芪丹通脉片对实验性异丙肾上腺素致心肌损害的心肌ICAM1表达影响
Effects of Qidantongmai tablet on expression of ICAM1 on isoproterenol impaired myocardium
XIAO TieHui, WANG ZongRen, LI JingHua, MA Jing, SHAO ZhongJun, ZHENG Jin, MA AILing
Department of Traditional Chinese Medicine, Xijing Hospital, Department of Epidemiology, Faculty of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To find the protective effects of Qidantongmai tablet (QDTMT) on impaired myocardium by investigating the effects of on the expression of ICAM1 on isoproterenol impaired myocardium. METHODS: Rats were randomly divided into four groups(control, model, QDTMTmax, QDTMTmin), treated with either saline or extract of QDTMT (1 g·kg-1) and QDTMT (2 g·kg-1) respectively for one month, and then given celiac injection of isoproterenol (4 mg/kg·d-1) at an interval of 24 hours for three days, thus establishing the isoproterenol impaired model. The expression of ICAM1 was detected by immunohistochemistry. RESULTS: Expression of ICAM1 in group of control was mostly negative, but in model group, most were positive on isoproterenol impaired myocardium (85%). But after treatment with QDTMT, positive expression decreased significantly (P<0.01), especially in the group of QDTMTmax (63%). CONCLUSION: Expression of ICAM1 on isoproterenol impaired myocardium significantly increases and QDTMT markedly reduces the expression of ICAM1, which indicates that QDTMT can protect isoproterenol impaired myocardium.
【Keywords】 Qidantongmai tablet; intercellular adhesion molecule1; isoproterenol ; myocardium; immunohistochemistry
【摘要】 目的： 观察芪丹通脉片(QDTMT)对异丙肾上腺素引起心肌损伤时其损害心肌细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1， ICAM1)表达的影响，从而评价QDTMT对心肌损害中的保护作用. 方法： SD大鼠32只(雄性)，随机分成4组(模型组、正常对照组、高剂量组和低剂量组)，1 mo灌胃给药后，参考Rone等[1]异丙肾所致心肌损害的方法改进，处理组腹腔注射异丙肾上腺素4 mg·kg-1·d-1，间隔24 h，连续3 d,建立异丙肾上腺素所致心肌损伤模型；通过免疫组化方法检测心肌ICAM1的表达. 结果：对照组大多数心肌的ICAM1的表达为阴性，而缺血组受损心肌大多表达阳性(85%)，QDTMT作用后心肌表达ICAM1的阳性率明显下降(P<0.01)，以高剂量组显著(63%). 结论： 在异丙肾所致心肌损害的心肌ICAM1表达明显增加，而经灌服QDTMT大鼠心肌ICAM1表达下降，尤以高剂量组明显，提示QDTMT对异丙肾上腺素造成的心肌损害具有保护作用.
【关键词】 芪丹通脉片；ICAM1；异丙肾上腺素；心肌；免疫组织化学
0引言
心肌细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1, ICAM1)在介导并参与心肌细胞损害及坏死过程中起着关键作用. 大剂量异丙肾上腺素引起心肌损害模型是研究心肌缺血缺氧性病理变化的主要方法之一. 研究表明，在异丙肾上腺素所致心肌损害时心肌的ICAM1表达增加的，而其表达增加程度与心肌损害程度密切相关[1].
我们通过免疫组化方法观察QDTMT对异丙肾上腺素引起心肌损伤时其损害心肌ICAM1表达的影响，以探讨QDTMT对异丙肾上腺素造成心肌损害的保护作用.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠32只(雄性)，质量(200±18) g，第四军医大学实验动物中心提供. 盐酸异丙肾上腺素(异丙肾):上海天丰制药厂生产(批号900811). 抗ICAM1多抗及DAB染色剂：购于武汉博士德公司. 生物素标记羊抗兔抗体(二抗)，ABC复合物：第四军医大学神经生物教研室提供. 芪丹通脉片(由黄芪30g、丹参30 g、当归15 g、红花30 g、松枝10 g等组成)提取清膏干粉(1 g干粉相当于生药2.86 g)，由西京医院提供. SD大鼠按体质量编号，完全随机分成4组，即空白对照组、模型组、低剂量组、高剂量组. 模型制备前用生理盐水按下列剂量配制等体积药液并分别灌胃，连续30 d：① 模型组和正常对照组(生理盐水10 mL·kg-1);② 低剂量组(1 g生药·kg-1);③ 高剂量组(2g生药·kg-1).
