兔慢性高眼压模型的建立
Establishment of ocular hypertension model in rabbits
WANG ChangPeng1，YANG XinGuang1，WANG XiaoJuan2，LI YangJun1
1Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China, 2 Department of Pharmacy, College of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To establish a stable ocular hypertension (OHT) model. METHODS: Left eyes of 10 rabbits were used as control eyes, their right eyes as model eyes. The OHT was induced by injecting 3 g/L carbomer into anterior chamber of the model eyes and paracentesis was performed in the control eyes but without the injection of carbomer. The intraocular pressure (IOP) was measured every day and the amplitudes of bwave and Opswave were measured before injection and one, two and four weeks after. Four weeks after the injection, retinal ganglion cells (RGCs) were counted. RESULTS: ①The IOP of model eyes was (4.47±1.41) kPa, significant higher than that (2.08±0.25) kPa of control eyes (t=4.798, P=0.001). ②The amplitudes of bwave in the control eyes and in model eyes were (211.49±57.22, 207.86±51.89, 201.77±56.47)μV, and (149.08±20.55, 121.12±27.99, 81.82±77.66)μV, respectively. The amplitudes of Opswave in control eyes and in model eyes were (77.45±24.08, 73.61±8.87, 79.66±21.94)μV. and (50.09±9.77, 39.99±8.98, 33.12±7.67)μV, respectively. The amplitudes of bwave and Opswave in control were significantly different from those in model eyes (P=0.000). The amplitudes of bwave and Opswave in model eyes were also significantly different at different time points (P=0.000). The amplitudes of bwave and Opswave in model eyes tended to decline during OHT (t=0.001, P=0.000). ③ RGCs of control eyes was (302.30±23.99)/10 mm, more than those of model eyes (89.20±10.86)/10 mm (t=23.685, P=0.000). CONCLUSION: The detection of IOP, function and configuration of retina proves that the OHT induced by injection of 3 g/L carbomer into anterior chamber of rabbit is a stable OHT model.
【Keywords】 ocular hypertension; electroretinogram; retinal ganglion cells; carbomer
【摘要】 目的: 建立一种持续时间较久的慢性高眼压动物模型. 方法: 新西兰白兔10只左眼为对照眼，右眼为模型眼. 模型眼前房注入3 g/L复方卡波姆溶液制作成慢性高眼压模型，对照眼只作前房穿刺. 每日测量眼压；在高眼压模型前和高眼压持续1, 2及4 wk共4个时间点，检测ERG的b波、Ops波的振幅；高眼压持续4 wk后检测视网膜节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)数目的变化. 结果: ① 模型眼的眼压(4.47±1.41)kPa，明显高于对照眼(2.08±0.25) kPa(t=4.798, P=0.001). ②高眼压持续1, 2及4 wk后，对照眼b波的振幅为(211.49±57.22, 207.86±51.89, 201.77±56.47)μV，Ops波的振幅为(77.45±24.08, 73.61±8.87, 79.66±21.94)μV；模型眼b波的振幅为(149.08±20.55, 121.12±27.99, 81.82±77.66)μV，Ops波的振幅为(50.09±9.77, 39.99±8.98, 33.12±7.67)μV；二者间b波、Ops波的振幅有非常显著性差异(P值均为0.000)，模型眼b波和Ops波的振幅在高眼压前和高眼压持续1,2及4 wk时有非常显著性差异(P值均为0.000)，并且随高眼压持续时间的延长有进行性降低的趋势(P值分别为0.001, 0.000). ③慢性高眼压持续4 wk后检测RGCs数目对照眼为(302.30±23.99)/10 mm和模型眼为(89.20±10.86)/10 mm，有非常显著性差异(t=23.685, P=0.000). 结论: 从眼压、视网膜功能和形态来衡量，兔眼前房注射3 g/L复方卡波姆溶液是一种理想的慢性高眼压模型.
【关键词】 眼高压；视网膜电图；视网膜节细胞；卡波姆
0引言
近年来的研究显示，视网膜在高眼压作用下，不仅视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)及其轴突受损，同时也跨神经元地影响了视网膜内核层及外核层[1]，使双极细胞和视杆、视锥细胞也受到损伤[2]. 我们通过给兔眼前房注入3 g/L复方卡波姆溶液升高眼压，测量对照眼和模型眼的眼压，视网膜电图(electroretinogram, ERG)b波及Ops波振幅，以及计数RGCs数目. 希望建立一种价格低廉，操作简单，持续较久的慢性高眼压动物模型，并借助眼压，ERG振幅和RGCs数目变化，从功能和结构方面来衡量这种慢性高眼压动物模型的效果.
