人组织era基因mRNA的表达谱
关键词: 基因;核酸杂交;基因表达;人era基因
摘 要:目的 研究人era基因mRNA在不同组织、不同细胞系的表达水平. 方法 用α([
32 p]dCTP标记人era编码区基因作为探针，分别用Northern杂交和斑点杂交分析含12种不同成人组织mRNA的Multiple tissue northern(MTN)blot膜和含76种成人、胎儿及常用细胞系mRNA的Multiple tissue expression(MTE)array膜，并用同位素扫描系统对杂交结果进行图像分析. 结果 Northern blot杂交所检测的12种组织中均有位于2.2kb处的杂交条带，斑点杂交显示人era mRNA在所检测的76种组织中均有表达，但表达水平有很大差异，在神经系统、某些胎儿组织以及某些肿瘤细胞中高表达. 结论 人era mRNA表达于所有检测的组织或细胞系，可能为一种组成性表达的基因.
Tissues expression of human era gene mRNA
JI Zong-Ling，CHAI Yu-Bo，CHEN Su-Min，ZHANG Jun-Jie，CHEN Nan-Chun，WU Yuan-Ming
Department of Biochemistry&Molecular Biology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:genes;nucleic acid hybridization;gene expres-sion;human era
Abstract:AIM To examine the expression levels of human era mRNA in different tissues or tumor cell lines.METH┐ODS Human era encoding region gene labeled with([32 p] dCTP was used as a probe and its mRNA levels were exam-ined in multiple tissue northern(MTN)blot membrane and multiple tissue expression(MTE)array membrane by North-ern blot and Dot blot hybridization respectively.RESULTS Northern blot showed the probe identified an mRNA product of approximately2.2kb，and Dot blot showed human era ex-pressed in all tissues and cell lines，the highest expression found in the nervous system，some fetal tissues and tumor cell lines.CONCLUSION Human era mRNA expresses in all tissues tested at different levels，so it may be a constitu-tively expressing gene.
0 引言
era是大肠杆菌正常表达的基因[1，2] ，其编码的蛋白质是细菌分裂周期的关卡调控因子.是一个独特的蛋白家族[3，4] .我们率先从胎脑中克隆了人era的全长cDNA，其编码区由1038bp组成.人Era与大肠杆菌Era[5] 具有相似的结构，均具有N端的GTP结合区和C端的与RNA结合相关的KH结构域，但人的Era在N端和C端之间有一段长186bp的独特的插入区序列，可能使人Era具有与细菌Era显著不同的空间结构.目前关于人Era的生物学功能、理化性质尚无报道.我们用Northern杂交和斑点杂交对这一人类新基因mRNA的组织表达分布进行了研究[6] ，以期为深入研究该基因功能奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料
含人era基因全长cDNA的pBS-hera质粒为本课题组构建并保存，Taq酶购自华美公司，DNA纯化试剂盒购自Qiagen公司;Multiple tissue Northern(MTN)blot和Multiple tissue expression(MTE)array系统购自Clontech公司;放射性同位素([32 p]dCTP为北京亚辉公司产品;rediprimen TM Ⅱ随机引物标记系统以及Storm860同位素及荧光标记两用激光扫描成像系统购自Pharmacia公司.
1.2 方法
设计并合成扩增人era编码区基因的一对引物.5'引物:ATG AAC AGA GAT GAG CAG GAT GTC C;3'引物:TCC TC C CTT GAG GAG CTT CAC AGA GAG.取pBS-hera质粒0.02μg做模板，10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol L-1 dNTP3μL，上下游引物各50pmol，Taq酶2U，加双蒸水至50μL.PCR反应在PE9600型PCR仪上进行，反应条件为94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸30s，共30个循环，最后一个循环72℃延伸10min，取PCR产物10μL进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像仪上成像.将扩增产物进行纯化，紫外分光光度计定量.探针标记取纯化后的era基因产物25ng，溶于TE缓冲液45μL，沸水浴5min，立即冰浴以变性DNA，加入rediprimer
TM Ⅱ随机引物标记系统的反应管中，加入[32 p]dCTP5μL(1.85MBq)混匀，37℃1h，经变性、离心后加入0.2mol L-1 EDTA终止反应，作为杂交探针.Northern blot和斑点杂交按Clontech MTE和MTN blot说明书进行杂交、洗膜、压磷屏.用Storm860同位素及荧光标记两用激光扫描成像系统进行磷屏扫描和图像分析.
