抗BACP1抗体的制备及鉴定
The manufacture and identification of antiBACP1 antibody
BAI YuJie, SRINIVASAN Seetha, BAND Vamla, GAO QingSheng
1Institute of Genetic Diagnosis of Chinese PLA, Xi’an 710033, China, 2Department of Radiation Oncology, Tufts Medical School, Boston 02100, USA
【Abstract】 AIM: To prepare the antiBACP1 polyclonal antibody and identify its specificity. METHODS： GSTBACP1 fusion protein was expressed and purified from E. coli. Zelanian rabbits were immunized using the fusion protein and the antiserum was prepared. Western Blot and immunohistochemical experiments have been performed to identify the antibody’s specificity. RESULTS： This polyclonal antibody can recognize and bind BACP1 specifically in vitro and in vivo. CONCLUSION: This antiBACP1 antibody has high specificity and affinity with BACP1 and would be a very useful tool for study of the BACP1’s localization and function further.
【Keywords】 breast neoplasms; tumor suppressor gene; BRCA2;antibody
【摘要】 目的： 制备抗BACP1多克隆抗体并鉴定其特异性,用于BACP1蛋白定位及功能研究. 方法： 大肠杆菌表达GSTBACP1融合蛋白，采用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清. 采用Western Blot和间接免疫荧光染色等方法鉴定抗体的特异性. 结果： 抗BACP1抗体用于Western Blot和间接免疫荧光染色均可特异性识别BACP1蛋白，具有较高的特异性. 结论： 所制备的多克隆抗体具有较高特异性，为进一步分析BRACP1的定位和功能提供了重要工具.
【关键词】 乳腺癌；抑癌基因；乳腺癌易感基因；抗体
0引言
乳腺癌是西方妇女最常见的恶性肿瘤，发病率约为10%[1], 死亡率达30%. 约5%~10%的乳腺癌患者有家族性遗传倾向，迄今最明确的遗传因子是乳腺癌肿瘤抑制基因BRCA1[2]和BRCA2[3,4]. BRCA2参与双链DNA断裂损伤修复和同源重组、维持染色体稳定性及转录调控等功能[5-8]，但在乳腺癌发病中的作用仍待深入研究. 本研究室采用酵母双杂交系统筛选、克隆了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因，其中一个新发现的未知蛋白，结构分析推测可能为中心体蛋白，故命名为BACP1(BRCA2 associated centrosome protein1，BACP1). 为了研究分析BACP1的细胞内定位和功能，制备了抗BACP1多克隆抗体，并采用免疫荧光染色及Western blot等方法鉴定了抗体的特异性. 为进一步研究BACP1的生物功能提供了重要的实验手段.
1材料和方法
1.1材料
①细胞、菌种、质粒：酵母AH109细胞及酵母双杂交系统3全套质粒：pGBKT7(GAL4 DNA结合结构域),pGADT7(GAL4转录激活结构域),pCL, pGBKT753, pGADT7T (阳性对照质粒)和pGBKT7Lam(阴性对照质粒)等均购自CLONTECH公司. 正常乳腺上皮细胞76N细胞株，由本实验室培养保存. 原核GST融合蛋白表达载体pGEX4T2购自Pharmacia公司;真核表达载体pSG5购自CLONTECH公司. ②抗体及生化试剂：抗Myc mAb(9E10)；抗α微管蛋白mAb购自Sigma公司. FITC标记驴抗鼠IgG及驴抗兔IgG，Rhodamine标记驴抗鼠及驴抗兔IgG均购自Jackson ImmunoResearch公司. IPTG, Xgal, 琼脂糖、SDS, TEMED, 过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和DAPI (4,6Diamidino2 phenylindole dihydrochloride hydrat)等试剂购自Sigma公司； Glutathione Sepharose 4B为Pharmacia公司产品.
