吡啶┐2，6(1H，3H)二酮生物碱对兔血小板聚集和TXB2 ，6┐keto┐PGF1α 产生的影响
关键词: 吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱;腺苷二磷酸;花生四烯酸;血小板聚集;血栓素B2 ;6-酮-前列腺素F1α
摘 要:目的 研究吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱(SH1 )对二磷酸腺苷(ADP)，花生四烯酸(AA)和胶原(COL)诱导兔血小板聚集和TXB2 和6-keto-PGF1α 生成的影响. 方法 用比浊法和放射免疫法. 结果 SH1 0.8～3.0mmol L-1 能显著地抑制2.0μmol L-1 ADP，33.3μmol L-1 AA和20.0g L-1 COL诱导的兔血小板聚集并有良好的量效关系.SH1 3.0mmol L-1 抑制TXB2 产生，而增加6-keto-PGF1α 产生，并因此6-keto-PGF
1α 和TXB2 的比值增加. 结论 SH1 显著抑制血小板聚集和TXB2 产生，同时增加6-keto-PGF1α 产生.
SH 1 inhibits platelet aggregation and TXB2 produc┐tion and increases6┐keto┐PGF1α in rabbits
YANG Jun-Wang LIU Li LU Run-Hua WANG Han-Qing
1 Department of Medicine and Chemistry，Urumuqi Military Medical College，Hutubi831200，China，
2 Department of Pharmacology，Faculty of Preclini-cal Medicine，Fourth Military Medical University，
3 Lanzhou Institute of Chemical Physics，Academy of Sciences of China
Keywords:pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids;adenosine diphosphate;arachidonic acid;platelet aggrega-tion;turbidimetry;6-keto-PGF1α
Abstract:AIM To investigate the effect of pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids(SH1 )on rabbit platelet aggrega-tion induced by adenosine diphosphate(ADP)，arachidonic acid(AA)and collagen(COL)，as well as thromboxone B2 (TXB2 )and6-keto-PGF1α production.METHODS Tur-bidimetry and radioimmunoassay were used in rabbits.RE┐SULTS SH2 0.8～3.0mmol L-1 could inhibit significantly the rabbit platelet aggregation induced by ADP2μmol L-1 ，AA33.3μmol L-1 ，COL20.0mg mL-1 ，which showed good dose-dependence.The inhibition by SH1 0.8～3.0mmol L -1 was23.3%～53.2%(ADP-induced)，13.3～44.4(AA-induced)，5.1%～49.3%(COL-induced)，respective-ly.SH2 0.8～3.0mmol L-1 inhibited TXB2 production，whereas increased6-keto-PGF1α to TXB2 was enhanced.CONCLUSION SH1 inhibits significantly platelet aggrega-tion and TXB2 production，and simultaneously increases6-ke-to-PGF1α .
0 引言
透骨草[speranskia tuberculata(Bge)baill]属大戟科植物.中国科学院兰州化学物理研究所从甘肃产透骨草中提取吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱[pyri-dine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids[1] (SH1 )]，为白色颗粒状结晶，相对分子质量227，结构式如下: ON CH3 OOH CH2 CCH3 OOCH3 Pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids 祖国医学认为透骨草有活血化淤作用，临床常用于风湿及其他关节疼痛的治疗[2] .我们对从透骨草中提取的化学单体吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱(SH1 )进行了抗血小板聚集和影响血栓素B2 (TXB 2 )，6-酮-前列腺素F1α (6-keto-PGF1α )产生的试验研究，进一步证明其活血化淤作用及其有效成分.
1 材料和方法
1.1 材料 吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱(SH1 )，由中国科学院兰州化学物理研究所提供，为白色结晶;阿司匹林(aspirine，ASP)由西北第二合成制药厂生产;二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，由Sigma公司提供;花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，由Sigma公司提供;胶原(collagen，COL)自制.取兔跟腱5.9g，置7.3mL生理盐水中剪碎后用搅拌机打细，1000g离心20min，取上清备用;TXB2 ，6-keto-PGF1α 放免测试药盒，由解放军总医院东亚放免研究所提供;ADM-5型血小板聚集仪，江苏丹阳电子研究所生产.
1.2 方法
1.2.1 血小板聚集试验 取兔心脏血，按常规制备富含血小板血浆(PRP)，再制备贫血小板血浆(PPP)，使PRP的数为(10～20)×1010 L-1 将调好的PRP分成6组，每组400μL，加入比浊管内.第1组加入药物溶剂(25mL L-1 DMSO)作为对照组;第2～5组分别加入终浓度为0.8，1.0，2.0和3.0mmol L-1 的SH1 ，第6组加入终浓度为0.4mmol L-1 的ASP.每组温育2min后，用比浊法[3-6] 测定ADP(2.0μmol L-1 )，AA(33.3μmol L-1 )，COL(20.0g L-1 )，诱导的血小板聚集，记录5min(COL，10min)内血小板聚集曲线，试验数据用x ±s表示，组间比较采用t检验.
