哮喘患者必可酮治疗前后引痰液中细胞因子水平及意义
关键词: 哮喘;气道炎症;痰;白细胞介素8;肿瘤坏死因子-α;嗜酸细胞阳离子蛋白
摘 要:目的 探讨哮喘患者发作期及激素治疗前后引痰液中炎症介质IL-8，TNF-α和ECP(嗜酸细胞阳离子蛋白)含量对判定哮喘气道炎症及疗效的意义. 方法 用高渗盐水雾化引痰、荧光免疫法及酶联免疫法检测发作期哮喘患者以及吸入必可酮(二丙酸倍氯米松气雾剂)治疗4wk后引痰液中IL-8，TNF-α和ECP等水平. 结果 哮喘患者引痰液中IL-8，TNF-α和ECP等水平在必可酮治疗4wk后较其发作期有显著下降. 结论 测定引痰液炎症介质IL-8，TNF-α和ECP等水平可用于评估哮喘气道炎症及治疗效果.
Induced sputum lends a hand in treatment for asth┐matics patients with Bicotide
FAN Wei-Wen，SUN Bin，WU Chang-Gui，MI Jian-Xin
Department of Respiratory Medicine，Xijing Hospi-tal，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:asthma;airway inflammation;sputum;inter-leukin-8;TNF-α;eosinophil cationic protein
Abstract:AIM To assess whether levels of IL-8，TNF-αand ECP in the induced sputum reflect the level of the airway inflammation of bronchial asthma.METHODS Induced spu-tum was used by inhalation of hypertonic saline to analyse concentrations of eosinophil cationic protein(ECP)，inter-leukin-8(IL-8)and tumour necrosis factor-α(TNF-α)by ra-dioimmunoassay(RIA)or enzyme linked immunosorbent as-say(ELISA).RESULTS Levels of TNF-α，ECP and IL-8in patients with inhalation of Bicotide for4weeks were less than those with acute attacks of asthma.CONCLUSION Analysing the induced sputum can be used to assess the airway inflammation and the effects of treatment.
0 引言
近年的研究[1] 表明:哮喘是多种细胞及细胞因子参与的慢性气道炎症.在气道炎症检测中引痰技术因其安全、简便、易行，而越来越受到重视.我们通过对临床哮喘患者吸入糖皮质激素治疗前后对照，应用高渗盐水雾化引痰，分析引痰液中IL-8，TNF-α及ECP(嗜酸细胞阳离子蛋白)水平，探讨引痰对哮喘气道炎症的评估及必可酮(二丙酸倍氯米松气雾剂)治疗的变化.
1 对象和方法
1.1 对象 1997/1998年本院门诊哮喘患者13(男8，女5)例，平均年龄32(18～45)岁.依据1993年中华呼吸学会制定的哮喘诊断标准.患者均为发作期，无其他胸肺疾病，至少1mo内未用过糖皮质激素，48h内未用支气管扩张剂及抗炎药物治疗.
1.2 方法 ①标本采集 13例患者均吸入糖皮质激素必可酮(二丙酸倍氯米松气雾剂，Bicotide，由葛兰素公司惠赠)750μg·d-1 治疗4wk，治疗前后以30g·L-1 高渗盐水雾化引痰[2] (嘱患者先漱口，雾化过程中与唾液分开收集，雾化总时间小于20min)，以无菌的离心管收集痰液，并记录痰量.治疗前后分别测量FEV1/FVC(%).②痰液处理[2] 加入10g·L-1 二硫苏糖醇(DTT)2mL充分溶解，1500r·min-1 4℃离心，取上清于-30℃冰箱储存待用.沉淀稀释后专人计白细胞总数，并推片3张瑞氏染色计嗜酸性粒细胞(Eo)百分比例.③痰液ECP测定 采用荧光酶联免疫法(pharmacia CAP，瑞典.灵敏度2μg·L-1 ，测定范围2μg·L-1 ～200μg·L-1 )检测.④痰液IL-8，TNF-α测定 均采用酶联免疫法，试剂由本校免疫学教研室提供，操作按说明进行.
统计学处理:采用t检验和直线相关分析.
2 结果
2.1 哮喘患者治疗前后痰液中临床指标的变化 13例患者引痰液中白细胞总数在治疗前后无显著差异.治疗后组(Group2)引痰液中Eo百分数和肺功能FEV1/FVC(%)与治疗前组(Group1)有显著差异(P<0.05，Tab1).
