络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络胶囊对脑梗死大鼠
脑皮质血管新生和皮层神经元凋亡的影响(二)
华中科技大学同济医学院同济医院神经内科 梅爱农 张苏明 姜亚平 常丽英三峡大学第二临床医学院附属仁和医院儿科 王珏
缺血皮层组织VEGF Western blot显示出17kD及32kD两条带,分别对应VEGF121与VEGF165;VEGF主要在缺血皮层表达(图1见12月8日第16版,A通心络组缺血侧,C对照组缺血侧);而缺血对侧基本无VEGF表达或表达甚微(图1见12月8日第16版,B通心络组缺血对侧、D对照组缺血对侧)。量化分析显示通心络组损伤侧皮质VEGF121、VEGF165蛋白含量均较对照组损伤侧皮质对应蛋白表达显著增加(P<0.05)(图1见12月8日第16版,右图)。
2. 通心络胶囊对脑缺血皮质神经元凋亡的影响
凋亡神经元位于缺血皮质及周边区,TUNEL法显示脑缺血后皮质凋亡神经元明显增加(图2 ,A、B),计数显示,通心络组TUNEL阳性细胞数量减少(P<0.05,表1见12月8日第16版)。免疫组化显示, 脑缺血后损伤皮质caspase-3 表达升高(图2,C、D),经通心络治疗后表达下降(P<0.05,表见12月8日第16版)。Western blot显示caspase-3在脑缺血后损伤同侧、对侧均表达。电泳于32kD及17kD处显示两条带,分别代表caspase-3前体及活化caspase-3。以活化caspase-3分析,对照组缺血侧caspase-3含量最高(P<0.05),而通心络组缺血侧caspase-3含量明显降低,自身对照及与对照组缺血对侧相比无显著差异(P>0.05)(图3)。
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讨 论
脑梗死发生后,梗死中心坏死,而半暗带区则依据局部微环境动态演变,临床治疗脑缺血的目地在于使这种演变向有利方向转化,而治疗的方向则主要集中于重建血液循环、脑保护及功能恢复三个方面。
脑血管闭塞以后,缺血区毛细血管增生。毛细血管增生的范围与程度直接关系到缺血边缘血流的改善,影响神经元生理功能的恢复,决定了患者的预后。脑缺血后血管新生机制复杂,并有众多促血管生长因子参与,尤以VEGF最为经典[1]。研究发现脑缺血后VEGF表达增多,在内皮细胞、神经细胞、胶质细胞、巨噬细胞上均可表达,而提供外源性VEGF或者基因治疗也能显著改善脑梗死的缺血症状[2],因而VEGF是目前“治疗性血管新生”的主要候选因子,这成为改善血液循环的思路之一。
VEGF由两个分子量相同(23Kda)的亚基经二硫键连接形成同型二聚体,已发现VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206等5种亚型。其中VEGF206和VEGF189与蛋白聚糖结合,缺乏内皮细胞有丝分裂原活性,因而VEGF121与VEGF165作为扩散性VEGF亚型,在缺血性脑血管新生中起重要作用【3】。本实验研究发现,脑缺血后损伤侧VEGF阳性表达,从分子量上看以VEGF121及VEGF165表达为主,二者可能在脑缺血后内皮细胞增殖、迁徙与血管成形中起重要作用。脑缺血后这两种因子表达上调,一方面可能促进血管生长,另一方面可能通过其非血管增生性脑保护作用而促进恢复。本实验发现这两种因子与血管内皮标志物Ⅷ 因子一起,在脑缺血后高表达,说明脑缺血后局部可能发生血管增生作用,而免疫计数及Western blot显示,通心络治疗能更进一步提高缺血脑组织的VEGF含量,增加血管密度。因而,通心络胶囊能显著促进脑缺血后血管新生,对组织血供的恢复可能有正面作用。
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脑缺血发生后,半暗带区神经元面临两种结局,一种是局部微环境改善情况下,功能受损的神经元重新恢复,另一种是局部微环境持续恶化而诱发神经元凋亡,这是梗死灶扩大和迟发性神经元损伤的主要机制【4,5】。细胞凋亡的途径主要有两条,一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase(一类天冬氨酸特异性酶切半胱氨酸蛋白酶),另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子来激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解,引起细胞凋亡。Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶,正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,凋亡前的刺激激活了caspase-3参与蛋白分解级联反应。活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。本实验TUNEL法显示,脑缺血后脑组织内存在凋亡现象,凋亡并不是仅限于梗死周边带,而是梗死灶内及周边均较明显,这可能与缺血程度相关。细胞计数显示通心络组TUNEL阳性细胞明显减少。同时,免疫印记显示在缺血同侧与对侧均可检测到caspase,由于所用的抗体覆盖caspase全长,因而表现出32kd与17kd两条带,其中,32kd带代表caspase-3前体,是无活性的酶原,表达量在各组中没有明显的区别。而17Kda蛋白,则是活化的caspase-3,结果显示,安慰剂组脑缺血损伤皮层caspase表达量最高,而通心络组表达量与安慰剂组以及损伤对侧相比没有明显差异,说明通心络能显著降低caspase活性,减轻细胞凋亡。通心络的这种作用原因尚待进一步研究,我们推测,通心络胶囊可能通过改善局部血液循环、改善细胞能量代谢而抑制线粒体凋亡酶的释放,也可能是减轻局部炎症因子如TNF-α的释放而中断外源性凋亡途径,具体机制尚在进一步研究中。