1.2方法
1.2.1GSTC38融合蛋白表达及纯化由酵母双杂交系统3筛选获得的BACP1基因片断(C38)插入GST融合蛋白表达载体 pGEX4T2，构建融合蛋白表达载体pGEX/C38, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得重组表达菌株DH5α/C38. 培养大肠杆菌DH5α/C38至对数期，IPTG(终浓度0.1 mmol/L)诱导表达GSTBACP1融合蛋白. 用Glutathione Sepharose 4B层析柱纯化GSTC38融合蛋白，纯化操作按说明书进行.
1.2.2抗体制备纯化的GSTC38融合蛋白免疫新西兰大白兔，融合蛋白与CFA充分乳化后免疫新西兰兔，第1次为足垫和背部皮下多点注射，每点0.1 mL，以后每隔2 wk注射1次，均为背部皮下多点注射，共免疫10次. 每2 wk加强注射一次，每周取血测定抗血清的滴度. 第8周处死家兔取血清. 采用Sepharose4B亲和层析柱纯化抗体(Pharmacia公司)，操作参照试剂说明书.
1.2.3WesternBlot检测外源表达的C38融合蛋白分别在大肠杆菌和真核细胞(293T)表达GSTC38和C38Myc融合蛋白，进行80 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别用抗BACP1多克隆抗体和抗Myc mAb进行Western Blot检测.
1.2.4免疫荧光染色检测外源表达MycBACP1融合蛋白构建真核表达载体pSG5/C38Myc, 磷酸钙法转染人正常乳腺上皮细胞76N，在培养皿中放入玻片，将76N细胞种植在载玻片上，取出玻片经100 mL/L甲醇-20℃固定1 h[9]. PBST缓冲液(含0.5 mL/L Triton X100的PBS)浸洗3次，每次10 min. 加封闭液(含30 mL/L正常羊血清的TBST缓冲液)室温下封闭1 h. 加入BACP1抗血清、抗Myc mAb(分别1∶2000；1∶5000稀释到含30 mL/L正常羊血清，50 g/L小牛血清白蛋白的PBST缓冲液中)共同孵育2 h. PBS缓冲液浸洗3次，每次10 min加入FITC标记驴抗兔IgG和Rhodamine标记驴抗鼠IgG，室温下孵育1 h. PBS缓冲液浸洗3次，每次10 min. DAPI染色标记细胞核DNA，荧光显微镜观测.
1.2.5间接荧光免疫染色检测内源性BACP1将抗BACP1抗体与GSTC38融合蛋白在4℃孵育，振摇过夜封闭抗体. 正常76N细胞分别用预处理后的抗体、免疫前血清、纯化的抗体进行免疫荧光染色. 染色方法同1.2.4.
2结果
2.1Western blot检测融合蛋白表达及抗体的特异性大肠杆菌DH5α/C38，经IPTG诱导，SDSPAGE进行检测，在86 000处出现GSTC38融合蛋白条带，与预期相对分子质量大小相一致. 采用制备的抗BACP1多克隆抗体进行Western blot分析证实了该融合蛋白的表达. 为了进一步确定此多克隆抗体的特异性，我们又对真核表达的C38Myc蛋白用抗Myc mAb进行了Western blot分析(Fig 1). 结果表明：我们制备的抗BACP1多克隆抗体能特异性识别原核及真核表达的BACP1蛋白片段C38.
2.2免疫荧光染色检测外源性表达BACP1pSG5/BACP1Myc真核表达质粒转染的76N细胞，用抗BACP1多克隆抗体和抗Myc mAb双重免疫荧光染色，荧光显微镜观察发现：两种不同抗体对外源表达的BACP1免疫荧光染色的细胞内定位完全吻合(Fig 2).
2.3免疫荧光染色检测内源性BACP1为进一步鉴定抗体的特异性及其对内源性BACP1的染色性能，分别采用: ①免疫前血清；②C38预吸附的抗BACP1多克隆抗体;③纯化的抗BACP1多克隆抗体与抗α微管蛋白抗体共染色. 荧光显微镜观察发现：免疫前血清和经C38预吸附的多克隆抗体中心体染色均为阴性，纯化的抗BACP1抗体成功染色中心体(Fig 3). 此结果不但证实了我们制备的多克隆抗体的特异性及其在免疫组织化学分析中的应用价值，并初步证实了BACP1是中心体蛋白的假设.