2 结果
2.1 人era编码区基因的扩增
用设计合成的一对era基因的扩增引物，从pBS-hera质粒中扩增出人era编码区基因，琼脂糖凝胶电泳表明有约1kb的特异扩增条带，与预期大小相符(1038bp，Fig1).经纯化测A 260nm ，A280nm 表明获得纯度较好的DNA扩增产物.
2.2 Northern blot杂交
在12种组织中均有位于2.2kb处的杂交条带(Fig2)，经同位素扫描成像系统进行扫描和图像分析，杂交信号由强到弱依次为:骨骼肌(2240)、心脏(1671)、肾脏(1544)、肝脏(887)、 胎盘(462)、脑(434)、小肠(247)、脾脏(241)、肺(208)、结肠(174)、胸腺(126)和外周血淋巴细胞(40).
2.3 斑点杂交
在所检测的76种组织中均有人era表达，但表达水平有很大差异(Fig3)，7种胎儿组织中:胎肺>胎脾>胎肾>胎心>胎肝>胎脑>胸腺;8种肿瘤细胞系中:直肠腺癌细胞系SW480>肺癌细胞系A549>白血病细胞系K-562>HelaS3>白血病细胞系MOLT-4>Burkitt淋巴瘤Daudi>Raji>HL-60;其余61中成人器官和组织中，中枢神经系统的21个不同部位组织中多表达水平较高;心血管系统中心尖、右心室、室间隔、左心室表达水平较主动脉、左右心房高;消化系统中仅升结肠表达水平高;其它组织中杂交信号较强的有骨骼肌、睾丸和乳腺.所有76种检测的组织或细胞系中，甲状腺、心尖部和胎肺杂交信号最强.作为阴性对照的大肠杆菌DNA也显示很强的杂交信号.
3 讨论
人era刚被克隆，目前对于其组织分布、功能研究尚无任何报道.其染色体定位于17q11.2-12，而4型Wilm瘤定位于17q12-23，故推测它与肿瘤有关.我们在已克隆人era全长cDNA的基础上，对其在多种人组织和细胞中mRNA的水平进行了分析.鉴于正常成人组织取材有一定困难，采用Clontech公司的Multiple tissue Northern(MTN)blot和Multi-ple tissue expression(MTE)array系统，其中MTN膜含有12种人组织的mRNA，每种分别为2μg，变性电泳后转移到带阳电荷的尼龙膜上;MTE膜含有不同组织和肿瘤细胞系的mRNA斑点，适用于检测目的基因在76种人组织(包括胎儿和成人)和细胞系中的表达情况.结果表明，人era表达于所有检测的组织或细胞系，可能为一种组成性表达的基因;在神经系统、某些胎儿组织以及某些肿瘤细胞中高表达.以肺为例，人era在检测的所有76种组织中胎肺表达水平最高，肺癌细胞系A549在所检测的几种肿瘤细胞系中表达也较高，而成人肺表达很低，这一趋势提示该基因可能与发育及某些肿瘤相关，比较类似原发性肝癌的辅助诊断指标甲胎蛋白(AFP)，那么人Era是否能成为一种新的肿瘤特异标记物?它与肿瘤的发生、发展以至转移的病理过程之间有哪种关系?这些问题均有待大量的实验去探讨.另外，作为阴性对照的大肠杆菌DNA显示很强的信号，其原因是在细菌中存在era基因，并且与人的era有很高的同源性.一般认为组成性表达的基因可能具有重要的调节功能.Era家族是目前所知唯一兼具GTP酶活性和RNA结合活性的蛋白家族，并且已有证据表明，细菌Era为一种分裂周期的关卡调控分子[7，8] ，提示人Era可能在细胞增殖分化、信息传递、转录调节等方面发挥独特的作用.
致 谢 中心实验室张立红博士在图像分析中给予了帮助.
参考文献:
[1]Chen YJ，Zhang X，Bu XY，Wang ZX，Zhang X.The expres-sion of Fas and Fas ligand in human gliomas [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(1):80-82.