1.2.2 TXB2 和6-keto-PGF1α 测定 取兔心脏血，按常规制备PRP，向1mL PRP中加入含EDTA10μL，混匀后以1000g(4℃)离心15min，沉淀的血小板加入含EDTA(1mmol L-1 )的改良无钙HEPES液(葡萄糖5mmol L-1 ，小牛血清2mL L-1 ，pH7.4)，使血小板悬浮，再以560g离心15min，弃上清液，如此反复两次，最后用含CaCl2 3mmol L-1 及小牛血清白蛋白的改良台氏HEPS液，制备血小板悬液，调整血小板数为5×1011 L-1 取此血小板悬液1mol L-1 加入被测药物或相应对照液10μL，于37℃振荡温育25min，取出后立即置冰浴中，加入HCl(终浓度为0.09mmol L-1 )，终止反应.反应后的血小板悬液用2倍体积的重蒸乙酸乙酯提取两次，收取有机相，用氮气吹干.样品加入pH7.4的PBS后，用放免法[7，8] 测定TXB2 和6-keto-PGF1α 含量.
2 结果
2.1 SH1 对ADP，AA及COL诱导血小板聚集的影响 与对照组比较，SH 1 0.8，1.0，2.0和3.0mmol L-1 能显著地抑制ADP，AA及COL诱导的兔血小 板聚集，且有良好的量效关系.对ADP诱导的最大抑制率为23.3%，26.4%，37.3%和53.2%;2min抑制作用最明显，大剂量明显加快ADP诱导的血小板聚集的解聚集速度.对AA诱导的最大抑制率为13.3%，23.1%，32.7%和44.8%，2min后抑制作用最明显，也有非常明显的剂量依赖关系.对COL的最大抑制率为5.1%，20.0%，33.8%和49.3%;SH1 能显著延长聚集的解聚集时间，最大延迟诱导时间为62s.5min抑制作用最明显，作用的量效关系也非常明显(Tab1).
表1 SH1 对ADP，AA和COL诱导兔血小板聚集的影响 略
2.2 SH1 对TXB2 和6┐keto┐PGF1α 产生的影响 SH1 1.0，2.0和3.0mmol L-1 能显著地抑制AA诱导血小板聚集时TXB2 的生成，具有良好的量效关系，抑制率为11.0%，13.3%，36.6%，同时促进6-keto-PGF1α 的生成，其升高率为10.3%，13.4%和14.2%.与对照组比较，6-keto-PGF1α 与TXB2 的比值增加，对照组为3.2，SH
1 组为3.9，4.2和5.7(Tab2).
3 讨论
试验证明SH1 是一种较强的血小板抑制剂，对ADP，AA和COL诱导的血小板聚集均有显著的抑制作用，同时抑制TXB2 产生，提高6-keto-PGF1α 形成，且随剂量增加抑制作用增强.其中抑制ADP诱导的聚集作用较强.
阳性对照药ASP在本实验中也得到了比较好的结果，说明试验数据是可靠的.ADP，AA和COL均为典型的血小板聚集诱导剂，ADP作用于血小板膜，促进TXB2 生成;AA经环氧化酶作用，生成不稳定的环内过氧化物，并经血小板中TXB2 合成酶催化转变为TXA2 ;COL能激活血小板膜磷脂酶，分解磷脂，释放AA[6，7] ，SH1 对三者诱导血小板聚集的抑制作用可能是抑制了环氧酶，从而抑制了AA的转化，当然也不能否定SH1 作用于血小板膜ADP和COL受体，从而抑制了血小板聚集和TXB2 的形成.至于SH1 为什么会使6-keto-PGF1α 略有增加尚待进一步研究.试验结果提示SH1 可能就是中药透骨草发生活血化淤作用的有效成分之一.
表2 SH1 对兔TXB2 和6-keto-PGF1α 产生的影响 略
致 谢 本课题完成过程中受到兰州医学院吴勇杰教授和李文广副教授的大力指导与帮助.
参考文献:
[1]Shi JG，WANG HQ.Two pyridine-2，6-(1H，3H)-dione alka-loids from speranskia tuberculata [J].Phytochemistry，1995;40(4):1299-1302.
