连花清瘟胶囊的抗病毒作用研究
连花清瘟胶囊在“非典”期间通过国家绿色通道进入药审,是治疗流行性感冒的国家级中药新药。该药是以岭医药研究院吴以岭教授,依据其在络病理论研究中的“三维立体网络系统”,探讨病邪由阳络传至经脉的病机特点及易于传入脏腑阴络的规律,提出“积极干预”的治疗观,确立卫气同治、表里双解,先证用药、截断病势,整体调节、多靶治疗的治疗原则,制定“清瘟解毒,宣肺泄热”的治法,以银翘散合麻杏石甘汤化裁,配伍通腑泻肺逐秽之大黄,扶正清肺化瘀之红景天等药物组成,在理论上具有创新性且组方独特。
军事医学科学院微生物流行病研究所,中国中医研究院中药研究所、西苑医院、广安门医院,北京中医药大学东直门医院和农业部动物流感开放实验室,河北医科大学(2003年5月至2004年2月)的研究表明,连花清瘟胶囊具有抗病毒和抑菌作用。
一、连花清瘟胶囊体外抗病毒
实验研究
, 百拇医药
1.目的 研究连花清瘟胶囊的体外抗病毒作用。
2. 材料 ①受试药:连花清瘟胶囊,1 g生药/ml。②对照药:利巴韦林(病毒唑原料药)。③病毒株:流感病毒甲3型(IVA3),副流感病毒1型(HVJ),呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒3型(ADV3)、7型(ADV7),单纯疱疹病毒1型 (HSV-1)、2型(HSV-2),柯萨奇病毒B4、B6(CoxB4、B6),均购自中国预防医学科学院病毒所。④细胞:人喉癌传代细胞Hep-2株,购自卫生部药品生物制品检定所。
3. 方法 将连花清瘟胶囊对Hep-2培养细胞毒性试验、病毒致细胞病变作用的影响试验和病毒毒力滴定试验结果,用Reed-Muench法计算连花清瘟胶囊50%毒性浓度(TC50)、50%有效浓度(EC50)和各病毒半数感染剂量(TCID50),求治疗指数TI(TI=TC50/EC50),TI值越高示药效越强。
连花清瘟胶囊对病毒致细胞病变作用的影响研究 取单层细胞培养板,弃去培养液,接种100个TCID50的不同病毒液50 μl于细胞孔,每1种病毒接种一块细胞板,留一行不接种病毒作为正常细胞对照。置37℃ 5%CO2培养箱中吸附1小时,倒掉病毒液,用不含小牛血清的Eagle维持液洗细胞面3次后,加入从最大无毒浓度(TC0,1:640)起倍比稀释6个浓度的各个药液(包括对照药)100 ml/孔,各浓度加3孔。同时设病毒对照、正常细胞对照,补液到200 ml/孔。置37℃ 5%CO2培养箱中培养3~4天,每天在倒置显微镜下检查细胞病变进展。
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4. 结果(表1) 计算获连花清瘟胶囊对Hep-2细胞的TC50=2.24 mg/ml,TC0=1.56 mg/ml,对IVA3和HVJ的TI达8;利巴韦林的 TC50=0.714 mg/ml,TC0=0.5 mg/ml,其0.179 mg/ml对病毒的抑制作用均为(+)。
5.结论 连花清瘟胶囊在EC50下对常见呼吸道感染有关的IVA、PIV、RSV、DV3、ADV7、HSV-1、HSV-2病毒均有抑制作用;尤其是对IVA3和HVJ抑制作用最强,而未显示明显抗肠道病毒CoxB族活性。利巴韦林对病毒皆有抑制作用。
二、连花清瘟胶囊浸膏体外抗
禽流感病毒H5N1和H9N2效果研究
1.目的 研究连花清瘟胶囊浸膏对禽流感病毒的杀灭效果。
2. 材料 ①受试药:连花清瘟胶囊浸膏(1 g生药/ml)。 ②禽流感病毒株:H5N1、H9N2,由农业部动物流感重点开放实验室保存。 ③鸡胚:10日龄SPF鸡胚,由中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
, 百拇医药
3.方法 将禽流感H5、H9亚型病毒10倍系列稀释,接种10日龄SPF鸡胚(0.1 ml/胚),测定病毒的半数感染剂量(EID50)。将受试药从含生药为1 g/ml起系列稀释,分别接种10日龄SPF鸡胚
(0.1 ml/胚),记录鸡胚死亡情况,以获得受试药TC0 。