[2]Xu P，Yi DH，Chen P，Wang HS，Hou XB.Expression and lo-calization of TNF-αmRNA in gastric mucosa of CPB rabbit [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(5):636-638.
[3]Liu XL，Ye L，Wang JB，Fan DM.Heat shock protein90βex-pression in human gastric cancer tissues and SGC7901/VCR of MDR-type gastric cancer cell line [J].Di-si Junyi Daxue Xue-bao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(2):131-134.
[4]Zuber M，Hoover TA，Dertzbaugh MT，Court DL.Tularensis DNA clone complements E.coli defective for the production of Era，an essential Ras-like GTP-binding protein [J].Gene，1997;189(1):31-34.
[5]Chen X，Court DL.Crystal structure of ERA:A GTPase-de-pendent cell cycle regulator containing an RNA binding motif [J].Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(2):8396-8401.
[6]Wang PZ，Zhou YX，Bai XF，Fu EQ，Li JG.Quantitative de-tection of hepatitis B virus DNA and its significance [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(7):811-813.
[7]Britton RA，Powell BS，Dasgupta S，Sun Q，Margolin W，Lup-ski JR，Court DL.Cell cycle arrest in Era GTPase mutants:A potential growth rate regulated cell cycle checkpoint in Es-cherichia coli [J].Mol Microbiol，1998;27(13):739-750.
[8]Zhong YQ，Zhu YL，Zhang WH，Chen JK，Wang GF，Jin BQ.Existance and localization of interleukin-8like immunoreactive substances in rat anterior pituitary [J].Di-si Junyi Daxue Xue-bao(J Fourth Mil Med Univ)，1998;19(6):698-701.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(39870380，30000091);全军医药卫生科研基金资助项目(98M108)
作者简介: 纪宗玲(1969-)，女(汉族)，河北省玉田县人.讲师，博士.Tel.(029)3374516Ext.13 通讯联系人:陈苏民Email.chensm@fmmu.edu.cn
(第四军医大学基础部生物化学和分子生物学教研室，陕西西安710033)
编辑 许福明
收稿日期:2001-04-27, 百拇医药(纪宗玲，柴玉波，陈苏民，张俊杰，陈南春，吴元明)
摘 要:目的 研究人era基因mRNA在不同组织、不同细胞系的表达水平. 方法 用α([
32 p]dCTP标记人era编码区基因作为探针，分别用Northern杂交和斑点杂交分析含12种不同成人组织mRNA的Multiple tissue northern(MTN)blot膜和含76种成人、胎儿及常用细胞系mRNA的Multiple tissue expression(MTE)array膜，并用同位素扫描系统对杂交结果进行图像分析. 结果 Northern blot杂交所检测的12种组织中均有位于2.2kb处的杂交条带，斑点杂交显示人era mRNA在所检测的76种组织中均有表达，但表达水平有很大差异，在神经系统、某些胎儿组织以及某些肿瘤细胞中高表达. 结论 人era mRNA表达于所有检测的组织或细胞系，可能为一种组成性表达的基因.
Tissues expression of human era gene mRNA
JI Zong-Ling，CHAI Yu-Bo，CHEN Su-Min，ZHANG Jun-Jie，CHEN Nan-Chun，WU Yuan-Ming
Department of Biochemistry&Molecular Biology，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:genes;nucleic acid hybridization;gene expres-sion;human era
Abstract:AIM To examine the expression levels of human era mRNA in different tissues or tumor cell lines.METH┐ODS Human era encoding region gene labeled with([32 p] dCTP was used as a probe and its mRNA levels were exam-ined in multiple tissue northern(MTN)blot membrane and multiple tissue expression(MTE)array membrane by North-ern blot and Dot blot hybridization respectively.RESULTS Northern blot showed the probe identified an mRNA product of approximately2.2kb，and Dot blot showed human era ex-pressed in all tissues and cell lines，the highest expression found in the nervous system，some fetal tissues and tumor cell lines.CONCLUSION Human era mRNA expresses in all tissues tested at different levels，so it may be a constitu-tively expressing gene.