1材料和方法
1.1材料
卡波姆940购自上海申兴制药厂，配制成3 g/L复方卡波姆溶液(含地塞米松为0.25 g/L). GT2000NV视觉电生理检测仪由第四军医大学航空航天医学系视电生理检查室提供.
1.2实验动物及分组
新西兰白兔10只，体质量2～3 kg ，兔龄12～16 mo. 由第四军医大学实验动物中心提供. 造模前用裂隙灯显微镜，眼底镜检查眼前节及眼底无异常，5 g/L的卡因眼液表面麻醉后schiotz眼压计连续测量眼压3 d，1次/d，眼压低于2.27 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)的动物方可采用. 每只动物的左眼为对照眼，右眼为模型眼.
1.3慢性高眼压模型的标准及制作方法
慢性高眼压模型以眼压升高大于2.93 kPa，并能持续1 wk为标准[3]，动物以速眠新0.1 mL/kg耳缘静脉注射行全身麻醉，5 g/L的卡因点双眼行表面麻醉，模型眼角膜缘用1 mL注射器穿刺，形成一个小针孔，然后在此小针孔对侧的角膜缘穿刺抽出房水约0.2 mL，换针管注入约0.1～0.2 mL的3 g/L复方卡波姆溶液，制作成慢性高眼压模型，测量眼压1次/d，维持眼压在2.93 kPa以上. 对照眼仅作前房穿刺.
1.4ERG的检查方法及刺激条件ERG的检查方法
按照国际临床视觉电生理学会1989年制定的国际标准[4]，充分散瞳暗适应30 min，将钢针电极插入两眼连线中点和同侧耳廓皮下，分别作为参考电极和接地电极，角膜接触电极放置于角膜表面，白炽闪光，闪光强度2.0 cd·s·m-2，通频带1～300 Hz.
1.5制作HE切片及计数
RGCs数目慢性高眼压持续4 wk后，兔耳缘静脉注射空气10 mL，处死动物，摘取眼球，角膜缘12点钟方位缝线定位，剪除角膜、虹膜、去除晶体及玻璃体，剩余眼球壁放入Bouin氏液中固定24 h，常规石蜡包埋，切片均通过视乳头和6点、12点钟方位，HE染色，用HPIAS1000图像测量系统进行RGCs计数，测量视乳头两侧各5 mm共10 mm范围内的RGCs数目.
1.6分析参数
每日测量每眼的眼压，如果模型眼的眼压低于2.93 kPa，则重复注入3 g/L复方卡波姆溶液；慢性高眼压模型前和高眼压模型后1, 2及4 wk共四个时间点记录每只眼的ERG，以 b波及Ops波的振幅作为观测指标，每眼做3遍，取平均值；每只眼以三张HE切片作RGCs计数，取平均值.
统计学处理: 实验数据用SPSS 10.0软件进行处理，对照眼和模型眼的眼压、RGCs数目分别进行配对t检验. 对照眼与模型眼间ERG振幅进行重复测量数据的方差分析.
2结果
2.1眼压及外眼的变化注入一次3 g/L复方卡波姆溶液后，眼压维持2.93 kPa以上，能够持续约2～3 wk. 模型眼在注入3 g/L复方卡波姆溶液后逐渐出现球结膜睫状充血，轻度水肿，角膜雾状混浊，3 h后眼压升高均超过2.93 kPa，前房略加深，房水清晰，瞳孔散大并呈竖椭圆形. 实验期间模型眼的眼压为(4.47±1.41) kPa，峰值为6 kPa；对照眼的眼压为(2.08±0.25) kPa，外眼无明显变化；二者间有非常显著性差异(t=4.798, P=0.001).