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总之,通心络胶囊能诱导缺血后局部血管的新生,改善局部血供,也可通过减轻神经元凋亡而起脑保护作用,因而不失为一种极具前途的中药。
参考文献
1. Emanueli C,Madeddu P. Angiogenesis gene therapy to rescue ischemic tissues:achievements and future directions.Bri J Pharmacology, 2001,133(7):951-958.
2. Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q, et al. VEGF enhance angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain. J Clin Invest, 2000,106(7):829-838.
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3. Houck KA, Leung DW, Rowland AM et al. J Biol Chem,1992,167:26031-26037.
4. Snider BJ, Gottron FJ, Choi DW, et al. Apoptosis and necrosis in cerebrovascular disease. Ann N Y Acad Sci,
1999,893:243-53.
5. Tarada K, Inao S, Mizutani N, et al. Cerebral Blood Flow, glucose metabolism and tunnel-positive cells in the development of ischemia. Cerebrovasc Dis, 2001,11(1): 9-8., http://www.100md.com
华中科技大学同济医学院同济医院神经内科 梅爱农 张苏明 姜亚平 常丽英三峡大学第二临床医学院附属仁和医院儿科 王珏
缺血皮层组织VEGF Western blot显示出17kD及32kD两条带,分别对应VEGF121与VEGF165;VEGF主要在缺血皮层表达(图1见12月8日第16版,A通心络组缺血侧,C对照组缺血侧);而缺血对侧基本无VEGF表达或表达甚微(图1见12月8日第16版,B通心络组缺血对侧、D对照组缺血对侧)。量化分析显示通心络组损伤侧皮质VEGF121、VEGF165蛋白含量均较对照组损伤侧皮质对应蛋白表达显著增加(P<0.05)(图1见12月8日第16版,右图)。
2. 通心络胶囊对脑缺血皮质神经元凋亡的影响
凋亡神经元位于缺血皮质及周边区,TUNEL法显示脑缺血后皮质凋亡神经元明显增加(图2 ,A、B),计数显示,通心络组TUNEL阳性细胞数量减少(P<0.05,表1见12月8日第16版)。免疫组化显示, 脑缺血后损伤皮质caspase-3 表达升高(图2,C、D),经通心络治疗后表达下降(P<0.05,表见12月8日第16版)。Western blot显示caspase-3在脑缺血后损伤同侧、对侧均表达。电泳于32kD及17kD处显示两条带,分别代表caspase-3前体及活化caspase-3。以活化caspase-3分析,对照组缺血侧caspase-3含量最高(P<0.05),而通心络组缺血侧caspase-3含量明显降低,自身对照及与对照组缺血对侧相比无显著差异(P>0.05)(图3)。
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脑梗死发生后,梗死中心坏死,而半暗带区则依据局部微环境动态演变,临床治疗脑缺血的目地在于使这种演变向有利方向转化,而治疗的方向则主要集中于重建血液循环、脑保护及功能恢复三个方面。
脑血管闭塞以后,缺血区毛细血管增生。毛细血管增生的范围与程度直接关系到缺血边缘血流的改善,影响神经元生理功能的恢复,决定了患者的预后。脑缺血后血管新生机制复杂,并有众多促血管生长因子参与,尤以VEGF最为经典[1]。研究发现脑缺血后VEGF表达增多,在内皮细胞、神经细胞、胶质细胞、巨噬细胞上均可表达,而提供外源性VEGF或者基因治疗也能显著改善脑梗死的缺血症状[2],因而VEGF是目前“治疗性血管新生”的主要候选因子,这成为改善血液循环的思路之一。