3讨论
研究蛋白质的功能的一个有效的方法是分析与之相互作用的蛋白. 例如，BRCA2在双链DNA断裂修复中的作用，主要是通过它与RAD51[10-12]之间的结合和相互作用发现的. 发现与BRCA2相互作用的76N cells were double stained by antiMyc mAb and antiBACP1 antibody, Rhodamine labeled donkey antimouse and FITC labeled antirabbit IgG were used for fluorescence staining, the nuclei were stained by DAPI.
新蛋白，有助于拓展对其新功能认识和研究. 酵母双杂交系统是一种有效筛选相互作用蛋白的新方法,我们利用此系统筛选获得了多种编码与BRCA2相互作用蛋白的基因序列，其中BACP1是一全新的未知蛋白. 克隆BACP1基因后经过核苷酸和氨基酸序列同源性比较和蛋白结构预测分析，发现BACP1与已知的中心粒组成蛋白Centrin结构相似，其蛋白二级结构含有由α螺旋连接的多个β片层棒状结构区域. 由此推测BACP1可能定位在细胞中心体. 蛋白的细胞定位影响或决定蛋白质的生理功能，确定蛋白质的细胞定位无疑可提示蛋白质的功能，尤其是对未知功能的新蛋白，可提供其功能研究的方向和线索. 为进行免疫荧光染色或其他免疫组织化学分析其细胞定位，特异性的抗体是最为重要的条件. 为此我们表达、纯化了GSTBACP1融合蛋白，并制备了用于免疫荧光染色的抗BACP1多克隆抗体.
由于我们制备的是多克隆抗体，应用于免疫染色和杂交分析前首先要确定其特异性，本研究我们采用了多种方法证实了抗体的特异性：① Western blot检测原核和真核表达的BACP1融合蛋白. ②未免疫血清和经BACP1蛋白预吸附的抗血清进行免疫染色，均显示阴性结果. 表明正常兔血清无抗BACP1抗体，同时此多克隆抗体可以被BACP1蛋白特异性阻断. ③上皮细胞表达的异源性BACP1Myc融合蛋白，用抗Myc mAb及抗BACP1多克隆抗体免疫荧光双重染色，发现其细胞内定位完全一致，表明抗BACP1多克隆抗体可以特异性识别表达的BACP1Myc融合蛋白. 上述结果证实了该抗体的特异性，此抗体可以用于BACP1的免疫组化分析.
早在85年前，Theodore Boveri就发现含有2个以上中心体的细胞可形成多极性纺锤体，导致染色体分离紊乱和基因组不稳定，这是导致肿瘤发生的关键步骤之一. 肿瘤抑制基因p53缺陷可导致中心体的过度增殖. 小鼠胚胎成纤维细胞BRCA1和BRCA2基因突变影响基因组的稳定性，具体表现在染色体重排、和非等倍体. 已有报道BRCA1定位于中心体，而BRCA2目前公认为细胞核蛋白，尚未见中心体定位的明确证据. 此多克隆抗体的制备成功，为研究BACP1蛋白定位及其功能奠定了良好的基础，与此同时成功完成BACP1的中心体定位，提示BRCA2可能参与细胞有丝分裂的调控，为BRCA2在乳腺癌发病中作用机制的研究开拓了新的方向.A-D: BACP1 was stained with preimmune serum; E-H: BACP1 was stained with pre absorbed antiserum; I-L: BACP1 was stained with purified antibody. A, E, I show the nuclei staining using DAPI; B, F, J show the αtubulin staining ; C,G,K show the BACP1 staining and D, H, L show the merged images.
【参考文献】
[1] Kelsey JL, HornRoss PL. Breast cancer: Magnitude of the problem and descriptive epidemiology [J]. Epidemiol Rev, 1993; 15: 7-16.
[2] Miki Y, Swensen J, ShattuckEidens D, et al. Candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 [J]. Science, 1994;266: 66-71.
[3] Wooster R, Bignell G, Lancaster J, et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 [J]. Nature, 1995; 378: 789-792.