2.2ERG的b波和OPs波在不同时间点振幅的变化对照眼和模型眼间各波的振幅有非常显著性差异(P值均为0.000)，模型眼各波的振幅在高眼压前和高眼压持续1, 2及4 wk时有非常显著性差异(P值分别为0.000, 0.000)，并且随高眼压持续时间的延长有进行性降低的趋势(P值分别0.001, 0.000, Fig 1, Tab 1).表1慢性高眼压不同时间点兔眼ERG的b波、Ops波的振幅(略)
3讨论
3.1复方卡波姆溶液建立兔眼慢性高眼压模型的机制青光眼的研究过程中，如何建立理想的青光眼动物模型是前提性的工作. 杨新光等[5]将输液器内注满复方氯化钠液，输液器的一端连接血压计气囊，一端连接4号半针头穿刺入大鼠前房内，这样制作的急性高眼压模型，对眼压的控制直观且精确，是一种非常理想的制作急性高眼压模型方法. 较为理想的慢性高眼压模型是通过激光产生的青光眼动物模型[6]. 国外的学者[7，8]多采用氩激光照射大鼠或恒河猴小梁网来诱导慢性高眼压的产生. 由于激光制作慢性高眼压模型的价格较贵，操作复杂，在国内应用得不多.
卡波姆[9]的水溶液在pH值为6~12时形成凝胶状，并且随pH值升高，其黏稠性增加，将其注入前房后，房水的pH值在7左右，使卡波姆从溶液状态变成凝胶状，阻塞房角和小梁网，防碍房水的排出，并且不易从注入点返流出来. 另外，我们在注入复方卡波姆溶液前，先在对侧角膜缘穿刺，形成一个针孔，是因为注入复方卡波姆溶液过程中，眼内容物突然增加，会造成眼内压急剧升高，房水在过高的压力下会自动从此针孔中渗漏出，防止兔眼角巩膜扩张，前房内注入复方卡波姆溶液后眼压中等程度升高，并且稳定在一定的水平. 因为消除了角巩膜扩张造成的短期内眼压又降低的情况，所以注入一次复方卡波姆溶液，能维持高于2.93 kPa达2～3 wk. 实验期间模型眼的眼压为(4.47±1.41) kPa，对照眼为(2.08±0.25) kPa，二者有非常显著性差异(t=4.798, P=0.001)，模型眼前房内注入复方卡波姆溶液，约3 h后眼压均超过2.93 kPa，并且注射一次能持续2～3 wk，按照眼压升高大于2.93 kPa，并能持续1 wk为慢性高眼压动物模型的标准[3]，10只模型眼均为成功的慢性高眼压模型，因此，从升高眼压的角度可以认为前房内注入复方卡波姆溶液是一种较理想的制作慢性高眼压动物模型的方法.
3.2兔眼慢性高眼压模型ERG振幅变化的分析ERG的变化能反应视网膜功能状态，a波反映外核层的功能状态，b波反映内核层的功能状态[4，10]，对照眼和模型眼b波的振幅有非常显著性差异(P=0.000)，模型眼b波的振幅在高眼压前和高眼压持续1, 2及4 wk时有非常显著性差异(P=0.000)，并且随高眼压持续时间延长有进行性降低的趋势(P=0.001). 这和Velten等[11]的临床研究结果相一致. 表明兔眼前房注入3 g/L卡波姆溶液诱导的慢性高眼压模型可造成视网膜功能损伤，高眼压持续时间越长，损伤越严重.
Ops波对视网膜循环障碍特别敏感，在视网膜循环受阻时，Ops波的异常往往先于a波和b波的改变，且Ops波的下降程度与视网膜病变的严重程度相一致[12]，对照眼和模型眼Ops波的振幅有非常显著性差异(P=0.000)，模型眼Ops波的振幅在高眼压前和高眼压持续1, 2及4 wk时有非常显著性差异(P=0.000)，并随高眼压持续时间延长有进行性降低的趋势(P=0.000). 说明3 g/L复方卡波姆溶液诱导的兔眼内压升高，会导致视网膜缺血，并随高眼压持续时间延长，视网膜缺血的程度不断加重.
3.3兔眼慢性高眼压模型RGCs数目的变化青光眼的病理基础是RGCs及其轴突数目不断减少，在研究对慢性青光眼的损伤和治疗时，通常以RGCs数目作为观察指标[7，13]. 因此，我们把RGCs数目变化用来作为衡量慢性高眼压动物模型效果的指标之一；本实验结果显示慢性高眼压持续4 wk后，对照眼的RGCs为(302.30±23.99)/10 mm，模型眼为(89.20±10.86)/10 mm，有非常显著性差异(t=23.685, P=0.000). 从形态学的角度，可以认为兔眼前房注射3 g/L卡波姆溶液是一种较好的慢性青光眼模型.
