络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络对动脉粥样硬化兔血管内皮细胞功能影响的研究(一)
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高海青
现任山东大学齐鲁医院副院长,教授,博士生导师;山东省医学会老年医学专业委员会主任委员,中国无创心功能研究会副主任委员,创建并担任山东省心功能研究会会长和山东省微量元素科学研究会理事长。
主要研究方向为:老年冠心病病因学、动脉粥样硬化免疫学、心血管活性药物靶位筛选。主持国际合作项目2项,国家自然科学基金项目2项,山东省自然科学基金项目1 项,山东省科技厅项目1项,横向项目1项,总经费共计120余万元。指导硕士生26名,毕业15名;指导博士生9名,博士后1名。获得省部级二等奖1 项,省部级三等奖4项,省教育厅应用成果三等奖1项,实用新型专利1项。主编著作7部,副主编著作1部。论文50余篇,SCI收录2篇。
摘要
目的 研究通心络对动脉粥样硬化(AS)兔血管内皮细胞功能的影响。
方法 将24只雄性新西兰大白兔随机分为正常对照(A)组、高胆固醇(B)组、通心络预防干预(C)组,并分别喂饲标准、标准+1 %胆固醇、标准+1 %胆固醇+通心络(1 g/kg.d)的颗粒饲料,于实验开始前1天和开始后的第4、8、12周末取空腹血,检测血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血清一氧化氮(NO)、血清可溶性血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)。12周末取血后处死试验兔,取主动脉作大体及镜下形态学观察;采用免疫组织化学方法,观察各组血管细胞黏附因子(VCAM-1)染色强弱。
结果 与A组比较,12周时 B、C组血清TC、LDL-C、NO、VCAM-1水平均显著升高,血清TG、HDL-C水平三组间无显著性差异;与B组比较,12周时C组血清NO升高(P<0.001),血清VCAM-1显著降低(P<0.001),其他血清学指标无显著性差异。病理分析显示C组兔的主动脉壁厚度和泡沫细胞数量明显较B组减少;C组VCAM-1阳性染色明显轻于B组。
结论 通心络能够通过保护血管内皮细胞并改善其功能,延缓动脉粥样硬化斑块的形成。
动脉粥样硬化是大多数心脑血管疾病的病理基础,尤其在冠状动脉性心脏病中,AS起着关键的作用。目前,大多数的研究着重于AS的二级预防,而相关的一级预防研究尚少。我们的实验采用含1 %胆固醇的颗粒饲料复制新西兰大白兔动脉粥样硬化模型,在制模的同时给予通心络(1 g/kg·d)进行预防干预,观察通心络对AS发生发展的影响,并从血脂和血管内皮功能方面探讨其作用机制。
材料与方法
材料
通心络由河北石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号为20030828。胆固醇购于上海新兴化工试剂研究所,批号为020628。总胆固醇测定试剂盒批号为DT67R,甘油三酯测定试剂盒批号为DT37A,低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒批号为040925,高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒批号为TT38B,均由浙江东瓯生物工程有限公司生产。一氧化氮测定试剂盒,由南京聚力生物医学工程研究所生产批号为041110。兔可溶性血管细胞黏附分子ELSA试剂盒,产品编号为DR803644,由美国加利福尼亚DR实验室提供,批号为2004091011。
方法
动物分组与处理
新西兰大白兔(购自山东齐鲁制药厂,合格证号:鲁动质字D20020613号)24只,雄性,6月龄,平均体重(2.62±0.21) kg;均分笼喂养,自由饮水,饲料量为每只每天100~120 g;在实验条件下适应性喂养1周后,被随机分为三组,每组8只。正常对照(A)组,每日给予标准颗粒饲料;高胆固醇(B)组,每日给予含1 %胆固醇的颗粒饲料;通心络预防干预(C)组,每日给予含1 %胆固醇的颗粒饲料同时给予通心络(1 g/kg·d)。各组兔均喂饲12周。
标本获取
于实验开始前1天及实验开始后的第4、8、12周末,获取各组兔的血液标本。其方法为清晨空腹称体重后,经耳中动脉采血4ml,待血自凝后,经4000r·min-1×10min离心,留取血清用于测定TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、VCAM-1。所有血样均保存于-20 ℃冰箱里待测。
实验开始后的第12周末,先经兔耳中动脉取空腹血4 ml待测,然后用气栓法处死动物。剪取兔主动脉弓以下主动脉,放入10%甲醛中浸泡固定,作大体观察,HE染色,比较观察内膜形态。取新鲜的斑块显著部位血管组织标本,液氮保存,以备行VCAM-1免疫组织化学检查。
检测与方法
血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量应用日立7170型全自动生化分析仪测定;血清NO采用硝酸还原酶法测定;血清VCAM-1采用酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法测定,各指标测定均严格按照试剂盒说明操作。
主动脉切片HE染色,观察其形态学改变并拍照。液氮保存的新鲜组织行VCAM-1免疫组织化学染色,观察染色情况并拍照。
统计学处理
各项测定值均以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS10.0统计分析系统软件进行分析,P<0.05为有统计学意义。组间计数资料的比较采用X2检验,计量资料的比较采用成组设计的两样本t检验。
结果
1. 实验前后各组兔体重及血脂水平比较
实验前,三组试验兔体重和各项血脂指标无显著性差异。实验第12周末,三组间试验兔体重无显著性差异;高胆固醇组和通心络预防干预组的TC、LDL-C水平均显著高于正常对照组,通心络预防干预组与高胆固醇组无显著性差异,三组间TG、HDL-C水平无显著性差异(表1~5,其中表4、5见2月16日第16版)。
2. 实验前后各组兔血清NO水平的比较
实验前三组试验兔血清NO水平无显著性差异。实验第12周末,高胆固醇组和通心络预防干预组试验兔NO水平显著升高,且通心络预防干预组NO水平明显高于高胆固醇组(表6,见2月16日第16版)。
3. 实验前后各组兔血清VCAM-1水平比较
实验前三组试验兔VCAM-1水平无显著性差异。第12周末,高胆固醇组和通心络预防干预组试验兔VCAM-1水平显著升高,但通心络预防干预组升高水平较高胆固醇组低,且两组间有显著性差异(表7,见2月16日第16版)。
4. 主动脉大体观察
第12周末,可见正常对照组试验兔主动脉内膜光滑有弹性,无脂质沉积。高胆固醇组试验兔主动脉内膜大量斑块形成并大小不等,有的融合成片,血管弹性明显降低。通心络预防干预组试验兔主动脉内膜尚光滑,可见小的斑块,多分布于血管分叉周围,血管弹性尚好(见图1~3)。
5. 主动脉HE染色观察
第12周末,可见正常对照组试验兔主动脉内皮连续完整,内膜下几乎没有脂质沉积,未见泡沫细胞。高胆固醇组试验兔主动脉内膜增厚,内皮时有不完整,内膜下可见大量泡沫细胞浸润和脂质沉积,表层可见明显纤维增生。通心络预防干预组试验兔主动脉内膜下有泡沫细胞浸润和脂质沉积,但程度远轻于高胆固醇组(图4~6,见2月16日第16版)。
6. 主动脉VCAM-1免疫组织化学染色显示
正常对照组试验兔主动脉内膜几乎无阳性染色。高胆固醇组试验兔阳性染色广泛分布在内膜及粥样斑块区。通心络预防干预组试验兔阳性细胞染色数量明显少于高胆固醇组(图7~9,见2月16日第16版)。, http://www.100md.com