表1 哮喘患者治疗前后痰液中白细胞总数、嗜酸性粒细胞比例和肺功能的比较 略
2.2 哮喘患者治疗前后痰液中3种细胞因子含量的变化 13例患者必可酮吸入治疗后引痰液中IL-8，TNF-α及ECP水平较治疗前组均显著降低(P<0.01，Tab2).
表2 哮喘患者治疗前后痰液中IL-8，TNF-α和ECP含量的比较 略
2.3 哮喘患者发作期痰液中各项指标的相关关系 ①哮喘患者发作期引痰液中Eo百分数和FEV1/FVC(%)呈负相关(r=-0.442，P<0.05);②Eo百分数与IL-8和ECP显著正相关(r=0.517，P<0.05和r=0.728，P<0.01);而FEV1/FVC(%)与IL-8和ECP呈显著负相关(r=-0.453，P<0.05和r=-0.758，P<0.01);TNF-α与Eo百分数和FEV1/FVC(%)未显示出明显相关性.③3种炎症介质之间的关系:IL-8和ECP含量之间呈显著性正相关(r=0.699，P<0.01);TNF-α和IL-8含量之间呈显著性正相关(r=0.520，P<0.05);TNF-α和ECP含量之间无明显相关.
3 讨论
IL-8是由巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞分泌的一种具有趋化功能的细胞因子.以往大量的研究表明[3] IL-8是中性粒细胞重要的趋化因子，因而在慢性支气管炎等疾病发生中起关键作用.Shute[4] 体外研究认为IL-8不仅对中性粒细胞，而且对嗜酸性粒细胞的趋化和活化起重要作用.我们的研究发现发作期哮喘患者痰液中IL-8浓度明显高于激素治疗4wk组，并且发现TNF-α与其呈显著正相关，可能是TNF-α作为一种前炎症性细胞因子能引起其他炎症介质的产生，并引起后续的炎症反应.另外我们还发现痰液中IL-8与Eo百分数及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)都呈显著正相关，我们认为这是因为IL-8可作为Eo的趋化因子致使Eo在气道中募集、活化而释放出毒性蛋白所致.上述结果支持Yousefi等[5] 认为哮喘血液中增加的IL-8主要来源于外周血的Eo而不是中性粒细胞.因而我们认为IL-8参与了哮喘气道炎症的发生，可作为评估气道炎症及治疗效果的指标.哮喘嗜酸性粒细胞浸润是哮喘气道炎症最显著的病理特征[6] .由外周血募集来的Eo活化后可释放多种毒性蛋白，其中ECP因对呼吸道上皮有直接破坏作用因而备受关注，它可使呼吸道上皮失去保护屏障，暴露传入神经末稍，导致气道反应性增高，造成气道炎症[7] .本实验结果显示发作期哮喘引痰液中ECP水平均随必可酮治疗后下降，显示也参与了哮喘气道炎症的发生.TNF-α是由巨噬细胞、T淋巴细胞等释放的一种具有重要作用的哮喘启动因子，它能导致气道阻力延迟性增高和气道高反应性，并可促进支气管中性粒细胞、Eo浸润[8] ，还可引起IL-8，GM-CSF等分泌增加而加重哮喘病情.我们的结果显示哮喘引痰液中TNF-α水平随激素治疗而降低，提示TNF-α参与了哮喘气道炎症过程.
检测哮喘气道炎症最直接、可靠的方法有采用支气管灌洗液(BALF)、支气管粘膜活检等，但因有一定危险性并受患者病情限制而难以在临床推广[9] ，为此，Fahy等[10] 分别用引痰、支气管冲洗(BW)和BALF的方法研究表明以痰液作标本检测炎症细胞、细胞因子与BALF有极好的相关性，且更适于哮喘气道炎症的研究.我们的研究结果进一步表明:引痰方法简便，易受患者接受，可用于分析哮喘患者气道炎症程度，以指导临床抗炎治疗.
参考文献:
[1]Crimi E，Spanevello A，Neri M，Ind PW，Rossi GA，Brusasco V.Dissociation between airway inflammation and airway hyper-responsiveness in allergic asthma [J].Am J Respir Crit Care Med，1998;157(1):4-9.
