [15] 。Pastore等 [16] 用AngⅡ(1mol/L-1μmol/L)与HUVEC共同培育2h后发现，ECs表面ICAM-1mRNA明显增高，培养基可溶性ICAM-1释放也增高(P<0.002)。上述实验和我们的研究表明卡托普利可以使ECs在缺氧/复氧时ICAM-1表达减少，有可能是通过阻断AngⅡ的生物学效应而实现的。因为我们未做AngⅡ受体拮抗剂对H/R时ICAM-1表达的对照无法下肯定结论。(2)血管紧张素转换酶和缓激肽酶Ⅱ实质上为同一种酶，ACEI不仅抑制AngⅡ的生成，而且阻止缓激肽的分解而增加内源性缓激肽水平，内源性缓激肽通过缓激肽β 2 受体刺激PGI 2 和NO的产生，BK、PGI 2 、NO有抑制PMN和血小板聚集作用 [17] 。Guba等 [18] 在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型中发现，在细胞培养液中加入IL-2或对细胞进行缺O 2 处理可使ECs表达ICAM-1增多，但是事先用Enalapril加入培养液，然后再进行上述处理，可使ECs表达的ICAM-1明显下降，用Losartan预处理却无上述作用。Enalapril为血管紧张素酶抑制剂，减少Ang-Ⅱ的生成，还可减少缓激肽的降解而增加内源性缓激肽的水平，而后者可通过缓激肽β 2 受体刺激NO的生成，而起到预适应的保护作用，而Losartan为Ang-Ⅱ受体拮抗剂，不能使BK生成增多，故无预适应的保护作用。上述实验和我们的研究表明卡托普利可以使ECs在缺氧/复氧时ICAM-1表达减少，应用缓激肽β 2 受体阻滞剂HOE140和NOS阻滞剂L-NAME后，卡托普利的上述作用消失，说明卡托普利使H/R时ICAM-1表达减少主要是通过缓激肽起作用的。(3)H/R使ICAM-1的表达增加是由于H/R时内皮细胞产生大量的氧自由基 [19] ，而卡托普利为含巯基(-SH)的ACEI能直接清除氧自由基，防止脂质过氧化 [20] ，卡托普利还可以保护清除氧自由基的酶系统，减轻其毒性作用，同时抑制其炎性因子释放，使粘附分子表达下调，抑制PMN和单核细胞的粘附聚集和激活以及释放氧自由基，阻断炎性反应致再灌注损伤这一途径。(4)H/R使内皮细胞产生大量的超氧阴离子和H 2 O 2 ，激活NF-κB，使ICAM-1表达增加 [21，22] ，我们的研究证实应用NF-κB阻滞剂PDTC可使卡托普利的保护作用消失，表明卡托普利预适应可以使ECs在缺氧及复氧时ICAM-1的表达减少，核因子NF-κB在此也起作用。
通过本实验可以证实缺氧复氧可使ECs的存活率明显下降，并且ICAM-1表达增高，卡托普利预适应可以使ECs的存活率增加，表达ICAM-1减少，对ECs有保护作用，此种作用具有剂量依赖性。应用缓激肽β 2 受体阻滞剂、PKC阻滞剂、一氧化氮合酶阻滞剂和NF-κB阻滞剂后，卡托普利预适应的保护作用消失。卡托普利预适应使H/R时ECs表达ICAM-1减少，此过程涉及缓激肽β 2 受体，PKC途径，一氧化氮和核因子等多种因素参与。
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作者单位:1 132002吉林省吉林市二医院心内科
2 吉林大学第一临床医院心内科
3 吉林省吉林市肿瘤医院内科
(收稿日期:2004-09-08) (编辑黄 杰), http://www.100md.com(庄玉红 郑杨 陈彤宇)