1.2方法心肌损害模型制备30 d后参考Rone等[2]异丙肾所致心肌损害的方法改进，处理组(模型组、低剂量组、高剂量组)腹腔注射异丙肾4 mg·kg-1·d-1，1次·d-1，间隔24 h，连续3 d；正常对照组用等量生理盐水代替异丙肾. 在首次给予异丙肾72 h后在30 g·L-1戊巴比妥(0.5 mg·kg-1)麻醉下立即取出心脏，去心房取心室放入4℃冷盐水冲洗2次后放入100 g·L-1多聚甲醛固定至所需时间，集中标本石蜡包埋，切片. 用免疫组织化学法染色[1]. 在光学显微镜下，每组随机选取200个40×10高倍视野计数100个同类细胞中的阳性细胞数，阳性细胞数占同类细胞10%以下为采用等级评分法. 细胞无特异性染色(呈浅蓝)为“-”， 阳性细胞数占同类细胞10%以下为轻度特异性染色“+”， 阳性细胞数占同类细胞10%~20%为中度特异性染色“”， 阳性细胞数占同类细胞20﹪以上为明显特异性染色 “”.
统计学处理：等级资料组间比较，采用SPSS10.0软件进行Kruskalwallis秩和检验.
2结果
实验期间经灌胃后各组动物摄食量无显著差异，给予中药和生理盐水灌胃后各组动物体质量相似(P>0.05). 异丙肾所致心肌损害后大鼠主要表现为懒动、俯卧、呼吸困难、烦渴、间歇性燥动和笼中穿跑等. 多在用异丙肾后5 min出现，45 min后恢复正常. 对照组无症状.
免疫组化染色结果中Control组心肌ICAM1表达多数为阴性(83%)，部分为(+)(17%)，Model组ICAM1表达大多数为中度特异性染色“”(52%)，部分为明显特异性染色“”(21%)，总阳性率为85%，典型表现见Fig 1.中药作用后ICAM1表达下降(Fig 2~4)，QDTMTmax组中度特异性染色下降到23%，明显特异性染色“”下降到6%，总阳性率为63%，QDTMTmin组中度特异性染色“”下降到32%，明显特异性染色“”下降到9%，总阳性率为71%，QDTMTmax、QDTMTmin组与Model组相比有显著差异(P<0.01). 提示QDTMT对异丙肾上腺素造成的心肌损害具有保护作用.
图1模型组心肌组织心肌ICAM1表达(略)
Fig 1Expression of ICAM1 e of model group×400(略)
图2低剂量组心肌组织心肌ICAM1表达 (略)
Fig 2Expression of ICAM1 of QDTMTmin×400(略)
图3高剂量组心肌组织心肌ICAM1表达(略)
Fig 3Expression of ICAM1 in cardic muscle of QDTMTmax(A: ×200; B: ×400)(略)
3讨论
近几年来对粘附分子研究逐步深入，已显示其在许多疾病的病理过程中起重要作用. 在心血管方面，已证实其在缺血再灌注损伤、急性心梗、动脉粥样硬化形成中起作用[3]. 其中参与心肌损害过程的主要相关粘附分子是ICAM1. ICAM1为一种细胞粘附分子，是一种细胞表面跨膜蛋白抗原，广泛分布于各组织细胞表面，可激活T细胞、内皮细胞、成纤维细胞、组织巨噬细胞等. 其配体为LFA1(CD11/CD18)，在细胞相互作用中呈对应协同粘连. 心肌细胞在正常情况下仅表达极少量ICAM1，用普通的免疫学方法可能检测不出. 心肌细胞在缺氧、细胞因子等因素作用下，细胞膜表面生成大量ICAM1，ICAM1介导的炎症反应是异丙肾引起心肌损害的机制之一.