0 引言
era是大肠杆菌正常表达的基因[1，2] ，其编码的蛋白质是细菌分裂周期的关卡调控因子.是一个独特的蛋白家族[3，4] .我们率先从胎脑中克隆了人era的全长cDNA，其编码区由1038bp组成.人Era与大肠杆菌Era[5] 具有相似的结构，均具有N端的GTP结合区和C端的与RNA结合相关的KH结构域，但人的Era在N端和C端之间有一段长186bp的独特的插入区序列，可能使人Era具有与细菌Era显著不同的空间结构.目前关于人Era的生物学功能、理化性质尚无报道.我们用Northern杂交和斑点杂交对这一人类新基因mRNA的组织表达分布进行了研究[6] ，以期为深入研究该基因功能奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料
含人era基因全长cDNA的pBS-hera质粒为本课题组构建并保存，Taq酶购自华美公司，DNA纯化试剂盒购自Qiagen公司;Multiple tissue Northern(MTN)blot和Multiple tissue expression(MTE)array系统购自Clontech公司;放射性同位素([32 p]dCTP为北京亚辉公司产品;rediprimen TM Ⅱ随机引物标记系统以及Storm860同位素及荧光标记两用激光扫描成像系统购自Pharmacia公司.
1.2 方法
设计并合成扩增人era编码区基因的一对引物.5'引物:ATG AAC AGA GAT GAG CAG GAT GTC C;3'引物:TCC TC C CTT GAG GAG CTT CAC AGA GAG.取pBS-hera质粒0.02μg做模板，10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol L-1 dNTP3μL，上下游引物各50pmol，Taq酶2U，加双蒸水至50μL.PCR反应在PE9600型PCR仪上进行，反应条件为94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸30s，共30个循环，最后一个循环72℃延伸10min，取PCR产物10μL进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像仪上成像.将扩增产物进行纯化，紫外分光光度计定量.探针标记取纯化后的era基因产物25ng，溶于TE缓冲液45μL，沸水浴5min，立即冰浴以变性DNA，加入rediprimer
TM Ⅱ随机引物标记系统的反应管中，加入[32 p]dCTP5μL(1.85MBq)混匀，37℃1h，经变性、离心后加入0.2mol L-1 EDTA终止反应，作为杂交探针.Northern blot和斑点杂交按Clontech MTE和MTN blot说明书进行杂交、洗膜、压磷屏.用Storm860同位素及荧光标记两用激光扫描成像系统进行磷屏扫描和图像分析.
2 结果
2.1 人era编码区基因的扩增
用设计合成的一对era基因的扩增引物，从pBS-hera质粒中扩增出人era编码区基因，琼脂糖凝胶电泳表明有约1kb的特异扩增条带，与预期大小相符(1038bp，Fig1).经纯化测A 260nm ，A280nm 表明获得纯度较好的DNA扩增产物.
2.2 Northern blot杂交
在12种组织中均有位于2.2kb处的杂交条带(Fig2)，经同位素扫描成像系统进行扫描和图像分析，杂交信号由强到弱依次为:骨骼肌(2240)、心脏(1671)、肾脏(1544)、肝脏(887)、 胎盘(462)、脑(434)、小肠(247)、脾脏(241)、肺(208)、结肠(174)、胸腺(126)和外周血淋巴细胞(40).
2.3 斑点杂交
在所检测的76种组织中均有人era表达，但表达水平有很大差异(Fig3)，7种胎儿组织中:胎肺>胎脾>胎肾>胎心>胎肝>胎脑>胸腺;8种肿瘤细胞系中:直肠腺癌细胞系SW480>肺癌细胞系A549>白血病细胞系K-562>HelaS3>白血病细胞系MOLT-4>Burkitt淋巴瘤Daudi>Raji>HL-60;其余61中成人器官和组织中，中枢神经系统的21个不同部位组织中多表达水平较高;心血管系统中心尖、右心室、室间隔、左心室表达水平较主动脉、左右心房高;消化系统中仅升结肠表达水平高;其它组织中杂交信号较强的有骨骼肌、睾丸和乳腺.所有76种检测的组织或细胞系中，甲状腺、心尖部和胎肺杂交信号最强.作为阴性对照的大肠杆菌DNA也显示很强的杂交信号.