[2]Pin I，Gibson PG，Kolendowicz R，Girgis GA，Denburg JA，Hargreave FE，Dolovich J.Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma [J].Thorax，1992;47:25-28.
[3]Yamamoto C，Yoneda T，Yoshikawa M，Fu A，Tokuyama T，Tsukaguchi K，Narita N.Airway inflammation in COPD as-sessed by sputum levels of interleukin-8[J].Chest，1997;112(2):505-510.
[4]Shute J.Interleukin-8is a potent eosinophil chemo-attractant [J].Clin Exp Allergy，1994;24(3):203-206.
[5]Yousefi S，Hemmann S，Weber M，Holzer C，Hartung K，Blaser K，Simon H.IL-8is expressed by human peripheral blood eosinophils [J].J Immunol，1995;154(10):5481-5490.
[6]Oddera S，Silvestri M，Balbo A，Jovovich BO，Penna R，CrimiE，Rossi G.Airway eosinophilic inflammation，epithelial dam-age and bronchial hyperresponsiveness in patients with mild-moderate，stable asthma [J].Allergy，1996;51:100-107.
[7]Venge P，Dahl R，Fredens K，Peterson C.Epithelial injury by human eosinophils [J].Am Rev Respir Dis，1988;138(suppl):S54-S57.
[8]Kips JC，Tavernier J，Pauwels R.TNF causes bronchial hyper-responsiveness in rats [J].Am Rev Respir Dis，1992;145(2):332-336.
[9]Sun Bin，Den HJ.The significance of detection of inflammatory samples in the sputum of patients with asthma [J].Zhonghua Neike Zazhi(Chin J Internal Med)，1997;36(12):797-798.[10]Fahy JV，Wong H，Liu J，Boushey H.Comparison of samples collected by sputum induction and bronchoscopy from asthmatic and healthy subjects [J].Am J Respir Crit Care Med，1995;152(1):53-58.
编辑 王 睿
第四军医大学西京医院呼吸内科，陕西西安710033
基金项目: 全军医药卫生科研基金资助课题(96M141)
作者简介: 樊卫文(1968-)，男(汉族)，湖南省湘乡市人.硕士(导师孙滨).Tel.(029)3375237, http://www.100md.com(樊卫文 孙滨 吴昌归 米建新)
摘 要:目的 探讨哮喘患者发作期及激素治疗前后引痰液中炎症介质IL-8，TNF-α和ECP(嗜酸细胞阳离子蛋白)含量对判定哮喘气道炎症及疗效的意义. 方法 用高渗盐水雾化引痰、荧光免疫法及酶联免疫法检测发作期哮喘患者以及吸入必可酮(二丙酸倍氯米松气雾剂)治疗4wk后引痰液中IL-8，TNF-α和ECP等水平. 结果 哮喘患者引痰液中IL-8，TNF-α和ECP等水平在必可酮治疗4wk后较其发作期有显著下降. 结论 测定引痰液炎症介质IL-8，TNF-α和ECP等水平可用于评估哮喘气道炎症及治疗效果.
Induced sputum lends a hand in treatment for asth┐matics patients with Bicotide
FAN Wei-Wen，SUN Bin，WU Chang-Gui，MI Jian-Xin
Department of Respiratory Medicine，Xijing Hospi-tal，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China
Keywords:asthma;airway inflammation;sputum;inter-leukin-8;TNF-α;eosinophil cationic protein
Abstract:AIM To assess whether levels of IL-8，TNF-αand ECP in the induced sputum reflect the level of the airway inflammation of bronchial asthma.METHODS Induced spu-tum was used by inhalation of hypertonic saline to analyse concentrations of eosinophil cationic protein(ECP)，inter-leukin-8(IL-8)and tumour necrosis factor-α(TNF-α)by ra-dioimmunoassay(RIA)or enzyme linked immunosorbent as-say(ELISA).RESULTS Levels of TNF-α，ECP and IL-8in patients with inhalation of Bicotide for4weeks were less than those with acute attacks of asthma.CONCLUSION Analysing the induced sputum can be used to assess the airway inflammation and the effects of treatment.