VEGF由两个分子量相同(23Kda)的亚基经二硫键连接形成同型二聚体,已发现VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206等5种亚型。其中VEGF206和VEGF189与蛋白聚糖结合,缺乏内皮细胞有丝分裂原活性,因而VEGF121与VEGF165作为扩散性VEGF亚型,在缺血性脑血管新生中起重要作用【3】。本实验研究发现,脑缺血后损伤侧VEGF阳性表达,从分子量上看以VEGF121及VEGF165表达为主,二者可能在脑缺血后内皮细胞增殖、迁徙与血管成形中起重要作用。脑缺血后这两种因子表达上调,一方面可能促进血管生长,另一方面可能通过其非血管增生性脑保护作用而促进恢复。本实验发现这两种因子与血管内皮标志物Ⅷ 因子一起,在脑缺血后高表达,说明脑缺血后局部可能发生血管增生作用,而免疫计数及Western blot显示,通心络治疗能更进一步提高缺血脑组织的VEGF含量,增加血管密度。因而,通心络胶囊能显著促进脑缺血后血管新生,对组织血供的恢复可能有正面作用。
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脑缺血发生后,半暗带区神经元面临两种结局,一种是局部微环境改善情况下,功能受损的神经元重新恢复,另一种是局部微环境持续恶化而诱发神经元凋亡,这是梗死灶扩大和迟发性神经元损伤的主要机制【4,5】。细胞凋亡的途径主要有两条,一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase(一类天冬氨酸特异性酶切半胱氨酸蛋白酶),另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子来激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解,引起细胞凋亡。Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶,正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,凋亡前的刺激激活了caspase-3参与蛋白分解级联反应。活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。本实验TUNEL法显示,脑缺血后脑组织内存在凋亡现象,凋亡并不是仅限于梗死周边带,而是梗死灶内及周边均较明显,这可能与缺血程度相关。细胞计数显示通心络组TUNEL阳性细胞明显减少。同时,免疫印记显示在缺血同侧与对侧均可检测到caspase,由于所用的抗体覆盖caspase全长,因而表现出32kd与17kd两条带,其中,32kd带代表caspase-3前体,是无活性的酶原,表达量在各组中没有明显的区别。而17Kda蛋白,则是活化的caspase-3,结果显示,安慰剂组脑缺血损伤皮层caspase表达量最高,而通心络组表达量与安慰剂组以及损伤对侧相比没有明显差异,说明通心络能显著降低caspase活性,减轻细胞凋亡。通心络的这种作用原因尚待进一步研究,我们推测,通心络胶囊可能通过改善局部血液循环、改善细胞能量代谢而抑制线粒体凋亡酶的释放,也可能是减轻局部炎症因子如TNF-α的释放而中断外源性凋亡途径,具体机制尚在进一步研究中。
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总之,通心络胶囊能诱导缺血后局部血管的新生,改善局部血供,也可通过减轻神经元凋亡而起脑保护作用,因而不失为一种极具前途的中药。
参考文献
1. Emanueli C,Madeddu P. Angiogenesis gene therapy to rescue ischemic tissues:achievements and future directions.Bri J Pharmacology, 2001,133(7):951-958.
2. Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q, et al. VEGF enhance angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain. J Clin Invest, 2000,106(7):829-838.
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3. Houck KA, Leung DW, Rowland AM et al. J Biol Chem,1992,167:26031-26037.
4. Snider BJ, Gottron FJ, Choi DW, et al. Apoptosis and necrosis in cerebrovascular disease. Ann N Y Acad Sci,
1999,893:243-53.
5. Tarada K, Inao S, Mizutani N, et al. Cerebral Blood Flow, glucose metabolism and tunnel-positive cells in the development of ischemia. Cerebrovasc Dis, 2001,11(1): 9-8., http://www.100md.com