连花清瘟胶囊浸膏对病毒的杀灭率试验(Klein-Defors悬浮法) 分别取禽流感H5、H9亚型病毒制成的107.63 EID50/0.1 ml和108.17 EID50/0.1 ml悬液,并与系列稀释的连花清瘟胶囊浸膏按1∶9混合,在(20±1)℃条件下作用10分钟后,用灭菌生理盐水行10倍递进稀释。对照组用灭菌生理盐水同法处理。稀释液接种10日龄SPF鸡胚(0.1 ml/胚),置于37℃温箱培养,记录鸡胚死亡情况。去掉24小时以内死亡鸡胚,并及时取出24小时以后的死胚,至96小时全部取出,逐个取尿囊液做血凝(HA)试验,HA试验(+)者判为鸡胚感染。
, 百拇医药
计算:按照鸡胚感染的结果,以下列方程式计算试验组和对照组鸡胚感染的阳性率、样本含EID50量与病毒杀灭率。
鸡胚感染的阳性率=HA(+)鸡胚数/接种鸡胚数
样本EID50的对数=L-d(S-0.5)(L为最低稀释倍数的对数;d为稀释度间对数的差;S为各稀释列阳性率之和)
病毒杀灭率=(对照样本EID50-试验样本EID50)/对照样本EID50×100%
4. 结果 连花清瘟胶囊浸膏浓度为0.1~0.25 g生药/ml和0.5~l g生药/ml时,体外对禽流感病毒H5N1、H9N2的杀灭率分别达99.9%和100%(表2)。受试药母液系列稀释接种鸡胚均未引起鸡胚死亡。
5. 结论 连花清瘟胶囊浸膏具显著体外完全杀病毒作用,对鸡胚无眼观毒性。
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三、连花清瘟胶囊在Vero-E6细胞内对SARS病毒抑制作用研究
1. 目的 研究连花清瘟胶囊体外抗SARS病毒作用。
2. 材料 ①受试药:连花清瘟胶囊(0.35 g/粒)一次4粒,一日三次。②对照药:利巴韦林(病毒唑)注射液,0.1 g/ml。③细胞:Vero-E6细胞。④病毒株:SARS病毒,由军事医学科学院提供的从病人肺组织分离的SARS病毒BJ 01株。
3. 方法 通过连花清瘟胶囊细胞毒性试验,获得其半数有毒浓度(TD50 ,l.44 mg/ml)和最大无毒浓度(TD0,3.63 mg/ml)。通过SARS病毒毒力测定(微量法)试验和REED-MUENCH法计算SARS病毒BJ01株TCID50为10-8。
连花清瘟胶囊对SARS病毒的抑制试验(细胞病变法) 将30~40万个/ml Vero-E6细胞接种到96孔培养板上,37℃、5%C02培养箱中培养18 小时,弃去生长液。将SARS病毒BJ01株第4代病毒液,用DMEM维持液稀释为100个TCID50/0.1 ml,每孔0.1 ml接种Vero-E6细胞,吸附2小时,弃去病毒液。设立正常细胞、病毒和利巴韦林阳性药物对照组。将接种后Vero-E6细胞置于37℃、5%C02培养箱培养,每天观察记录细胞病变(CPE)数,共5天。将该试验重复三次,结果一致。按REED-MUENCH法计算连花清瘟胶囊对SARS病毒的半数有效浓度(IC50)和TI。
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4. 结果 连花清瘟胶囊抑制SARS病毒的IC50为0.09 mg/ml(表3)。计算显示,以细胞病变为指标, 连花清瘟胶囊对SARS病毒的TI为40.33。利巴韦林抑制SARS病毒的IC50为0.03548 mg/m1。
5.结论 连花清瘟胶囊与利巴韦林均有明显体外抑制SARS病毒的活性。
四、连花清瘟胶囊
治疗流行性感冒的临床研究
1.目的 观察连花清瘟胶囊治疗流行性感冒的疗效和安全性。
2. 方法 采用阳性药平行对照、分层区组随机、双盲、多中心临床试验方法,将440例患者按3:1比率随机分入试验组和对照组,疗程3天,对照观察试验药与对照药的临床疗效。
病例入选标准 符合流行性感冒诊断标准(2001年中华医学会呼吸病学分会制定标准)、中医毒热袭肺证辨证标准(《中华人民共和国中医药行业标准》1994年第一版)、体温≥38.0℃、发病后48小时内、年龄18~50岁并签署了知情同意书的患者。实验室检查符合 ①外周血WBC不高或减低,淋巴细胞相对增加。②鼻咽分泌物或口腔含漱液分离流感病毒,采集咽拭子行病毒培养(MDCK培养法),用红细胞凝集抑制法鉴定。③用红细胞凝集抑制方法测定疾病初期(第1天)和恢复期(2周至3周)双份血清抗流感病毒抗体效价,达抗体滴度≥4倍升高。④患者呼吸道上皮细胞、标本经敏感细胞过夜增殖Ⅰ代后,查流感病毒抗原阳性。