0 引言
近年的研究[1] 表明:哮喘是多种细胞及细胞因子参与的慢性气道炎症.在气道炎症检测中引痰技术因其安全、简便、易行，而越来越受到重视.我们通过对临床哮喘患者吸入糖皮质激素治疗前后对照，应用高渗盐水雾化引痰，分析引痰液中IL-8，TNF-α及ECP(嗜酸细胞阳离子蛋白)水平，探讨引痰对哮喘气道炎症的评估及必可酮(二丙酸倍氯米松气雾剂)治疗的变化.
1 对象和方法
1.1 对象 1997/1998年本院门诊哮喘患者13(男8，女5)例，平均年龄32(18～45)岁.依据1993年中华呼吸学会制定的哮喘诊断标准.患者均为发作期，无其他胸肺疾病，至少1mo内未用过糖皮质激素，48h内未用支气管扩张剂及抗炎药物治疗.
1.2 方法 ①标本采集 13例患者均吸入糖皮质激素必可酮(二丙酸倍氯米松气雾剂，Bicotide，由葛兰素公司惠赠)750μg·d-1 治疗4wk，治疗前后以30g·L-1 高渗盐水雾化引痰[2] (嘱患者先漱口，雾化过程中与唾液分开收集，雾化总时间小于20min)，以无菌的离心管收集痰液，并记录痰量.治疗前后分别测量FEV1/FVC(%).②痰液处理[2] 加入10g·L-1 二硫苏糖醇(DTT)2mL充分溶解，1500r·min-1 4℃离心，取上清于-30℃冰箱储存待用.沉淀稀释后专人计白细胞总数，并推片3张瑞氏染色计嗜酸性粒细胞(Eo)百分比例.③痰液ECP测定 采用荧光酶联免疫法(pharmacia CAP，瑞典.灵敏度2μg·L-1 ，测定范围2μg·L-1 ～200μg·L-1 )检测.④痰液IL-8，TNF-α测定 均采用酶联免疫法，试剂由本校免疫学教研室提供，操作按说明进行.
统计学处理:采用t检验和直线相关分析.
2 结果
2.1 哮喘患者治疗前后痰液中临床指标的变化 13例患者引痰液中白细胞总数在治疗前后无显著差异.治疗后组(Group2)引痰液中Eo百分数和肺功能FEV1/FVC(%)与治疗前组(Group1)有显著差异(P<0.05，Tab1).
表1 哮喘患者治疗前后痰液中白细胞总数、嗜酸性粒细胞比例和肺功能的比较 略
2.2 哮喘患者治疗前后痰液中3种细胞因子含量的变化 13例患者必可酮吸入治疗后引痰液中IL-8，TNF-α及ECP水平较治疗前组均显著降低(P<0.01，Tab2).
表2 哮喘患者治疗前后痰液中IL-8，TNF-α和ECP含量的比较 略
2.3 哮喘患者发作期痰液中各项指标的相关关系 ①哮喘患者发作期引痰液中Eo百分数和FEV1/FVC(%)呈负相关(r=-0.442，P<0.05);②Eo百分数与IL-8和ECP显著正相关(r=0.517，P<0.05和r=0.728，P<0.01);而FEV1/FVC(%)与IL-8和ECP呈显著负相关(r=-0.453，P<0.05和r=-0.758，P<0.01);TNF-α与Eo百分数和FEV1/FVC(%)未显示出明显相关性.③3种炎症介质之间的关系:IL-8和ECP含量之间呈显著性正相关(r=0.699，P<0.01);TNF-α和IL-8含量之间呈显著性正相关(r=0.520，P<0.05);TNF-α和ECP含量之间无明显相关.