[4] Venkitaraman AR. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2 [J]. Cell, 2002; 108 : 171-182.
[5] Sharan SK, Morimatsu M, Albrecht U, et al. Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2 [J]. Nature, 1997;386: 804-810.
[6] Marmorstein LY, Ouchi T, Aaronson SA. The BRCA2 gene product functionally interacts with p53 and RAD51 [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95: 13869-13874.
[7] Powell SN, Willers H, Fen X. BRCA2 Keeps Rad51 in Line: Highfidelity homologous recombination prevents breast and ovarian cancer [J]. Mol Cell, 2002;10(6):1262-1263.
[8] Vidarsson H, Mikaelsdottir EK, Rafnar T, et al. BRCA1 and BRCA2 bind Stat5a and suppress its transcriptional activity [J]. FEBS Letters, 2002; 532(12): 247-252.
[9] Rodionov VI, Lim SS, Gelfand VI, et al. Microtubule dynamics in melanophores [J]. J Cell Biol, 1994; 126: 1455-1464.
[10] Wong AK, Pero R, Ormonde PA, et al. RAD51 interacts with the evolutionarily conserved BRC motifs in the human breast cancer susceptibility gene brca2 [J]. J Biol Chem, 1997; 272:31941-31944.
[11] Sharan SK, Morimatsu M, Albrecht U, et al. Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2 [J]. Nature, 1997; 386:804-810.
[12] Chen CF, Chen PL, Zhong Q, et al. Expression of BRC repeats in breast cancer cells disrupts the BRCA2Rad51 complex and leads to radiation hypersensitivity and loss of G(2)/M checkpoint control [J]. J Biol Chem, 1999; 274:32931-32935.
作者简介：白玉杰(1965)，男(汉族)，河北省邢台市人. 博士. Tel.(029)83216587 Fax.(029)83285729Email. yujiebai@163.com
(1第四军医大学全军基因诊断技术研究所，陕西 西安 710033, 2塔夫茨大学医学院放射肿瘤研究所，美国 波士顿 02100)
编辑井晓梅, 百拇医药(白玉杰，SRINIVASAN Seetha2，BA)
BAI YuJie, SRINIVASAN Seetha, BAND Vamla, GAO QingSheng
1Institute of Genetic Diagnosis of Chinese PLA, Xi’an 710033, China, 2Department of Radiation Oncology, Tufts Medical School, Boston 02100, USA
【Abstract】 AIM: To prepare the antiBACP1 polyclonal antibody and identify its specificity. METHODS： GSTBACP1 fusion protein was expressed and purified from E. coli. Zelanian rabbits were immunized using the fusion protein and the antiserum was prepared. Western Blot and immunohistochemical experiments have been performed to identify the antibody’s specificity. RESULTS： This polyclonal antibody can recognize and bind BACP1 specifically in vitro and in vivo. CONCLUSION: This antiBACP1 antibody has high specificity and affinity with BACP1 and would be a very useful tool for study of the BACP1’s localization and function further.
【Keywords】 breast neoplasms; tumor suppressor gene; BRCA2;antibody
【摘要】 目的： 制备抗BACP1多克隆抗体并鉴定其特异性,用于BACP1蛋白定位及功能研究. 方法： 大肠杆菌表达GSTBACP1融合蛋白，采用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清. 采用Western Blot和间接免疫荧光染色等方法鉴定抗体的特异性. 结果： 抗BACP1抗体用于Western Blot和间接免疫荧光染色均可特异性识别BACP1蛋白，具有较高的特异性. 结论： 所制备的多克隆抗体具有较高特异性，为进一步分析BRACP1的定位和功能提供了重要工具.