综上所述，我们通过给兔眼前房注射3 g/L复方卡波姆溶液，能诱导眼压中等程度地升高，并维持较长时间；造成视网膜缺血和功能损害，而且视网膜缺血和功能损害随时间延长而不断加重；同时高眼压持续4 wk后，RGCs明显减少. 所以从眼压、视网膜功能状态及形态学变化的角度，可以认为兔眼前房注射3 g/L复方卡波姆溶液是一种理想的慢性高眼压动物模型.
【参考文献】
[1] 骆荣江，葛坚，林健贤. 兔眼视网膜各组织对高眼压不同易损性的研究[J]. 中华眼科杂志，2001;37(4)：302-304.
Luo RJ，Ge J，Lin JX. A study on susceptibility of different layers of rabbit retina to ocular hypertension[J]. Chin J Ophthalmol，2001;37(4)：302-304.
[2] 宋宗明，崔守信，张德秀. 川芎嗪对兔眼高压下视网膜神经节细胞和双极细胞损伤的保护作用[J]. 第四军医大学学报，2001;22(6)：514-517.
Song ZM，Cui SX，Zhang DX. Protective effects of TMP on the retinal ganglions and bipolar cells of rabbits with elevated intraocular pressure[J]. J Fourth Mil Med Univ，2001;22(6)：514-517.
[3] 徐岩，陈祖基，宋洁贞. 复方卡波姆诱发的兔高眼压模型与其它兔高眼压模型的比较研究[J]. 中华眼科杂志，2002;38(3):172-175.
Xu Y, Chen ZJ, Song JZ. A study of experimental carbomer glaucoma and experimental glaucoma in rabbits [J]. Chin J Ophthalmol，2002;38(3):172-175.
[4] 潘映辐. 临床诱发电位学[M]. 北京: 人民卫生出版社，1988: 465-469.
[5] 杨新光，李健民.大鼠实验性高眼压视网膜缺血再灌注损伤模型的建立及其机制研究[J]. 第四军医大学学报，2002；23(2):126-129.
Yang XG，Li JM. Study on ischemia reperfusion retinal damage of experimental ocular hypertension rats[J]. J Fourth Mil Med Univ，2002;23(2)：126-129.
[6] 孙兴杯，俞道义. 高眼压性青光眼动物模型[J]. 国外医学眼科学分册，1999;23(2)：73-82.
Sun XH，Yu DY. Glaucoma model of ocular hypertension[review] [J]. Foreign Med Sci·Sect Ophthalmol，1999;23(2)：73-82.
[7] Bakalash S, Kipnis J, Yoles E. Resistance of retinal ganglion cells to an increase in intraocular pressure is immunedependent[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002;43(8):2648-2653.
[8] CarterDawson L, Crawford ML, Harwerth RS. Vitreal glutamate concentration in monkeys with experimental glaucoma[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002;43(8):2633-2637.
[9] 罗明生, 高天惠. 药剂辅料大全[M]. 成都: 四川科学技术出版社, 1995:383-386.
[10] Shiells RA, Falk G. Contribution of rod, onbipolar,and horiaontal cell light responses to the ERG of dogfish retina[J]. Vis Neurosci, 1999;16:503-511.
[11] Velten IM, Horn FK, Korth M, et al. The bwave of the dark adapted flash electroretinogram in the patients with advanced asymmetrical glaucoma and normal subject[J]. Br J Ophthalmol, 2001;85:403-409.
[12] 许建华，刘哲丽，乔光，等. 视网膜振荡电位对糖尿病患者白内障术后视力的预测[J]. 中国实用眼科杂志，2002;20(12)：915-917.
Xu JH，Liu ZL，Qiao G，et al. The pwrediction to the vision of diabetic patients by oscillatory potentials(Ops) of retinogram after cataract operation[J]. Chin J Practical Ophthalmol，2002;20(12)：915-917.
[13] Neufeld AH, Das S, Vora S. A Prodrug of a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase is neuroprotective in the rat model of glaucoma[J]. J Glaucoma, 2002;11(3):221-225.