3 讨论
IL-8是由巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞分泌的一种具有趋化功能的细胞因子.以往大量的研究表明[3] IL-8是中性粒细胞重要的趋化因子，因而在慢性支气管炎等疾病发生中起关键作用.Shute[4] 体外研究认为IL-8不仅对中性粒细胞，而且对嗜酸性粒细胞的趋化和活化起重要作用.我们的研究发现发作期哮喘患者痰液中IL-8浓度明显高于激素治疗4wk组，并且发现TNF-α与其呈显著正相关，可能是TNF-α作为一种前炎症性细胞因子能引起其他炎症介质的产生，并引起后续的炎症反应.另外我们还发现痰液中IL-8与Eo百分数及嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)都呈显著正相关，我们认为这是因为IL-8可作为Eo的趋化因子致使Eo在气道中募集、活化而释放出毒性蛋白所致.上述结果支持Yousefi等[5] 认为哮喘血液中增加的IL-8主要来源于外周血的Eo而不是中性粒细胞.因而我们认为IL-8参与了哮喘气道炎症的发生，可作为评估气道炎症及治疗效果的指标.哮喘嗜酸性粒细胞浸润是哮喘气道炎症最显著的病理特征[6] .由外周血募集来的Eo活化后可释放多种毒性蛋白，其中ECP因对呼吸道上皮有直接破坏作用因而备受关注，它可使呼吸道上皮失去保护屏障，暴露传入神经末稍，导致气道反应性增高，造成气道炎症[7] .本实验结果显示发作期哮喘引痰液中ECP水平均随必可酮治疗后下降，显示也参与了哮喘气道炎症的发生.TNF-α是由巨噬细胞、T淋巴细胞等释放的一种具有重要作用的哮喘启动因子，它能导致气道阻力延迟性增高和气道高反应性，并可促进支气管中性粒细胞、Eo浸润[8] ，还可引起IL-8，GM-CSF等分泌增加而加重哮喘病情.我们的结果显示哮喘引痰液中TNF-α水平随激素治疗而降低，提示TNF-α参与了哮喘气道炎症过程.
检测哮喘气道炎症最直接、可靠的方法有采用支气管灌洗液(BALF)、支气管粘膜活检等，但因有一定危险性并受患者病情限制而难以在临床推广[9] ，为此，Fahy等[10] 分别用引痰、支气管冲洗(BW)和BALF的方法研究表明以痰液作标本检测炎症细胞、细胞因子与BALF有极好的相关性，且更适于哮喘气道炎症的研究.我们的研究结果进一步表明:引痰方法简便，易受患者接受，可用于分析哮喘患者气道炎症程度，以指导临床抗炎治疗.
参考文献:
[1]Crimi E，Spanevello A，Neri M，Ind PW，Rossi GA，Brusasco V.Dissociation between airway inflammation and airway hyper-responsiveness in allergic asthma [J].Am J Respir Crit Care Med，1998;157(1):4-9.
[2]Pin I，Gibson PG，Kolendowicz R，Girgis GA，Denburg JA，Hargreave FE，Dolovich J.Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma [J].Thorax，1992;47:25-28.
[3]Yamamoto C，Yoneda T，Yoshikawa M，Fu A，Tokuyama T，Tsukaguchi K，Narita N.Airway inflammation in COPD as-sessed by sputum levels of interleukin-8[J].Chest，1997;112(2):505-510.
[4]Shute J.Interleukin-8is a potent eosinophil chemo-attractant [J].Clin Exp Allergy，1994;24(3):203-206.
[5]Yousefi S，Hemmann S，Weber M，Holzer C，Hartung K，Blaser K，Simon H.IL-8is expressed by human peripheral blood eosinophils [J].J Immunol，1995;154(10):5481-5490.
[6]Oddera S，Silvestri M，Balbo A，Jovovich BO，Penna R，CrimiE，Rossi G.Airway eosinophilic inflammation，epithelial dam-age and bronchial hyperresponsiveness in patients with mild-moderate，stable asthma [J].Allergy，1996;51:100-107.
[7]Venge P，Dahl R，Fredens K，Peterson C.Epithelial injury by human eosinophils [J].Am Rev Respir Dis，1988;138(suppl):S54-S57.
[8]Kips JC，Tavernier J，Pauwels R.TNF causes bronchial hyper-responsiveness in rats [J].Am Rev Respir Dis，1992;145(2):332-336.
[9]Sun Bin，Den HJ.The significance of detection of inflammatory samples in the sputum of patients with asthma [J].Zhonghua Neike Zazhi(Chin J Internal Med)，1997;36(12):797-798.[10]Fahy JV，Wong H，Liu J，Boushey H.Comparison of samples collected by sputum induction and bronchoscopy from asthmatic and healthy subjects [J].Am J Respir Crit Care Med，1995;152(1):53-58.
编辑 王 睿
第四军医大学西京医院呼吸内科，陕西西安710033
基金项目: 全军医药卫生科研基金资助课题(96M141)
作者简介: 樊卫文(1968-)，男(汉族)，湖南省湘乡市人.硕士(导师孙滨).Tel.(029)3375237, http://www.100md.com(樊卫文 孙滨 吴昌归 米建新)