人BMP II型受体胞外区cDNA细菌表面呈现载体的构建
关键词: hBMPR-II;基因克隆;表达载体
0 引言
骨形成蛋白(BMP)受体有I型和II型两种，属于TGF-β受体超家族成员，都具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性.人BMP II型受体cDNA全长3871bp，编码1039个氨基酸的蛋白，包括125个氨基酸的胞外区[1] .TGF-β超家族信号转导的一般模式为:配体先与II型受体结合再与I型受体形成复合物，通过受体激酶激活下游信号传导分子[2] .我们用PCR方法扩增出hBMPR-II胞外区cDNA，测序正确后，成功将其定向克隆入细菌表面呈现载体pLβ2，为其表达及研究BMP结合活性等打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料
pUC19质粒和大肠杆菌JM109为本实验室保存，pLβ2表达载体由第二军医大学王雨田博士提供.hBM-PR-II全长cDNA基因由美国Joan Massague教授惠赠.
1.2 PCR反应
设计一对扩增hBMPR-II胞外区基因的特异引物，在5'和3'端分别加入NcoI和BamHI酶切位点.以hBMPR-II全长cDNA为模板作PCR反应.
1.3 重组质粒构建
PCR扩增产物纯化后与HincII酶切的pUC19质粒连接，转化大肠杆菌JM109，构建重组质粒pUC-BRII.
1.4 序列测定
在PE公司ABI310型全自动序列分析仪进行.
1.5 表达载体构建与鉴定
用NcoI和BamHI自重组质粒pUC-BRII切下hBMPR-II胞外区cDNA片段，约400bp，连接入相同双酶消化的pLβ2中，构建其表达载体pLβ2-BRII.并用NcoI和BamHI双酶切鉴定.
2 结果
2.1 PCR结果
PCR扩增出与预期大小一致的特异性条带约400bp.
2.2 hBMPR-II重组质粒构建
将扩增的hBMPR-II胞外区cDNA基因克隆入pUC19中，经EcoRI和HindIII双酶切，可见约400bp的片段;用BamHI单酶消化时，反向插入者可切下约400bp的片段(图1)，而正向插入者未见切下片段.
2.3 序列测定
取正向插入的1个重组质粒进行序列测定，结果与已知人BMP II型受体胞外区cDNA基因序列进行比较，证实两者完全一致，命名为pUC-BRII.
2.4 pLβ2-BRII表达载体构建与鉴定
NcoI和BamHI双酶切鉴定，pLβ2空载体可切下800bp LamB基因片段，而重组表达质粒pLβ2-BRII只切下约400bp的片段，大小与hBM-PR-II胞外区cDNA长度相符(图2).
3 讨论
BMP属于TGF-β超家族成员，不仅对骨骼的发育和再生修复起决定性作用，而且对胚胎发育有重要意义[3] .BMP受体也属于TGF-β受体超家族，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，BMP与I和II受体均可结合，其信号转导也有赖于BMP与两种受体形成复合物[2] .因BMP能单独与II型受体结合，而pLβ2为细菌表面呈现表达载体，在其强启动子Ptac后，编码有大肠杆菌表面蛋白LamB的信号序列及其N端279个氨基酸序列，因此，将hBMPR-II胞外区嵌合其后，就可能在大肠杆菌菌膜上呈现hBMPR-II胞外区[4] .本研究目的旨在利用微生物表面呈现技术，将hBMPR-II胞外区表达于大肠杆菌菌膜上，构建功能性表达hBMPR-II胞外区的大肠杆菌模型.这将为hBMPR-II功能结构的深入研究、BMP与受体结合活性研究等提供新的方法和途径.
参考文献:
[1]Liu F，Ventura F，Doody J.Human type II receptor for bone morphogenic proteins(BMPs):Extension of the two-kinase re-ceptor model to the BMPs [J].Molecular and Cellular Biol，1995;15:3479-3486.
[2]Yingling JM，Wang XF，Bassing CH.Signalling by the trans-forming growth factor-receptors [J].Biochim Biophys Acta，1995;1242:115-136.
[3]Johnsson BM，Wiles MV.Evidence for involvement of activin A and BMP4in mammalian mesoderm and hematopoietic develop-ment [J].Mol Cell Biol，1995;15:144-148.
[4]Strosberg AD，Marullo S.Functional expression of receptors in microorganisms [J].TIPS，1992;13(3):95-98.