[2]Jiangsu New Medical College.Zhongyao da cidian(Traditional Chinese medicine dictionary)[M].Shanghai:Shanghai People's Publishing House，1997:1878-1879.
[3]Yang JW，Liang YL，Li WG，Liu Y，Zhang MG，Wu YJ，Shi JG，Wang HQ.Inhibitory effect of pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids on rabbit platelet aggregation induced by ADP，AA and collagen [J].Zhongguo YaolixueTongbao(Chin Pharmacol Bull)，1998;14(1):24-26.
[4]Shan CW，Yang JW，Yang SQ.Blockage of clonidine-induced platelet aggregation in rabbits by procainamide [J].Zhongguo Yaoli Xuebao(Acta Pharmacol Sin)，1993;14(2):127-129.
[5]Shan CW，Yang SQ，Hi HB，Shao SL，Zhang PW.Influences of3，4，5-trihyroxystibene-3-β-mono-D-glucoside on rabbits'platelet aggregation and thromboxane B2production [J].Zhongguo Yaoli Xuebao(Acta Pharmacol Sin)，1990;11(6):527-530.
[6]Wu YJ，Zhou EF，Hao YB.Effects of methylflavonolamine on platelet aggregation in rabbits [J].Zhongguo Yaoli Xuebao(Acta Pharmacol Sin)，1988;9(1):79-83.
[7]Chen CS，Long K，Yue TL.Selective effects of dazoxiben(UK-37248)on the release of6-keto-PGF1α and TXB2 from rat neu-trophils and platelets [J].Di-er Junyi Daxue Xuebao(Acad J2nd Mil Med Coll)，1989;10(4):328-332.
[8]Huang WL，He LW，Peng SX.Synthesis and biological activi-ties of2-phenoxyethyl1，2，3，4-tetrahydroisoquinolines [J].Zhongguo Yaowu Huaxue Zazhi(Chin J Med Chem)，1999;9(1):26-32.
编辑 黄良田
1 解放军乌鲁木齐军医学院药化教研室，新疆呼图壁831200，
2 第四军医大学基础部药理学教研室，
3 中国科学院兰州化学物理研究所
基金项目: 中科院西部之光课题“西部天然药物研究与资源开发”基金(科发人字[1997]0117)
作者简介: 杨俊旺(1965-)，男(汉族)，甘肃省秦安县人.讲师., 百拇医药(杨俊旺 刘莉 鲁润华 汪汉卿)
摘 要:目的 研究吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱(SH1 )对二磷酸腺苷(ADP)，花生四烯酸(AA)和胶原(COL)诱导兔血小板聚集和TXB2 和6-keto-PGF1α 生成的影响. 方法 用比浊法和放射免疫法. 结果 SH1 0.8～3.0mmol L-1 能显著地抑制2.0μmol L-1 ADP，33.3μmol L-1 AA和20.0g L-1 COL诱导的兔血小板聚集并有良好的量效关系.SH1 3.0mmol L-1 抑制TXB2 产生，而增加6-keto-PGF1α 产生，并因此6-keto-PGF
1α 和TXB2 的比值增加. 结论 SH1 显著抑制血小板聚集和TXB2 产生，同时增加6-keto-PGF1α 产生.
SH 1 inhibits platelet aggregation and TXB2 produc┐tion and increases6┐keto┐PGF1α in rabbits
YANG Jun-Wang LIU Li LU Run-Hua WANG Han-Qing
1 Department of Medicine and Chemistry，Urumuqi Military Medical College，Hutubi831200，China，
2 Department of Pharmacology，Faculty of Preclini-cal Medicine，Fourth Military Medical University，
3 Lanzhou Institute of Chemical Physics，Academy of Sciences of China
Keywords:pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids;adenosine diphosphate;arachidonic acid;platelet aggrega-tion;turbidimetry;6-keto-PGF1α
Abstract:AIM To investigate the effect of pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids(SH1 )on rabbit platelet aggrega-tion induced by adenosine diphosphate(ADP)，arachidonic acid(AA)and collagen(COL)，as well as thromboxone B2 (TXB2 )and6-keto-PGF1α production.METHODS Tur-bidimetry and radioimmunoassay were used in rabbits.RE┐SULTS SH2 0.8～3.0mmol L-1 could inhibit significantly the rabbit platelet aggregation induced by ADP2μmol L-1 ，AA33.3μmol L-1 ，COL20.0mg mL-1 ，which showed good dose-dependence.The inhibition by SH1 0.8～3.0mmol L -1 was23.3%～53.2%(ADP-induced)，13.3～44.4(AA-induced)，5.1%～49.3%(COL-induced)，respective-ly.SH2 0.8～3.0mmol L-1 inhibited TXB2 production，whereas increased6-keto-PGF1α to TXB2 was enhanced.CONCLUSION SH1 inhibits significantly platelet aggrega-tion and TXB2 production，and simultaneously increases6-ke-to-PGF1α .