基金项目：全军医药卫生科研基金(01MA197)
通讯作者：杨新光. Tel.(029)83377759 Email.dotdsy@fmmu.edu.cn
作者简介：王昌鹏(1973)，男(汉族)，重庆市人. 硕士生(导师杨新光)，主治医师. Tel.(029)83377759Email.wooodhead@sina.com
(1第四军医大学唐都医院眼科， 陕西 西安 710038，2第四军医大学口腔医学院药剂科，陕西 西安 710033)
编辑王小仲, 百拇医药(王昌鹏,杨新光,王晓娟,李养军)
WANG ChangPeng1，YANG XinGuang1，WANG XiaoJuan2，LI YangJun1
1Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China, 2 Department of Pharmacy, College of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To establish a stable ocular hypertension (OHT) model. METHODS: Left eyes of 10 rabbits were used as control eyes, their right eyes as model eyes. The OHT was induced by injecting 3 g/L carbomer into anterior chamber of the model eyes and paracentesis was performed in the control eyes but without the injection of carbomer. The intraocular pressure (IOP) was measured every day and the amplitudes of bwave and Opswave were measured before injection and one, two and four weeks after. Four weeks after the injection, retinal ganglion cells (RGCs) were counted. RESULTS: ①The IOP of model eyes was (4.47±1.41) kPa, significant higher than that (2.08±0.25) kPa of control eyes (t=4.798, P=0.001). ②The amplitudes of bwave in the control eyes and in model eyes were (211.49±57.22, 207.86±51.89, 201.77±56.47)μV, and (149.08±20.55, 121.12±27.99, 81.82±77.66)μV, respectively. The amplitudes of Opswave in control eyes and in model eyes were (77.45±24.08, 73.61±8.87, 79.66±21.94)μV. and (50.09±9.77, 39.99±8.98, 33.12±7.67)μV, respectively. The amplitudes of bwave and Opswave in control were significantly different from those in model eyes (P=0.000). The amplitudes of bwave and Opswave in model eyes were also significantly different at different time points (P=0.000). The amplitudes of bwave and Opswave in model eyes tended to decline during OHT (t=0.001, P=0.000). ③ RGCs of control eyes was (302.30±23.99)/10 mm, more than those of model eyes (89.20±10.86)/10 mm (t=23.685, P=0.000). CONCLUSION: The detection of IOP, function and configuration of retina proves that the OHT induced by injection of 3 g/L carbomer into anterior chamber of rabbit is a stable OHT model.
【Keywords】 ocular hypertension; electroretinogram; retinal ganglion cells; carbomer
【摘要】 目的: 建立一种持续时间较久的慢性高眼压动物模型. 方法: 新西兰白兔10只左眼为对照眼，右眼为模型眼. 模型眼前房注入3 g/L复方卡波姆溶液制作成慢性高眼压模型，对照眼只作前房穿刺. 每日测量眼压；在高眼压模型前和高眼压持续1, 2及4 wk共4个时间点，检测ERG的b波、Ops波的振幅；高眼压持续4 wk后检测视网膜节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)数目的变化. 结果: ① 模型眼的眼压(4.47±1.41)kPa，明显高于对照眼(2.08±0.25) kPa(t=4.798, P=0.001). ②高眼压持续1, 2及4 wk后，对照眼b波的振幅为(211.49±57.22, 207.86±51.89, 201.77±56.47)μV，Ops波的振幅为(77.45±24.08, 73.61±8.87, 79.66±21.94)μV；模型眼b波的振幅为(149.08±20.55, 121.12±27.99, 81.82±77.66)μV，Ops波的振幅为(50.09±9.77, 39.99±8.98, 33.12±7.67)μV；二者间b波、Ops波的振幅有非常显著性差异(P值均为0.000)，模型眼b波和Ops波的振幅在高眼压前和高眼压持续1,2及4 wk时有非常显著性差异(P值均为0.000)，并且随高眼压持续时间的延长有进行性降低的趋势(P值分别为0.001, 0.000). ③慢性高眼压持续4 wk后检测RGCs数目对照眼为(302.30±23.99)/10 mm和模型眼为(89.20±10.86)/10 mm，有非常显著性差异(t=23.685, P=0.000). 结论: 从眼压、视网膜功能和形态来衡量，兔眼前房注射3 g/L复方卡波姆溶液是一种理想的慢性高眼压模型.
【关键词】 眼高压；视网膜电图；视网膜节细胞；卡波姆
0引言
近年来的研究显示，视网膜在高眼压作用下，不仅视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)及其轴突受损，同时也跨神经元地影响了视网膜内核层及外核层[1]，使双极细胞和视杆、视锥细胞也受到损伤[2]. 我们通过给兔眼前房注入3 g/L复方卡波姆溶液升高眼压，测量对照眼和模型眼的眼压，视网膜电图(electroretinogram, ERG)b波及Ops波振幅，以及计数RGCs数目. 希望建立一种价格低廉，操作简单，持续较久的慢性高眼压动物模型，并借助眼压，ERG振幅和RGCs数目变化，从功能和结构方面来衡量这种慢性高眼压动物模型的效果.