中医认为缺血性心、脑血管疾病基本病机为气虚血瘀，治疗宜益气、活血化瘀为主. QDTMT是根据中医异病同治及气血相关论研制而成，组方药黄芪、丹参、当归、红花、桂枝. 诸药合用以达益气活血、温通经脉、活血化瘀之效. 文献报道，黄芪、当归、丹参、红花、桂枝能降低血液粘度，抑制血小板聚集，调节TXAS2, PGIS2平衡[4,5]. 川芎嗪是传统活血化瘀中药川芎的有效成分，现代药理学研究证明其具有抗氧自由基损伤、抗脂质过氧化、钙通道阻滞作用，并能显著抗血小板聚集，减少缺血再灌注损伤区中性粒细胞的数量，对缺血再灌注的心、脑、肝等均有保护作用. 川芎嗪可通过降低TNFα从而下调ICAM1的表达. 研究表明，OLDL(氧化低密度脂蛋白)使EC分泌的NO显著降低，ICAM1的表达显著升高，而用当归与OLDL共同作用于EC则OLDL的这一作用明显逆转，抑制ICAM1的表达，但阿托品能阻断当归的作用，用M型胆碱能受体阻断剂阿托品和当归共同作用正常和损伤的EC均显示出明显的拮抗作用[6]. 可见当归对EC分泌NO和ICAM1表达的影响可能通过胆碱能受体而发挥作用. 刘军等发现丹参可降低大鼠脑缺血再灌注后外周血白细胞表面CD18/CD11b免疫反应阳性物，因此丹参对ICAM1的下调作用可能通过封闭白细胞表面CD18/CD11b抗原作用，抑制白细胞与血管内皮的粘附.
本实验中异丙肾上腺素造成的损伤区心肌ICAM1表达增加，而QDTMT作用后ICAM1的表达显著下调，尤以高剂量组为明显，说明QDTMT对异丙肾上腺素造成的损伤区心肌具有保护作用，其作用机制有可能与上述原因有关，但尚需进一步研究，本研究结果为祖国传统医学对缺血性心血管疾病的治疗找到新的理论依据与治疗方法.
【参考文献】
[1] Zhang YG, Qin YW, Wu H, Zhang TH. Experiment on expression of ICAM1 on impaired myocardium by isoproterenol [J]. (Chin J Gerontol), 1999;19(3):171-173.
[2] Rone G, Chappel CI, Balazs T. An infarctlike myocardial lession and other toxic manifestation produced by isoproterenal in the rat [J]. Arch Pathol, 1995;67:443.
[3] Briaud SA, Ding ZM, Michael LH. Leukocyte trafficking and myocardial reperfusion injury in ICAM1/Pselectinknockout mice [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001;280(1): 60-67.
[4] Wang ZR, Liu JX, Shang XH, Ma SP, Chen XF, Xia T, Long Y, Li JC, Bao Z. Effect of Huoxue Tongmai tablet on blood biochemistry in acute experimental ischema/infaction canine [J]. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 1999;20(10)907-909.
[5] Ma SP, Wang ZR, Hang L, Li JC, Chen XF, Liu JX. Effect of Huoxue Tongmai tablet on in hemorrheology of exerimential canine and patients with myocardial ischema [J]. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2000;21(5)81-83.
[6] Yan XH, Ouyang JP, Tu SZ, Guo SF. Effects of Angelica Sinensis on OLDLinduced decrease of NO release from human endothelial cells and increase of ICAM1 expression on the surface of human endothelial cells [J]. Zhongguo Bingli Shengli Zazhi (Chin J Pathol)， 2000;16(1):57-59.