0 引言
透骨草[speranskia tuberculata(Bge)baill]属大戟科植物.中国科学院兰州化学物理研究所从甘肃产透骨草中提取吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱[pyri-dine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids[1] (SH1 )]，为白色颗粒状结晶，相对分子质量227，结构式如下: ON CH3 OOH CH2 CCH3 OOCH3 Pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids 祖国医学认为透骨草有活血化淤作用，临床常用于风湿及其他关节疼痛的治疗[2] .我们对从透骨草中提取的化学单体吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱(SH1 )进行了抗血小板聚集和影响血栓素B2 (TXB 2 )，6-酮-前列腺素F1α (6-keto-PGF1α )产生的试验研究，进一步证明其活血化淤作用及其有效成分.
1 材料和方法
1.1 材料 吡啶-2，6(1H，3H)二酮生物碱(SH1 )，由中国科学院兰州化学物理研究所提供，为白色结晶;阿司匹林(aspirine，ASP)由西北第二合成制药厂生产;二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)，由Sigma公司提供;花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，由Sigma公司提供;胶原(collagen，COL)自制.取兔跟腱5.9g，置7.3mL生理盐水中剪碎后用搅拌机打细，1000g离心20min，取上清备用;TXB2 ，6-keto-PGF1α 放免测试药盒，由解放军总医院东亚放免研究所提供;ADM-5型血小板聚集仪，江苏丹阳电子研究所生产.
1.2 方法
1.2.1 血小板聚集试验 取兔心脏血，按常规制备富含血小板血浆(PRP)，再制备贫血小板血浆(PPP)，使PRP的数为(10～20)×1010 L-1 将调好的PRP分成6组，每组400μL，加入比浊管内.第1组加入药物溶剂(25mL L-1 DMSO)作为对照组;第2～5组分别加入终浓度为0.8，1.0，2.0和3.0mmol L-1 的SH1 ，第6组加入终浓度为0.4mmol L-1 的ASP.每组温育2min后，用比浊法[3-6] 测定ADP(2.0μmol L-1 )，AA(33.3μmol L-1 )，COL(20.0g L-1 )，诱导的血小板聚集，记录5min(COL，10min)内血小板聚集曲线，试验数据用x ±s表示，组间比较采用t检验.
1.2.2 TXB2 和6-keto-PGF1α 测定 取兔心脏血，按常规制备PRP，向1mL PRP中加入含EDTA10μL，混匀后以1000g(4℃)离心15min，沉淀的血小板加入含EDTA(1mmol L-1 )的改良无钙HEPES液(葡萄糖5mmol L-1 ，小牛血清2mL L-1 ，pH7.4)，使血小板悬浮，再以560g离心15min，弃上清液，如此反复两次，最后用含CaCl2 3mmol L-1 及小牛血清白蛋白的改良台氏HEPS液，制备血小板悬液，调整血小板数为5×1011 L-1 取此血小板悬液1mol L-1 加入被测药物或相应对照液10μL，于37℃振荡温育25min，取出后立即置冰浴中，加入HCl(终浓度为0.09mmol L-1 )，终止反应.反应后的血小板悬液用2倍体积的重蒸乙酸乙酯提取两次，收取有机相，用氮气吹干.样品加入pH7.4的PBS后，用放免法[7，8] 测定TXB2 和6-keto-PGF1α 含量.
2 结果
2.1 SH1 对ADP，AA及COL诱导血小板聚集的影响 与对照组比较，SH 1 0.8，1.0，2.0和3.0mmol L-1 能显著地抑制ADP，AA及COL诱导的兔血小 板聚集，且有良好的量效关系.对ADP诱导的最大抑制率为23.3%，26.4%，37.3%和53.2%;2min抑制作用最明显，大剂量明显加快ADP诱导的血小板聚集的解聚集速度.对AA诱导的最大抑制率为13.3%，23.1%，32.7%和44.8%，2min后抑制作用最明显，也有非常明显的剂量依赖关系.对COL的最大抑制率为5.1%，20.0%，33.8%和49.3%;SH1 能显著延长聚集的解聚集时间，最大延迟诱导时间为62s.5min抑制作用最明显，作用的量效关系也非常明显(Tab1).