1材料和方法
1.1材料
卡波姆940购自上海申兴制药厂，配制成3 g/L复方卡波姆溶液(含地塞米松为0.25 g/L). GT2000NV视觉电生理检测仪由第四军医大学航空航天医学系视电生理检查室提供.
1.2实验动物及分组
新西兰白兔10只，体质量2～3 kg ，兔龄12～16 mo. 由第四军医大学实验动物中心提供. 造模前用裂隙灯显微镜，眼底镜检查眼前节及眼底无异常，5 g/L的卡因眼液表面麻醉后schiotz眼压计连续测量眼压3 d，1次/d，眼压低于2.27 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)的动物方可采用. 每只动物的左眼为对照眼，右眼为模型眼.
1.3慢性高眼压模型的标准及制作方法
慢性高眼压模型以眼压升高大于2.93 kPa，并能持续1 wk为标准[3]，动物以速眠新0.1 mL/kg耳缘静脉注射行全身麻醉，5 g/L的卡因点双眼行表面麻醉，模型眼角膜缘用1 mL注射器穿刺，形成一个小针孔，然后在此小针孔对侧的角膜缘穿刺抽出房水约0.2 mL，换针管注入约0.1～0.2 mL的3 g/L复方卡波姆溶液，制作成慢性高眼压模型，测量眼压1次/d，维持眼压在2.93 kPa以上. 对照眼仅作前房穿刺.
1.4ERG的检查方法及刺激条件ERG的检查方法
按照国际临床视觉电生理学会1989年制定的国际标准[4]，充分散瞳暗适应30 min，将钢针电极插入两眼连线中点和同侧耳廓皮下，分别作为参考电极和接地电极，角膜接触电极放置于角膜表面，白炽闪光，闪光强度2.0 cd·s·m-2，通频带1～300 Hz.
1.5制作HE切片及计数
RGCs数目慢性高眼压持续4 wk后，兔耳缘静脉注射空气10 mL，处死动物，摘取眼球，角膜缘12点钟方位缝线定位，剪除角膜、虹膜、去除晶体及玻璃体，剩余眼球壁放入Bouin氏液中固定24 h，常规石蜡包埋，切片均通过视乳头和6点、12点钟方位，HE染色，用HPIAS1000图像测量系统进行RGCs计数，测量视乳头两侧各5 mm共10 mm范围内的RGCs数目.
1.6分析参数
每日测量每眼的眼压，如果模型眼的眼压低于2.93 kPa，则重复注入3 g/L复方卡波姆溶液；慢性高眼压模型前和高眼压模型后1, 2及4 wk共四个时间点记录每只眼的ERG，以 b波及Ops波的振幅作为观测指标，每眼做3遍，取平均值；每只眼以三张HE切片作RGCs计数，取平均值.
统计学处理: 实验数据用SPSS 10.0软件进行处理，对照眼和模型眼的眼压、RGCs数目分别进行配对t检验. 对照眼与模型眼间ERG振幅进行重复测量数据的方差分析.
2结果
2.1眼压及外眼的变化注入一次3 g/L复方卡波姆溶液后，眼压维持2.93 kPa以上，能够持续约2～3 wk. 模型眼在注入3 g/L复方卡波姆溶液后逐渐出现球结膜睫状充血，轻度水肿，角膜雾状混浊，3 h后眼压升高均超过2.93 kPa，前房略加深，房水清晰，瞳孔散大并呈竖椭圆形. 实验期间模型眼的眼压为(4.47±1.41) kPa，峰值为6 kPa；对照眼的眼压为(2.08±0.25) kPa，外眼无明显变化；二者间有非常显著性差异(t=4.798, P=0.001).