(第四军医大学： 西京医院中医科, 预防医学系流行病学教研室，陕西 西安 710033)
编辑许昌泰
基金项目：陕西省重点科研项目资助课题(2001K12G7)
通讯作者：王宗仁. Tel. (029)3375347 Email. Zongren@fmmu.edu.cn
作者简介：肖铁卉(1974)，女(汉族)，河北省石家庄市人. 硕士(导师王宗仁). Tel. (029)375347Email. xu_zh@163.com, http://www.100md.com(肖铁卉，王宗仁，李晶华，马静，邵中军，郑瑾，马爱玲)
XIAO TieHui, WANG ZongRen, LI JingHua, MA Jing, SHAO ZhongJun, ZHENG Jin, MA AILing
Department of Traditional Chinese Medicine, Xijing Hospital, Department of Epidemiology, Faculty of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To find the protective effects of Qidantongmai tablet (QDTMT) on impaired myocardium by investigating the effects of on the expression of ICAM1 on isoproterenol impaired myocardium. METHODS: Rats were randomly divided into four groups(control, model, QDTMTmax, QDTMTmin), treated with either saline or extract of QDTMT (1 g·kg-1) and QDTMT (2 g·kg-1) respectively for one month, and then given celiac injection of isoproterenol (4 mg/kg·d-1) at an interval of 24 hours for three days, thus establishing the isoproterenol impaired model. The expression of ICAM1 was detected by immunohistochemistry. RESULTS: Expression of ICAM1 in group of control was mostly negative, but in model group, most were positive on isoproterenol impaired myocardium (85%). But after treatment with QDTMT, positive expression decreased significantly (P<0.01), especially in the group of QDTMTmax (63%). CONCLUSION: Expression of ICAM1 on isoproterenol impaired myocardium significantly increases and QDTMT markedly reduces the expression of ICAM1, which indicates that QDTMT can protect isoproterenol impaired myocardium.
【Keywords】 Qidantongmai tablet; intercellular adhesion molecule1; isoproterenol ; myocardium; immunohistochemistry
【摘要】 目的： 观察芪丹通脉片(QDTMT)对异丙肾上腺素引起心肌损伤时其损害心肌细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1， ICAM1)表达的影响，从而评价QDTMT对心肌损害中的保护作用. 方法： SD大鼠32只(雄性)，随机分成4组(模型组、正常对照组、高剂量组和低剂量组)，1 mo灌胃给药后，参考Rone等[1]异丙肾所致心肌损害的方法改进，处理组腹腔注射异丙肾上腺素4 mg·kg-1·d-1，间隔24 h，连续3 d,建立异丙肾上腺素所致心肌损伤模型；通过免疫组化方法检测心肌ICAM1的表达. 结果：对照组大多数心肌的ICAM1的表达为阴性，而缺血组受损心肌大多表达阳性(85%)，QDTMT作用后心肌表达ICAM1的阳性率明显下降(P<0.01)，以高剂量组显著(63%). 结论： 在异丙肾所致心肌损害的心肌ICAM1表达明显增加，而经灌服QDTMT大鼠心肌ICAM1表达下降，尤以高剂量组明显，提示QDTMT对异丙肾上腺素造成的心肌损害具有保护作用.
【关键词】 芪丹通脉片；ICAM1；异丙肾上腺素；心肌；免疫组织化学
0引言
心肌细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1, ICAM1)在介导并参与心肌细胞损害及坏死过程中起着关键作用. 大剂量异丙肾上腺素引起心肌损害模型是研究心肌缺血缺氧性病理变化的主要方法之一. 研究表明，在异丙肾上腺素所致心肌损害时心肌的ICAM1表达增加的，而其表达增加程度与心肌损害程度密切相关[1].
我们通过免疫组化方法观察QDTMT对异丙肾上腺素引起心肌损伤时其损害心肌ICAM1表达的影响，以探讨QDTMT对异丙肾上腺素造成心肌损害的保护作用.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠32只(雄性)，质量(200±18) g，第四军医大学实验动物中心提供. 盐酸异丙肾上腺素(异丙肾):上海天丰制药厂生产(批号900811). 抗ICAM1多抗及DAB染色剂：购于武汉博士德公司. 生物素标记羊抗兔抗体(二抗)，ABC复合物：第四军医大学神经生物教研室提供. 芪丹通脉片(由黄芪30g、丹参30 g、当归15 g、红花30 g、松枝10 g等组成)提取清膏干粉(1 g干粉相当于生药2.86 g)，由西京医院提供. SD大鼠按体质量编号，完全随机分成4组，即空白对照组、模型组、低剂量组、高剂量组. 模型制备前用生理盐水按下列剂量配制等体积药液并分别灌胃，连续30 d：① 模型组和正常对照组(生理盐水10 mL·kg-1);② 低剂量组(1 g生药·kg-1);③ 高剂量组(2g生药·kg-1).