3 讨论
人era刚被克隆，目前对于其组织分布、功能研究尚无任何报道.其染色体定位于17q11.2-12，而4型Wilm瘤定位于17q12-23，故推测它与肿瘤有关.我们在已克隆人era全长cDNA的基础上，对其在多种人组织和细胞中mRNA的水平进行了分析.鉴于正常成人组织取材有一定困难，采用Clontech公司的Multiple tissue Northern(MTN)blot和Multi-ple tissue expression(MTE)array系统，其中MTN膜含有12种人组织的mRNA，每种分别为2μg，变性电泳后转移到带阳电荷的尼龙膜上;MTE膜含有不同组织和肿瘤细胞系的mRNA斑点，适用于检测目的基因在76种人组织(包括胎儿和成人)和细胞系中的表达情况.结果表明，人era表达于所有检测的组织或细胞系，可能为一种组成性表达的基因;在神经系统、某些胎儿组织以及某些肿瘤细胞中高表达.以肺为例，人era在检测的所有76种组织中胎肺表达水平最高，肺癌细胞系A549在所检测的几种肿瘤细胞系中表达也较高，而成人肺表达很低，这一趋势提示该基因可能与发育及某些肿瘤相关，比较类似原发性肝癌的辅助诊断指标甲胎蛋白(AFP)，那么人Era是否能成为一种新的肿瘤特异标记物?它与肿瘤的发生、发展以至转移的病理过程之间有哪种关系?这些问题均有待大量的实验去探讨.另外，作为阴性对照的大肠杆菌DNA显示很强的信号，其原因是在细菌中存在era基因，并且与人的era有很高的同源性.一般认为组成性表达的基因可能具有重要的调节功能.Era家族是目前所知唯一兼具GTP酶活性和RNA结合活性的蛋白家族，并且已有证据表明，细菌Era为一种分裂周期的关卡调控分子[7，8] ，提示人Era可能在细胞增殖分化、信息传递、转录调节等方面发挥独特的作用.
致 谢 中心实验室张立红博士在图像分析中给予了帮助.
参考文献:
[1]Chen YJ，Zhang X，Bu XY，Wang ZX，Zhang X.The expres-sion of Fas and Fas ligand in human gliomas [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(1):80-82.
[2]Xu P，Yi DH，Chen P，Wang HS，Hou XB.Expression and lo-calization of TNF-αmRNA in gastric mucosa of CPB rabbit [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(5):636-638.
[3]Liu XL，Ye L，Wang JB，Fan DM.Heat shock protein90βex-pression in human gastric cancer tissues and SGC7901/VCR of MDR-type gastric cancer cell line [J].Di-si Junyi Daxue Xue-bao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(2):131-134.
[4]Zuber M，Hoover TA，Dertzbaugh MT，Court DL.Tularensis DNA clone complements E.coli defective for the production of Era，an essential Ras-like GTP-binding protein [J].Gene，1997;189(1):31-34.
[5]Chen X，Court DL.Crystal structure of ERA:A GTPase-de-pendent cell cycle regulator containing an RNA binding motif [J].Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(2):8396-8401.
[6]Wang PZ，Zhou YX，Bai XF，Fu EQ，Li JG.Quantitative de-tection of hepatitis B virus DNA and its significance [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(7):811-813.
[7]Britton RA，Powell BS，Dasgupta S，Sun Q，Margolin W，Lup-ski JR，Court DL.Cell cycle arrest in Era GTPase mutants:A potential growth rate regulated cell cycle checkpoint in Es-cherichia coli [J].Mol Microbiol，1998;27(13):739-750.
[8]Zhong YQ，Zhu YL，Zhang WH，Chen JK，Wang GF，Jin BQ.Existance and localization of interleukin-8like immunoreactive substances in rat anterior pituitary [J].Di-si Junyi Daxue Xue-bao(J Fourth Mil Med Univ)，1998;19(6):698-701.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(39870380，30000091);全军医药卫生科研基金资助项目(98M108)
作者简介: 纪宗玲(1969-)，女(汉族)，河北省玉田县人.讲师，博士.Tel.(029)3374516Ext.13 通讯联系人:陈苏民Email.chensm@fmmu.edu.cn
(第四军医大学基础部生物化学和分子生物学教研室，陕西西安710033)
编辑 许福明
收稿日期:2001-04-27, 百拇医药(纪宗玲，柴玉波，陈苏民，张俊杰，陈南春，吴元明)