2.2ERG的b波和OPs波在不同时间点振幅的变化对照眼和模型眼间各波的振幅有非常显著性差异(P值均为0.000)，模型眼各波的振幅在高眼压前和高眼压持续1, 2及4 wk时有非常显著性差异(P值分别为0.000, 0.000)，并且随高眼压持续时间的延长有进行性降低的趋势(P值分别0.001, 0.000, Fig 1, Tab 1).表1慢性高眼压不同时间点兔眼ERG的b波、Ops波的振幅(略)
3讨论
3.1复方卡波姆溶液建立兔眼慢性高眼压模型的机制青光眼的研究过程中，如何建立理想的青光眼动物模型是前提性的工作. 杨新光等[5]将输液器内注满复方氯化钠液，输液器的一端连接血压计气囊，一端连接4号半针头穿刺入大鼠前房内，这样制作的急性高眼压模型，对眼压的控制直观且精确，是一种非常理想的制作急性高眼压模型方法. 较为理想的慢性高眼压模型是通过激光产生的青光眼动物模型[6]. 国外的学者[7，8]多采用氩激光照射大鼠或恒河猴小梁网来诱导慢性高眼压的产生. 由于激光制作慢性高眼压模型的价格较贵，操作复杂，在国内应用得不多.
卡波姆[9]的水溶液在pH值为6~12时形成凝胶状，并且随pH值升高，其黏稠性增加，将其注入前房后，房水的pH值在7左右，使卡波姆从溶液状态变成凝胶状，阻塞房角和小梁网，防碍房水的排出，并且不易从注入点返流出来. 另外，我们在注入复方卡波姆溶液前，先在对侧角膜缘穿刺，形成一个针孔，是因为注入复方卡波姆溶液过程中，眼内容物突然增加，会造成眼内压急剧升高，房水在过高的压力下会自动从此针孔中渗漏出，防止兔眼角巩膜扩张，前房内注入复方卡波姆溶液后眼压中等程度升高，并且稳定在一定的水平. 因为消除了角巩膜扩张造成的短期内眼压又降低的情况，所以注入一次复方卡波姆溶液，能维持高于2.93 kPa达2～3 wk. 实验期间模型眼的眼压为(4.47±1.41) kPa，对照眼为(2.08±0.25) kPa，二者有非常显著性差异(t=4.798, P=0.001)，模型眼前房内注入复方卡波姆溶液，约3 h后眼压均超过2.93 kPa，并且注射一次能持续2～3 wk，按照眼压升高大于2.93 kPa，并能持续1 wk为慢性高眼压动物模型的标准[3]，10只模型眼均为成功的慢性高眼压模型，因此，从升高眼压的角度可以认为前房内注入复方卡波姆溶液是一种较理想的制作慢性高眼压动物模型的方法.
3.2兔眼慢性高眼压模型ERG振幅变化的分析ERG的变化能反应视网膜功能状态，a波反映外核层的功能状态，b波反映内核层的功能状态[4，10]，对照眼和模型眼b波的振幅有非常显著性差异(P=0.000)，模型眼b波的振幅在高眼压前和高眼压持续1, 2及4 wk时有非常显著性差异(P=0.000)，并且随高眼压持续时间延长有进行性降低的趋势(P=0.001). 这和Velten等[11]的临床研究结果相一致. 表明兔眼前房注入3 g/L卡波姆溶液诱导的慢性高眼压模型可造成视网膜功能损伤，高眼压持续时间越长，损伤越严重.
Ops波对视网膜循环障碍特别敏感，在视网膜循环受阻时，Ops波的异常往往先于a波和b波的改变，且Ops波的下降程度与视网膜病变的严重程度相一致[12]，对照眼和模型眼Ops波的振幅有非常显著性差异(P=0.000)，模型眼Ops波的振幅在高眼压前和高眼压持续1, 2及4 wk时有非常显著性差异(P=0.000)，并随高眼压持续时间延长有进行性降低的趋势(P=0.000). 说明3 g/L复方卡波姆溶液诱导的兔眼内压升高，会导致视网膜缺血，并随高眼压持续时间延长，视网膜缺血的程度不断加重.
3.3兔眼慢性高眼压模型RGCs数目的变化青光眼的病理基础是RGCs及其轴突数目不断减少，在研究对慢性青光眼的损伤和治疗时，通常以RGCs数目作为观察指标[7，13]. 因此，我们把RGCs数目变化用来作为衡量慢性高眼压动物模型效果的指标之一；本实验结果显示慢性高眼压持续4 wk后，对照眼的RGCs为(302.30±23.99)/10 mm，模型眼为(89.20±10.86)/10 mm，有非常显著性差异(t=23.685, P=0.000). 从形态学的角度，可以认为兔眼前房注射3 g/L卡波姆溶液是一种较好的慢性青光眼模型.