1.2方法心肌损害模型制备30 d后参考Rone等[2]异丙肾所致心肌损害的方法改进，处理组(模型组、低剂量组、高剂量组)腹腔注射异丙肾4 mg·kg-1·d-1，1次·d-1，间隔24 h，连续3 d；正常对照组用等量生理盐水代替异丙肾. 在首次给予异丙肾72 h后在30 g·L-1戊巴比妥(0.5 mg·kg-1)麻醉下立即取出心脏，去心房取心室放入4℃冷盐水冲洗2次后放入100 g·L-1多聚甲醛固定至所需时间，集中标本石蜡包埋，切片. 用免疫组织化学法染色[1]. 在光学显微镜下，每组随机选取200个40×10高倍视野计数100个同类细胞中的阳性细胞数，阳性细胞数占同类细胞10%以下为采用等级评分法. 细胞无特异性染色(呈浅蓝)为“-”， 阳性细胞数占同类细胞10%以下为轻度特异性染色“+”， 阳性细胞数占同类细胞10%~20%为中度特异性染色“”， 阳性细胞数占同类细胞20﹪以上为明显特异性染色 “”.
统计学处理：等级资料组间比较，采用SPSS10.0软件进行Kruskalwallis秩和检验.
2结果
实验期间经灌胃后各组动物摄食量无显著差异，给予中药和生理盐水灌胃后各组动物体质量相似(P>0.05). 异丙肾所致心肌损害后大鼠主要表现为懒动、俯卧、呼吸困难、烦渴、间歇性燥动和笼中穿跑等. 多在用异丙肾后5 min出现，45 min后恢复正常. 对照组无症状.
免疫组化染色结果中Control组心肌ICAM1表达多数为阴性(83%)，部分为(+)(17%)，Model组ICAM1表达大多数为中度特异性染色“”(52%)，部分为明显特异性染色“”(21%)，总阳性率为85%，典型表现见Fig 1.中药作用后ICAM1表达下降(Fig 2~4)，QDTMTmax组中度特异性染色下降到23%，明显特异性染色“”下降到6%，总阳性率为63%，QDTMTmin组中度特异性染色“”下降到32%，明显特异性染色“”下降到9%，总阳性率为71%，QDTMTmax、QDTMTmin组与Model组相比有显著差异(P<0.01). 提示QDTMT对异丙肾上腺素造成的心肌损害具有保护作用.
图1模型组心肌组织心肌ICAM1表达(略)
Fig 1Expression of ICAM1 e of model group×400(略)
图2低剂量组心肌组织心肌ICAM1表达 (略)
Fig 2Expression of ICAM1 of QDTMTmin×400(略)
图3高剂量组心肌组织心肌ICAM1表达(略)
Fig 3Expression of ICAM1 in cardic muscle of QDTMTmax(A: ×200; B: ×400)(略)
3讨论
近几年来对粘附分子研究逐步深入，已显示其在许多疾病的病理过程中起重要作用. 在心血管方面，已证实其在缺血再灌注损伤、急性心梗、动脉粥样硬化形成中起作用[3]. 其中参与心肌损害过程的主要相关粘附分子是ICAM1. ICAM1为一种细胞粘附分子，是一种细胞表面跨膜蛋白抗原，广泛分布于各组织细胞表面，可激活T细胞、内皮细胞、成纤维细胞、组织巨噬细胞等. 其配体为LFA1(CD11/CD18)，在细胞相互作用中呈对应协同粘连. 心肌细胞在正常情况下仅表达极少量ICAM1，用普通的免疫学方法可能检测不出. 心肌细胞在缺氧、细胞因子等因素作用下，细胞膜表面生成大量ICAM1，ICAM1介导的炎症反应是异丙肾引起心肌损害的机制之一.