【关键词】 乳腺癌；抑癌基因；乳腺癌易感基因；抗体
0引言
乳腺癌是西方妇女最常见的恶性肿瘤，发病率约为10%[1], 死亡率达30%. 约5%~10%的乳腺癌患者有家族性遗传倾向，迄今最明确的遗传因子是乳腺癌肿瘤抑制基因BRCA1[2]和BRCA2[3,4]. BRCA2参与双链DNA断裂损伤修复和同源重组、维持染色体稳定性及转录调控等功能[5-8]，但在乳腺癌发病中的作用仍待深入研究. 本研究室采用酵母双杂交系统筛选、克隆了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因，其中一个新发现的未知蛋白，结构分析推测可能为中心体蛋白，故命名为BACP1(BRCA2 associated centrosome protein1，BACP1). 为了研究分析BACP1的细胞内定位和功能，制备了抗BACP1多克隆抗体，并采用免疫荧光染色及Western blot等方法鉴定了抗体的特异性. 为进一步研究BACP1的生物功能提供了重要的实验手段.
1材料和方法
1.1材料
①细胞、菌种、质粒：酵母AH109细胞及酵母双杂交系统3全套质粒：pGBKT7(GAL4 DNA结合结构域),pGADT7(GAL4转录激活结构域),pCL, pGBKT753, pGADT7T (阳性对照质粒)和pGBKT7Lam(阴性对照质粒)等均购自CLONTECH公司. 正常乳腺上皮细胞76N细胞株，由本实验室培养保存. 原核GST融合蛋白表达载体pGEX4T2购自Pharmacia公司;真核表达载体pSG5购自CLONTECH公司. ②抗体及生化试剂：抗Myc mAb(9E10)；抗α微管蛋白mAb购自Sigma公司. FITC标记驴抗鼠IgG及驴抗兔IgG，Rhodamine标记驴抗鼠及驴抗兔IgG均购自Jackson ImmunoResearch公司. IPTG, Xgal, 琼脂糖、SDS, TEMED, 过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和DAPI (4,6Diamidino2 phenylindole dihydrochloride hydrat)等试剂购自Sigma公司； Glutathione Sepharose 4B为Pharmacia公司产品.
1.2方法
1.2.1GSTC38融合蛋白表达及纯化由酵母双杂交系统3筛选获得的BACP1基因片断(C38)插入GST融合蛋白表达载体 pGEX4T2，构建融合蛋白表达载体pGEX/C38, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得重组表达菌株DH5α/C38. 培养大肠杆菌DH5α/C38至对数期，IPTG(终浓度0.1 mmol/L)诱导表达GSTBACP1融合蛋白. 用Glutathione Sepharose 4B层析柱纯化GSTC38融合蛋白，纯化操作按说明书进行.
1.2.2抗体制备纯化的GSTC38融合蛋白免疫新西兰大白兔，融合蛋白与CFA充分乳化后免疫新西兰兔，第1次为足垫和背部皮下多点注射，每点0.1 mL，以后每隔2 wk注射1次，均为背部皮下多点注射，共免疫10次. 每2 wk加强注射一次，每周取血测定抗血清的滴度. 第8周处死家兔取血清. 采用Sepharose4B亲和层析柱纯化抗体(Pharmacia公司)，操作参照试剂说明书.
1.2.3WesternBlot检测外源表达的C38融合蛋白分别在大肠杆菌和真核细胞(293T)表达GSTC38和C38Myc融合蛋白，进行80 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别用抗BACP1多克隆抗体和抗Myc mAb进行Western Blot检测.
1.2.4免疫荧光染色检测外源表达MycBACP1融合蛋白构建真核表达载体pSG5/C38Myc, 磷酸钙法转染人正常乳腺上皮细胞76N，在培养皿中放入玻片，将76N细胞种植在载玻片上，取出玻片经100 mL/L甲醇-20℃固定1 h[9]. PBST缓冲液(含0.5 mL/L Triton X100的PBS)浸洗3次，每次10 min. 加封闭液(含30 mL/L正常羊血清的TBST缓冲液)室温下封闭1 h. 加入BACP1抗血清、抗Myc mAb(分别1∶2000；1∶5000稀释到含30 mL/L正常羊血清，50 g/L小牛血清白蛋白的PBST缓冲液中)共同孵育2 h. PBS缓冲液浸洗3次，每次10 min加入FITC标记驴抗兔IgG和Rhodamine标记驴抗鼠IgG，室温下孵育1 h. PBS缓冲液浸洗3次，每次10 min. DAPI染色标记细胞核DNA，荧光显微镜观测.