综上所述，我们通过给兔眼前房注射3 g/L复方卡波姆溶液，能诱导眼压中等程度地升高，并维持较长时间；造成视网膜缺血和功能损害，而且视网膜缺血和功能损害随时间延长而不断加重；同时高眼压持续4 wk后，RGCs明显减少. 所以从眼压、视网膜功能状态及形态学变化的角度，可以认为兔眼前房注射3 g/L复方卡波姆溶液是一种理想的慢性高眼压动物模型.
【参考文献】
[1] 骆荣江，葛坚，林健贤. 兔眼视网膜各组织对高眼压不同易损性的研究[J]. 中华眼科杂志，2001;37(4)：302-304.
Luo RJ，Ge J，Lin JX. A study on susceptibility of different layers of rabbit retina to ocular hypertension[J]. Chin J Ophthalmol，2001;37(4)：302-304.
[2] 宋宗明，崔守信，张德秀. 川芎嗪对兔眼高压下视网膜神经节细胞和双极细胞损伤的保护作用[J]. 第四军医大学学报，2001;22(6)：514-517.
Song ZM，Cui SX，Zhang DX. Protective effects of TMP on the retinal ganglions and bipolar cells of rabbits with elevated intraocular pressure[J]. J Fourth Mil Med Univ，2001;22(6)：514-517.
[3] 徐岩，陈祖基，宋洁贞. 复方卡波姆诱发的兔高眼压模型与其它兔高眼压模型的比较研究[J]. 中华眼科杂志，2002;38(3):172-175.
Xu Y, Chen ZJ, Song JZ. A study of experimental carbomer glaucoma and experimental glaucoma in rabbits [J]. Chin J Ophthalmol，2002;38(3):172-175.
[4] 潘映辐. 临床诱发电位学[M]. 北京: 人民卫生出版社，1988: 465-469.
[5] 杨新光，李健民.大鼠实验性高眼压视网膜缺血再灌注损伤模型的建立及其机制研究[J]. 第四军医大学学报，2002；23(2):126-129.
Yang XG，Li JM. Study on ischemia reperfusion retinal damage of experimental ocular hypertension rats[J]. J Fourth Mil Med Univ，2002;23(2)：126-129.
[6] 孙兴杯，俞道义. 高眼压性青光眼动物模型[J]. 国外医学眼科学分册，1999;23(2)：73-82.
Sun XH，Yu DY. Glaucoma model of ocular hypertension[review] [J]. Foreign Med Sci·Sect Ophthalmol，1999;23(2)：73-82.
[7] Bakalash S, Kipnis J, Yoles E. Resistance of retinal ganglion cells to an increase in intraocular pressure is immunedependent[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002;43(8):2648-2653.
[8] CarterDawson L, Crawford ML, Harwerth RS. Vitreal glutamate concentration in monkeys with experimental glaucoma[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002;43(8):2633-2637.
[9] 罗明生, 高天惠. 药剂辅料大全[M]. 成都: 四川科学技术出版社, 1995:383-386.
[10] Shiells RA, Falk G. Contribution of rod, onbipolar,and horiaontal cell light responses to the ERG of dogfish retina[J]. Vis Neurosci, 1999;16:503-511.
[11] Velten IM, Horn FK, Korth M, et al. The bwave of the dark adapted flash electroretinogram in the patients with advanced asymmetrical glaucoma and normal subject[J]. Br J Ophthalmol, 2001;85:403-409.
[12] 许建华，刘哲丽，乔光，等. 视网膜振荡电位对糖尿病患者白内障术后视力的预测[J]. 中国实用眼科杂志，2002;20(12)：915-917.
Xu JH，Liu ZL，Qiao G，et al. The pwrediction to the vision of diabetic patients by oscillatory potentials(Ops) of retinogram after cataract operation[J]. Chin J Practical Ophthalmol，2002;20(12)：915-917.
[13] Neufeld AH, Das S, Vora S. A Prodrug of a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase is neuroprotective in the rat model of glaucoma[J]. J Glaucoma, 2002;11(3):221-225.
基金项目：全军医药卫生科研基金(01MA197)
通讯作者：杨新光. Tel.(029)83377759 Email.dotdsy@fmmu.edu.cn
作者简介：王昌鹏(1973)，男(汉族)，重庆市人. 硕士生(导师杨新光)，主治医师. Tel.(029)83377759Email.wooodhead@sina.com
(1第四军医大学唐都医院眼科， 陕西 西安 710038，2第四军医大学口腔医学院药剂科，陕西 西安 710033)
编辑王小仲, 百拇医药(王昌鹏,杨新光,王晓娟,李养军)