中医认为缺血性心、脑血管疾病基本病机为气虚血瘀，治疗宜益气、活血化瘀为主. QDTMT是根据中医异病同治及气血相关论研制而成，组方药黄芪、丹参、当归、红花、桂枝. 诸药合用以达益气活血、温通经脉、活血化瘀之效. 文献报道，黄芪、当归、丹参、红花、桂枝能降低血液粘度，抑制血小板聚集，调节TXAS2, PGIS2平衡[4,5]. 川芎嗪是传统活血化瘀中药川芎的有效成分，现代药理学研究证明其具有抗氧自由基损伤、抗脂质过氧化、钙通道阻滞作用，并能显著抗血小板聚集，减少缺血再灌注损伤区中性粒细胞的数量，对缺血再灌注的心、脑、肝等均有保护作用. 川芎嗪可通过降低TNFα从而下调ICAM1的表达. 研究表明，OLDL(氧化低密度脂蛋白)使EC分泌的NO显著降低，ICAM1的表达显著升高，而用当归与OLDL共同作用于EC则OLDL的这一作用明显逆转，抑制ICAM1的表达，但阿托品能阻断当归的作用，用M型胆碱能受体阻断剂阿托品和当归共同作用正常和损伤的EC均显示出明显的拮抗作用[6]. 可见当归对EC分泌NO和ICAM1表达的影响可能通过胆碱能受体而发挥作用. 刘军等发现丹参可降低大鼠脑缺血再灌注后外周血白细胞表面CD18/CD11b免疫反应阳性物，因此丹参对ICAM1的下调作用可能通过封闭白细胞表面CD18/CD11b抗原作用，抑制白细胞与血管内皮的粘附.
本实验中异丙肾上腺素造成的损伤区心肌ICAM1表达增加，而QDTMT作用后ICAM1的表达显著下调，尤以高剂量组为明显，说明QDTMT对异丙肾上腺素造成的损伤区心肌具有保护作用，其作用机制有可能与上述原因有关，但尚需进一步研究，本研究结果为祖国传统医学对缺血性心血管疾病的治疗找到新的理论依据与治疗方法.
【参考文献】
[1] Zhang YG, Qin YW, Wu H, Zhang TH. Experiment on expression of ICAM1 on impaired myocardium by isoproterenol [J]. (Chin J Gerontol), 1999;19(3):171-173.
[2] Rone G, Chappel CI, Balazs T. An infarctlike myocardial lession and other toxic manifestation produced by isoproterenal in the rat [J]. Arch Pathol, 1995;67:443.
[3] Briaud SA, Ding ZM, Michael LH. Leukocyte trafficking and myocardial reperfusion injury in ICAM1/Pselectinknockout mice [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001;280(1): 60-67.
[4] Wang ZR, Liu JX, Shang XH, Ma SP, Chen XF, Xia T, Long Y, Li JC, Bao Z. Effect of Huoxue Tongmai tablet on blood biochemistry in acute experimental ischema/infaction canine [J]. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 1999;20(10)907-909.
[5] Ma SP, Wang ZR, Hang L, Li JC, Chen XF, Liu JX. Effect of Huoxue Tongmai tablet on in hemorrheology of exerimential canine and patients with myocardial ischema [J]. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2000;21(5)81-83.
[6] Yan XH, Ouyang JP, Tu SZ, Guo SF. Effects of Angelica Sinensis on OLDLinduced decrease of NO release from human endothelial cells and increase of ICAM1 expression on the surface of human endothelial cells [J]. Zhongguo Bingli Shengli Zazhi (Chin J Pathol)， 2000;16(1):57-59.
(第四军医大学： 西京医院中医科, 预防医学系流行病学教研室，陕西 西安 710033)
编辑许昌泰
基金项目：陕西省重点科研项目资助课题(2001K12G7)
通讯作者：王宗仁. Tel. (029)3375347 Email. Zongren@fmmu.edu.cn
作者简介：肖铁卉(1974)，女(汉族)，河北省石家庄市人. 硕士(导师王宗仁). Tel. (029)375347Email. xu_zh@163.com, http://www.100md.com(肖铁卉，王宗仁，李晶华，马静，邵中军，郑瑾，马爱玲)