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服药方法 试验组口服连花清瘟Ⅰ号或Ⅱ号胶囊0.35 g/粒,对照组口服标签为连花清瘟Ⅰ号胶囊的羚羊感冒胶囊0.42 g/粒或连花清瘟Ⅱ号胶囊(安慰剂),2 粒/次,3次/日,连服3天。
疗效判定标准 主要疗效指标 ①证候疗效 痊愈:治疗后积分为0,且无反复;显效:治疗后积分值降低≥70%;有效:30%≤治疗后积分值降低< 70%;无效:治疗后积分值降低不足30%。②体温疗效 痊愈:治疗24小时内,体温恢复正常且无反复;显效:治疗24小时内,体温降低≥1.0℃,但未至正常;有效:治疗24小时内,体温降低0.5℃-1.0℃(不含1.0℃),但未至正常;无效:治疗24小时内,体温降低不足0.5℃。③症状疗效 消失:治疗后症状消失;改善:治疗后积分较前降低,但未消失;不变:治疗后积分值未降低或增加。次要疗效指标 主症消失时间、体温复常率和发热起效时间。
如实填写不良事件记录表。
, 百拇医药 统计学分析 采用SPSS10.0、JMP of SAS统计分析软件,有效性分析采用考虑中心效应的CHM统计方法与意向性分析(ITT)和符合方案数据分析(PP)相结合的方法,所有统计检验均采用双侧检验,P≤0.05为差异显著;数据用均数±标准差表示,组间比较用Wilcoxon秩和检验、t检验和x2检验,主要计量疗效指标的分析采用协方差分析。
3. 结果 入选时两组人口学特征、生命体征、疾病情况、流感病毒类型等比较均无组间显著差异(P>0.05),具可比性。
服药后24小时,患者显效率和证候疗效以及体温、恶寒、肌肉酸痛、咳嗽、咽干或痛等症状的改善,试验组均显著好于对照组(均P<0.01),但头痛、乏力、鼻塞等症状改善无组间显著差异,PP分析和ITT分析结论一致(表4、5)。
试验组未见与试验药物相关的不良反应发生,对照组发生1例轻度腹泻,自行缓解。
4.结论 连花清瘟胶囊用于治疗流行性感冒(中医证候属毒热袭肺型)安全有效。, http://www.100md.com
军事医学科学院微生物流行病研究所,中国中医研究院中药研究所、西苑医院、广安门医院,北京中医药大学东直门医院和农业部动物流感开放实验室,河北医科大学(2003年5月至2004年2月)的研究表明,连花清瘟胶囊具有抗病毒和抑菌作用。
一、连花清瘟胶囊体外抗病毒
实验研究
, 百拇医药
1.目的 研究连花清瘟胶囊的体外抗病毒作用。
2. 材料 ①受试药:连花清瘟胶囊,1 g生药/ml。②对照药:利巴韦林(病毒唑原料药)。③病毒株:流感病毒甲3型(IVA3),副流感病毒1型(HVJ),呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒3型(ADV3)、7型(ADV7),单纯疱疹病毒1型 (HSV-1)、2型(HSV-2),柯萨奇病毒B4、B6(CoxB4、B6),均购自中国预防医学科学院病毒所。④细胞:人喉癌传代细胞Hep-2株,购自卫生部药品生物制品检定所。
3. 方法 将连花清瘟胶囊对Hep-2培养细胞毒性试验、病毒致细胞病变作用的影响试验和病毒毒力滴定试验结果,用Reed-Muench法计算连花清瘟胶囊50%毒性浓度(TC50)、50%有效浓度(EC50)和各病毒半数感染剂量(TCID50),求治疗指数TI(TI=TC50/EC50),TI值越高示药效越强。
连花清瘟胶囊对病毒致细胞病变作用的影响研究 取单层细胞培养板,弃去培养液,接种100个TCID50的不同病毒液50 μl于细胞孔,每1种病毒接种一块细胞板,留一行不接种病毒作为正常细胞对照。置37℃ 5%CO2培养箱中吸附1小时,倒掉病毒液,用不含小牛血清的Eagle维持液洗细胞面3次后,加入从最大无毒浓度(TC0,1:640)起倍比稀释6个浓度的各个药液(包括对照药)100 ml/孔,各浓度加3孔。同时设病毒对照、正常细胞对照,补液到200 ml/孔。置37℃ 5%CO2培养箱中培养3~4天,每天在倒置显微镜下检查细胞病变进展。