表1 SH1 对ADP，AA和COL诱导兔血小板聚集的影响 略
2.2 SH1 对TXB2 和6┐keto┐PGF1α 产生的影响 SH1 1.0，2.0和3.0mmol L-1 能显著地抑制AA诱导血小板聚集时TXB2 的生成，具有良好的量效关系，抑制率为11.0%，13.3%，36.6%，同时促进6-keto-PGF1α 的生成，其升高率为10.3%，13.4%和14.2%.与对照组比较，6-keto-PGF1α 与TXB2 的比值增加，对照组为3.2，SH
1 组为3.9，4.2和5.7(Tab2).
3 讨论
试验证明SH1 是一种较强的血小板抑制剂，对ADP，AA和COL诱导的血小板聚集均有显著的抑制作用，同时抑制TXB2 产生，提高6-keto-PGF1α 形成，且随剂量增加抑制作用增强.其中抑制ADP诱导的聚集作用较强.
阳性对照药ASP在本实验中也得到了比较好的结果，说明试验数据是可靠的.ADP，AA和COL均为典型的血小板聚集诱导剂，ADP作用于血小板膜，促进TXB2 生成;AA经环氧化酶作用，生成不稳定的环内过氧化物，并经血小板中TXB2 合成酶催化转变为TXA2 ;COL能激活血小板膜磷脂酶，分解磷脂，释放AA[6，7] ，SH1 对三者诱导血小板聚集的抑制作用可能是抑制了环氧酶，从而抑制了AA的转化，当然也不能否定SH1 作用于血小板膜ADP和COL受体，从而抑制了血小板聚集和TXB2 的形成.至于SH1 为什么会使6-keto-PGF1α 略有增加尚待进一步研究.试验结果提示SH1 可能就是中药透骨草发生活血化淤作用的有效成分之一.
表2 SH1 对兔TXB2 和6-keto-PGF1α 产生的影响 略
致 谢 本课题完成过程中受到兰州医学院吴勇杰教授和李文广副教授的大力指导与帮助.
参考文献:
[1]Shi JG，WANG HQ.Two pyridine-2，6-(1H，3H)-dione alka-loids from speranskia tuberculata [J].Phytochemistry，1995;40(4):1299-1302.
[2]Jiangsu New Medical College.Zhongyao da cidian(Traditional Chinese medicine dictionary)[M].Shanghai:Shanghai People's Publishing House，1997:1878-1879.
[3]Yang JW，Liang YL，Li WG，Liu Y，Zhang MG，Wu YJ，Shi JG，Wang HQ.Inhibitory effect of pyridine-2，6(1H，3H)-dione alkaloids on rabbit platelet aggregation induced by ADP，AA and collagen [J].Zhongguo YaolixueTongbao(Chin Pharmacol Bull)，1998;14(1):24-26.
[4]Shan CW，Yang JW，Yang SQ.Blockage of clonidine-induced platelet aggregation in rabbits by procainamide [J].Zhongguo Yaoli Xuebao(Acta Pharmacol Sin)，1993;14(2):127-129.
[5]Shan CW，Yang SQ，Hi HB，Shao SL，Zhang PW.Influences of3，4，5-trihyroxystibene-3-β-mono-D-glucoside on rabbits'platelet aggregation and thromboxane B2production [J].Zhongguo Yaoli Xuebao(Acta Pharmacol Sin)，1990;11(6):527-530.
[6]Wu YJ，Zhou EF，Hao YB.Effects of methylflavonolamine on platelet aggregation in rabbits [J].Zhongguo Yaoli Xuebao(Acta Pharmacol Sin)，1988;9(1):79-83.
[7]Chen CS，Long K，Yue TL.Selective effects of dazoxiben(UK-37248)on the release of6-keto-PGF1α and TXB2 from rat neu-trophils and platelets [J].Di-er Junyi Daxue Xuebao(Acad J2nd Mil Med Coll)，1989;10(4):328-332.
[8]Huang WL，He LW，Peng SX.Synthesis and biological activi-ties of2-phenoxyethyl1，2，3，4-tetrahydroisoquinolines [J].Zhongguo Yaowu Huaxue Zazhi(Chin J Med Chem)，1999;9(1):26-32.
编辑 黄良田
1 解放军乌鲁木齐军医学院药化教研室，新疆呼图壁831200，
2 第四军医大学基础部药理学教研室，
3 中国科学院兰州化学物理研究所
基金项目: 中科院西部之光课题“西部天然药物研究与资源开发”基金(科发人字[1997]0117)
作者简介: 杨俊旺(1965-)，男(汉族)，甘肃省秦安县人.讲师., 百拇医药(杨俊旺 刘莉 鲁润华 汪汉卿)