基金项目: 全军医药卫生科研基金重点课题(96Z045)
作者简介: 朱帮福(1969-)，男(汉族)，安徽省霍邱县人.博士，讲师.Tel.(029)3374516Ext.13
(第四军医大学:1 基础部生物化学教研室，2 西京医院心脏外科，陕西西安710033)
编辑 许福明
收稿日期:2000-11-20, http://www.100md.com(朱帮福 ，蒲勤 ，张斌 ，金振晓 ，柴玉波 ，陈南春，陈苏民)
0 引言
骨形成蛋白(BMP)受体有I型和II型两种，属于TGF-β受体超家族成员，都具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性.人BMP II型受体cDNA全长3871bp，编码1039个氨基酸的蛋白，包括125个氨基酸的胞外区[1] .TGF-β超家族信号转导的一般模式为:配体先与II型受体结合再与I型受体形成复合物，通过受体激酶激活下游信号传导分子[2] .我们用PCR方法扩增出hBMPR-II胞外区cDNA，测序正确后，成功将其定向克隆入细菌表面呈现载体pLβ2，为其表达及研究BMP结合活性等打下基础.
1 材料和方法
1.1 材料
pUC19质粒和大肠杆菌JM109为本实验室保存，pLβ2表达载体由第二军医大学王雨田博士提供.hBM-PR-II全长cDNA基因由美国Joan Massague教授惠赠.
1.2 PCR反应
设计一对扩增hBMPR-II胞外区基因的特异引物，在5'和3'端分别加入NcoI和BamHI酶切位点.以hBMPR-II全长cDNA为模板作PCR反应.
1.3 重组质粒构建
PCR扩增产物纯化后与HincII酶切的pUC19质粒连接，转化大肠杆菌JM109，构建重组质粒pUC-BRII.
1.4 序列测定
在PE公司ABI310型全自动序列分析仪进行.
1.5 表达载体构建与鉴定
用NcoI和BamHI自重组质粒pUC-BRII切下hBMPR-II胞外区cDNA片段，约400bp，连接入相同双酶消化的pLβ2中，构建其表达载体pLβ2-BRII.并用NcoI和BamHI双酶切鉴定.
2 结果
2.1 PCR结果
PCR扩增出与预期大小一致的特异性条带约400bp.
2.2 hBMPR-II重组质粒构建
将扩增的hBMPR-II胞外区cDNA基因克隆入pUC19中，经EcoRI和HindIII双酶切，可见约400bp的片段;用BamHI单酶消化时，反向插入者可切下约400bp的片段(图1)，而正向插入者未见切下片段.
2.3 序列测定
取正向插入的1个重组质粒进行序列测定，结果与已知人BMP II型受体胞外区cDNA基因序列进行比较，证实两者完全一致，命名为pUC-BRII.
2.4 pLβ2-BRII表达载体构建与鉴定
NcoI和BamHI双酶切鉴定，pLβ2空载体可切下800bp LamB基因片段，而重组表达质粒pLβ2-BRII只切下约400bp的片段，大小与hBM-PR-II胞外区cDNA长度相符(图2).
3 讨论
BMP属于TGF-β超家族成员，不仅对骨骼的发育和再生修复起决定性作用，而且对胚胎发育有重要意义[3] .BMP受体也属于TGF-β受体超家族，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，BMP与I和II受体均可结合，其信号转导也有赖于BMP与两种受体形成复合物[2] .因BMP能单独与II型受体结合，而pLβ2为细菌表面呈现表达载体，在其强启动子Ptac后，编码有大肠杆菌表面蛋白LamB的信号序列及其N端279个氨基酸序列，因此，将hBMPR-II胞外区嵌合其后，就可能在大肠杆菌菌膜上呈现hBMPR-II胞外区[4] .本研究目的旨在利用微生物表面呈现技术，将hBMPR-II胞外区表达于大肠杆菌菌膜上，构建功能性表达hBMPR-II胞外区的大肠杆菌模型.这将为hBMPR-II功能结构的深入研究、BMP与受体结合活性研究等提供新的方法和途径.
参考文献:
[1]Liu F，Ventura F，Doody J.Human type II receptor for bone morphogenic proteins(BMPs):Extension of the two-kinase re-ceptor model to the BMPs [J].Molecular and Cellular Biol，1995;15:3479-3486.
[2]Yingling JM，Wang XF，Bassing CH.Signalling by the trans-forming growth factor-receptors [J].Biochim Biophys Acta，1995;1242:115-136.
[3]Johnsson BM，Wiles MV.Evidence for involvement of activin A and BMP4in mammalian mesoderm and hematopoietic develop-ment [J].Mol Cell Biol，1995;15:144-148.
[4]Strosberg AD，Marullo S.Functional expression of receptors in microorganisms [J].TIPS，1992;13(3):95-98.
基金项目: 全军医药卫生科研基金重点课题(96Z045)
作者简介: 朱帮福(1969-)，男(汉族)，安徽省霍邱县人.博士，讲师.Tel.(029)3374516Ext.13
(第四军医大学:1 基础部生物化学教研室，2 西京医院心脏外科，陕西西安710033)
编辑 许福明
收稿日期:2000-11-20, http://www.100md.com(朱帮福 ，蒲勤 ，张斌 ，金振晓 ，柴玉波 ，陈南春，陈苏民)