1.2.5间接荧光免疫染色检测内源性BACP1将抗BACP1抗体与GSTC38融合蛋白在4℃孵育，振摇过夜封闭抗体. 正常76N细胞分别用预处理后的抗体、免疫前血清、纯化的抗体进行免疫荧光染色. 染色方法同1.2.4.
2结果
2.1Western blot检测融合蛋白表达及抗体的特异性大肠杆菌DH5α/C38，经IPTG诱导，SDSPAGE进行检测，在86 000处出现GSTC38融合蛋白条带，与预期相对分子质量大小相一致. 采用制备的抗BACP1多克隆抗体进行Western blot分析证实了该融合蛋白的表达. 为了进一步确定此多克隆抗体的特异性，我们又对真核表达的C38Myc蛋白用抗Myc mAb进行了Western blot分析(Fig 1). 结果表明：我们制备的抗BACP1多克隆抗体能特异性识别原核及真核表达的BACP1蛋白片段C38.
2.2免疫荧光染色检测外源性表达BACP1pSG5/BACP1Myc真核表达质粒转染的76N细胞，用抗BACP1多克隆抗体和抗Myc mAb双重免疫荧光染色，荧光显微镜观察发现：两种不同抗体对外源表达的BACP1免疫荧光染色的细胞内定位完全吻合(Fig 2).
2.3免疫荧光染色检测内源性BACP1为进一步鉴定抗体的特异性及其对内源性BACP1的染色性能，分别采用: ①免疫前血清；②C38预吸附的抗BACP1多克隆抗体;③纯化的抗BACP1多克隆抗体与抗α微管蛋白抗体共染色. 荧光显微镜观察发现：免疫前血清和经C38预吸附的多克隆抗体中心体染色均为阴性，纯化的抗BACP1抗体成功染色中心体(Fig 3). 此结果不但证实了我们制备的多克隆抗体的特异性及其在免疫组织化学分析中的应用价值，并初步证实了BACP1是中心体蛋白的假设.
3讨论
研究蛋白质的功能的一个有效的方法是分析与之相互作用的蛋白. 例如，BRCA2在双链DNA断裂修复中的作用，主要是通过它与RAD51[10-12]之间的结合和相互作用发现的. 发现与BRCA2相互作用的76N cells were double stained by antiMyc mAb and antiBACP1 antibody, Rhodamine labeled donkey antimouse and FITC labeled antirabbit IgG were used for fluorescence staining, the nuclei were stained by DAPI.
新蛋白，有助于拓展对其新功能认识和研究. 酵母双杂交系统是一种有效筛选相互作用蛋白的新方法,我们利用此系统筛选获得了多种编码与BRCA2相互作用蛋白的基因序列，其中BACP1是一全新的未知蛋白. 克隆BACP1基因后经过核苷酸和氨基酸序列同源性比较和蛋白结构预测分析，发现BACP1与已知的中心粒组成蛋白Centrin结构相似，其蛋白二级结构含有由α螺旋连接的多个β片层棒状结构区域. 由此推测BACP1可能定位在细胞中心体. 蛋白的细胞定位影响或决定蛋白质的生理功能，确定蛋白质的细胞定位无疑可提示蛋白质的功能，尤其是对未知功能的新蛋白，可提供其功能研究的方向和线索. 为进行免疫荧光染色或其他免疫组织化学分析其细胞定位，特异性的抗体是最为重要的条件. 为此我们表达、纯化了GSTBACP1融合蛋白，并制备了用于免疫荧光染色的抗BACP1多克隆抗体.
由于我们制备的是多克隆抗体，应用于免疫染色和杂交分析前首先要确定其特异性，本研究我们采用了多种方法证实了抗体的特异性：① Western blot检测原核和真核表达的BACP1融合蛋白. ②未免疫血清和经BACP1蛋白预吸附的抗血清进行免疫染色，均显示阴性结果. 表明正常兔血清无抗BACP1抗体，同时此多克隆抗体可以被BACP1蛋白特异性阻断. ③上皮细胞表达的异源性BACP1Myc融合蛋白，用抗Myc mAb及抗BACP1多克隆抗体免疫荧光双重染色，发现其细胞内定位完全一致，表明抗BACP1多克隆抗体可以特异性识别表达的BACP1Myc融合蛋白. 上述结果证实了该抗体的特异性，此抗体可以用于BACP1的免疫组化分析.