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4. 结果(表1) 计算获连花清瘟胶囊对Hep-2细胞的TC50=2.24 mg/ml,TC0=1.56 mg/ml,对IVA3和HVJ的TI达8;利巴韦林的 TC50=0.714 mg/ml,TC0=0.5 mg/ml,其0.179 mg/ml对病毒的抑制作用均为(+)。
5.结论 连花清瘟胶囊在EC50下对常见呼吸道感染有关的IVA、PIV、RSV、DV3、ADV7、HSV-1、HSV-2病毒均有抑制作用;尤其是对IVA3和HVJ抑制作用最强,而未显示明显抗肠道病毒CoxB族活性。利巴韦林对病毒皆有抑制作用。
二、连花清瘟胶囊浸膏体外抗
禽流感病毒H5N1和H9N2效果研究
1.目的 研究连花清瘟胶囊浸膏对禽流感病毒的杀灭效果。
2. 材料 ①受试药:连花清瘟胶囊浸膏(1 g生药/ml)。 ②禽流感病毒株:H5N1、H9N2,由农业部动物流感重点开放实验室保存。 ③鸡胚:10日龄SPF鸡胚,由中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
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3.方法 将禽流感H5、H9亚型病毒10倍系列稀释,接种10日龄SPF鸡胚(0.1 ml/胚),测定病毒的半数感染剂量(EID50)。将受试药从含生药为1 g/ml起系列稀释,分别接种10日龄SPF鸡胚
(0.1 ml/胚),记录鸡胚死亡情况,以获得受试药TC0 。
连花清瘟胶囊浸膏对病毒的杀灭率试验(Klein-Defors悬浮法) 分别取禽流感H5、H9亚型病毒制成的107.63 EID50/0.1 ml和108.17 EID50/0.1 ml悬液,并与系列稀释的连花清瘟胶囊浸膏按1∶9混合,在(20±1)℃条件下作用10分钟后,用灭菌生理盐水行10倍递进稀释。对照组用灭菌生理盐水同法处理。稀释液接种10日龄SPF鸡胚(0.1 ml/胚),置于37℃温箱培养,记录鸡胚死亡情况。去掉24小时以内死亡鸡胚,并及时取出24小时以后的死胚,至96小时全部取出,逐个取尿囊液做血凝(HA)试验,HA试验(+)者判为鸡胚感染。
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计算:按照鸡胚感染的结果,以下列方程式计算试验组和对照组鸡胚感染的阳性率、样本含EID50量与病毒杀灭率。
鸡胚感染的阳性率=HA(+)鸡胚数/接种鸡胚数
样本EID50的对数=L-d(S-0.5)(L为最低稀释倍数的对数;d为稀释度间对数的差;S为各稀释列阳性率之和)
病毒杀灭率=(对照样本EID50-试验样本EID50)/对照样本EID50×100%
4. 结果 连花清瘟胶囊浸膏浓度为0.1~0.25 g生药/ml和0.5~l g生药/ml时,体外对禽流感病毒H5N1、H9N2的杀灭率分别达99.9%和100%(表2)。受试药母液系列稀释接种鸡胚均未引起鸡胚死亡。
5. 结论 连花清瘟胶囊浸膏具显著体外完全杀病毒作用,对鸡胚无眼观毒性。
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三、连花清瘟胶囊在Vero-E6细胞内对SARS病毒抑制作用研究
1. 目的 研究连花清瘟胶囊体外抗SARS病毒作用。
2. 材料 ①受试药:连花清瘟胶囊(0.35 g/粒)一次4粒,一日三次。②对照药:利巴韦林(病毒唑)注射液,0.1 g/ml。③细胞:Vero-E6细胞。④病毒株:SARS病毒,由军事医学科学院提供的从病人肺组织分离的SARS病毒BJ 01株。
3. 方法 通过连花清瘟胶囊细胞毒性试验,获得其半数有毒浓度(TD50 ,l.44 mg/ml)和最大无毒浓度(TD0,3.63 mg/ml)。通过SARS病毒毒力测定(微量法)试验和REED-MUENCH法计算SARS病毒BJ01株TCID50为10-8。