早在85年前，Theodore Boveri就发现含有2个以上中心体的细胞可形成多极性纺锤体，导致染色体分离紊乱和基因组不稳定，这是导致肿瘤发生的关键步骤之一. 肿瘤抑制基因p53缺陷可导致中心体的过度增殖. 小鼠胚胎成纤维细胞BRCA1和BRCA2基因突变影响基因组的稳定性，具体表现在染色体重排、和非等倍体. 已有报道BRCA1定位于中心体，而BRCA2目前公认为细胞核蛋白，尚未见中心体定位的明确证据. 此多克隆抗体的制备成功，为研究BACP1蛋白定位及其功能奠定了良好的基础，与此同时成功完成BACP1的中心体定位，提示BRCA2可能参与细胞有丝分裂的调控，为BRCA2在乳腺癌发病中作用机制的研究开拓了新的方向.A-D: BACP1 was stained with preimmune serum; E-H: BACP1 was stained with pre absorbed antiserum; I-L: BACP1 was stained with purified antibody. A, E, I show the nuclei staining using DAPI; B, F, J show the αtubulin staining ; C,G,K show the BACP1 staining and D, H, L show the merged images.
【参考文献】
[1] Kelsey JL, HornRoss PL. Breast cancer: Magnitude of the problem and descriptive epidemiology [J]. Epidemiol Rev, 1993; 15: 7-16.
[2] Miki Y, Swensen J, ShattuckEidens D, et al. Candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 [J]. Science, 1994;266: 66-71.
[3] Wooster R, Bignell G, Lancaster J, et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 [J]. Nature, 1995; 378: 789-792.
[4] Venkitaraman AR. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2 [J]. Cell, 2002; 108 : 171-182.
[5] Sharan SK, Morimatsu M, Albrecht U, et al. Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2 [J]. Nature, 1997;386: 804-810.
[6] Marmorstein LY, Ouchi T, Aaronson SA. The BRCA2 gene product functionally interacts with p53 and RAD51 [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95: 13869-13874.
[7] Powell SN, Willers H, Fen X. BRCA2 Keeps Rad51 in Line: Highfidelity homologous recombination prevents breast and ovarian cancer [J]. Mol Cell, 2002;10(6):1262-1263.
[8] Vidarsson H, Mikaelsdottir EK, Rafnar T, et al. BRCA1 and BRCA2 bind Stat5a and suppress its transcriptional activity [J]. FEBS Letters, 2002; 532(12): 247-252.
[9] Rodionov VI, Lim SS, Gelfand VI, et al. Microtubule dynamics in melanophores [J]. J Cell Biol, 1994; 126: 1455-1464.
[10] Wong AK, Pero R, Ormonde PA, et al. RAD51 interacts with the evolutionarily conserved BRC motifs in the human breast cancer susceptibility gene brca2 [J]. J Biol Chem, 1997; 272:31941-31944.
[11] Sharan SK, Morimatsu M, Albrecht U, et al. Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2 [J]. Nature, 1997; 386:804-810.
[12] Chen CF, Chen PL, Zhong Q, et al. Expression of BRC repeats in breast cancer cells disrupts the BRCA2Rad51 complex and leads to radiation hypersensitivity and loss of G(2)/M checkpoint control [J]. J Biol Chem, 1999; 274:32931-32935.
作者简介：白玉杰(1965)，男(汉族)，河北省邢台市人. 博士. Tel.(029)83216587 Fax.(029)83285729Email. yujiebai@163.com
(1第四军医大学全军基因诊断技术研究所，陕西 西安 710033, 2塔夫茨大学医学院放射肿瘤研究所，美国 波士顿 02100)
编辑井晓梅, 百拇医药(白玉杰，SRINIVASAN Seetha2，BA)