连花清瘟胶囊对SARS病毒的抑制试验(细胞病变法) 将30~40万个/ml Vero-E6细胞接种到96孔培养板上,37℃、5%C02培养箱中培养18 小时,弃去生长液。将SARS病毒BJ01株第4代病毒液,用DMEM维持液稀释为100个TCID50/0.1 ml,每孔0.1 ml接种Vero-E6细胞,吸附2小时,弃去病毒液。设立正常细胞、病毒和利巴韦林阳性药物对照组。将接种后Vero-E6细胞置于37℃、5%C02培养箱培养,每天观察记录细胞病变(CPE)数,共5天。将该试验重复三次,结果一致。按REED-MUENCH法计算连花清瘟胶囊对SARS病毒的半数有效浓度(IC50)和TI。
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4. 结果 连花清瘟胶囊抑制SARS病毒的IC50为0.09 mg/ml(表3)。计算显示,以细胞病变为指标, 连花清瘟胶囊对SARS病毒的TI为40.33。利巴韦林抑制SARS病毒的IC50为0.03548 mg/m1。
5.结论 连花清瘟胶囊与利巴韦林均有明显体外抑制SARS病毒的活性。
四、连花清瘟胶囊
治疗流行性感冒的临床研究
1.目的 观察连花清瘟胶囊治疗流行性感冒的疗效和安全性。
2. 方法 采用阳性药平行对照、分层区组随机、双盲、多中心临床试验方法,将440例患者按3:1比率随机分入试验组和对照组,疗程3天,对照观察试验药与对照药的临床疗效。
病例入选标准 符合流行性感冒诊断标准(2001年中华医学会呼吸病学分会制定标准)、中医毒热袭肺证辨证标准(《中华人民共和国中医药行业标准》1994年第一版)、体温≥38.0℃、发病后48小时内、年龄18~50岁并签署了知情同意书的患者。实验室检查符合 ①外周血WBC不高或减低,淋巴细胞相对增加。②鼻咽分泌物或口腔含漱液分离流感病毒,采集咽拭子行病毒培养(MDCK培养法),用红细胞凝集抑制法鉴定。③用红细胞凝集抑制方法测定疾病初期(第1天)和恢复期(2周至3周)双份血清抗流感病毒抗体效价,达抗体滴度≥4倍升高。④患者呼吸道上皮细胞、标本经敏感细胞过夜增殖Ⅰ代后,查流感病毒抗原阳性。
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服药方法 试验组口服连花清瘟Ⅰ号或Ⅱ号胶囊0.35 g/粒,对照组口服标签为连花清瘟Ⅰ号胶囊的羚羊感冒胶囊0.42 g/粒或连花清瘟Ⅱ号胶囊(安慰剂),2 粒/次,3次/日,连服3天。
疗效判定标准 主要疗效指标 ①证候疗效 痊愈:治疗后积分为0,且无反复;显效:治疗后积分值降低≥70%;有效:30%≤治疗后积分值降低< 70%;无效:治疗后积分值降低不足30%。②体温疗效 痊愈:治疗24小时内,体温恢复正常且无反复;显效:治疗24小时内,体温降低≥1.0℃,但未至正常;有效:治疗24小时内,体温降低0.5℃-1.0℃(不含1.0℃),但未至正常;无效:治疗24小时内,体温降低不足0.5℃。③症状疗效 消失:治疗后症状消失;改善:治疗后积分较前降低,但未消失;不变:治疗后积分值未降低或增加。次要疗效指标 主症消失时间、体温复常率和发热起效时间。
如实填写不良事件记录表。
, 百拇医药 统计学分析 采用SPSS10.0、JMP of SAS统计分析软件,有效性分析采用考虑中心效应的CHM统计方法与意向性分析(ITT)和符合方案数据分析(PP)相结合的方法,所有统计检验均采用双侧检验,P≤0.05为差异显著;数据用均数±标准差表示,组间比较用Wilcoxon秩和检验、t检验和x2检验,主要计量疗效指标的分析采用协方差分析。
3. 结果 入选时两组人口学特征、生命体征、疾病情况、流感病毒类型等比较均无组间显著差异(P>0.05),具可比性。
服药后24小时,患者显效率和证候疗效以及体温、恶寒、肌肉酸痛、咳嗽、咽干或痛等症状的改善,试验组均显著好于对照组(均P<0.01),但头痛、乏力、鼻塞等症状改善无组间显著差异,PP分析和ITT分析结论一致(表4、5)。
试验组未见与试验药物相关的不良反应发生,对照组发生1例轻度腹泻,自行缓解。
4.结论 连花清瘟胶囊用于治疗流行性感冒(中医证候属毒热袭肺型)安全有效。, http://www.100md.com