针刺预处理对大鼠局灶性脑缺血的抗细胞凋亡作用
Role of electroacupuncture preconditioning against neuronal apoptosis in rats with focal cerebral ischemia
TIAN DaiShi, DENG YiYu, WANG GuangHai, GUO GuoJi, RU LiQiang
1Department of Neurology, Tongji Hospital, 2Department of Neurobiology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
【Abstract】 AIM: To study the role of electroacupuncture preconditioning against neuronal apoptosis in rats with focal cerebral ischemia. METHODS: Model of focal ischemia was used by Middle cerebral artery occlusion (MCAO). Rats were randomly allocated to one of three groups: ①sham operation (sham); ②ischemic and reperfusion (I/R); ③electroacupuncture (30 min/d×5 d)followed by I/R (EA+I/R). The infarction volume, expression of Bcl2 protein, and neuronal apoptosis were determined. RESULTS: In preconditioned rats (EA+I/R), the infarction volume and numbers of neuronal apoptosis were significantly decreased (P<0.01), and expression of Bcl2 was significantly increased compared with I/R alone (P<0.01). CONCLUSION: Electroacupuncture preconditioning may alleviate cerebral ischemicreperfusion partly by increasing expression of Bcl2 and decreasing apoptosis.
【Keywords】 electroacupuncture; preconditioning; ischemia; Bcl2; apoptosis
【摘要】 目的：探讨针刺预处理对大鼠局灶性脑缺血的抗细胞凋亡作用. 方法： 利用大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血模型，实验动物随机分为假手术组(Sham)，单纯缺血再灌注组(I/R)，针刺预处理后缺血再灌注组(EA+I/R)，其中EA+I/R组缺血前行百会穴重复电针刺激(30 min/d×5 d). 行TTC染色观察脑梗死体积，利用免疫组化及TUNEL法观察缺血周边区域Bcl2蛋白表达及神经细胞凋亡的情况. 结果：与I/R 组相比，EA+I/R组脑梗死体积明显缩小(P<0.01)，Bcl2蛋白的表达显著增加(P<0.01)，神经元的凋亡数目明显减少(P<0.01). 结论：针刺预处理可以减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，可能是通过促进Bcl2蛋白的表达，减少神经元的凋亡来实现的.
【关键词】 电针；预处理；脑缺血；Bcl2蛋白；凋亡
0引言
重复电针刺激预处理可诱导产生脑缺血耐受现象[1]，其具体机制尚不明确. Bcl2是最重要的抗凋亡基因，可通过多种途径发挥神经保护作用. 我们采用重复电针刺激作为预处理手段，观察其对随之发生的脑缺血再灌注后Bcl2蛋白表达及神经细胞凋亡的影响，以进一步阐明针刺预处理诱导脑缺血耐受的机制.
1材料和方法
1.1材料
普通雄性SD大鼠36只，体质量250～300 g(华中科技大学实验动物中心提供)，随机分为3组(每组12只)：假手术组(Sham)，缺血再灌注组(I/R)，针刺预处理后缺血再灌注组(EA+I/R). 每组随机分为均等两部分，一部分断头处死，行TTC染色；另一部分行40 g/L多聚甲醛灌注固定后处死.
1.2方法
针刺预处理用DMA定量针麻仪(北京海淀电子仪器厂)给予SD大鼠顶骨正中百会穴电针刺激，采用频率为4~16 Hz的间断疏密波，电流强度1 mA，每次30 min，1次/d，持续5 d. 大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的制备：100 g/L水合氯醛麻醉(300 mg/kg, ip)，常规消毒，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，分离、结扎并切断颈外动脉，在其近心端剪一小口，插入尖端涂以清漆的4.0单尼龙线，轻推其尾端使之由颈外进入颈内动脉，深度约(18.5±0.5) mm，直到有轻微阻力感. 假手术组插入深度约10 mm. EA+I/R在最后一次处理24 h后与I/R组及sham组一起行右侧MCAO，闭塞2 h后抽出尼龙线，恢复再灌流，6 h后一部分直接断头处死，另一部分灌注固定后处死.
1.2.1脑梗死体积测定采用TTC染色法. 大鼠迅速断头取脑，置于冰盐水中10 min，距额极2 mm向后连续取冠状面均匀切成2 mm厚的脑片，于37℃水浴、闭光条件下，置入20 g/L TTC (Sigma, USA)溶液中染色30 min. 数码相机摄像后，进行图像分析，以损伤对侧半球的面积减去损伤侧TTC染色正常区的面积，求得梗死面积，所有脑片梗死面积之和乘以脑片的厚度即为梗死体积.
1.2.2免疫组化染色断头取脑后,系列脱水，石蜡包埋，冠状切片，取前囟后3.8 mm处相邻切片2张(6 μm). 脱蜡至水，行微波抗原修复10 min, H2O2阻断内源性过氧化物酶15 min，滴加Bcl2多克隆抗体(北京中山公司，1∶400)50 μL, 4℃孵育过夜，PBS冲洗后，参照SP试剂盒(北京中山公司)说明进行，DAB H2O2显色，封片，光镜下观察，胞质棕黄色染色者为阳性细胞.
1.2.3TUNEL染色切片常规脱蜡至水，参照TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司)说明书操作，DAB显色，苏木素轻度复染，镜下细胞核有棕色颗粒并表现凋亡形态学特征的为阳性凋亡细胞.
统计学处理：每张切片选取梗死灶周边区域5个高倍视野，共计数10个视野内阳性细胞总数. 所测数据以x±s表示,组间差异比较采用q检验，P<0.05有统计学意义.
2结果
2.1脑梗死体积TTC染色显示正常组织染成玫瑰红色，梗死组织为白色. EA+I/R组梗死体积为(64.2±13.5) mm3, 较I/R组(153.4±18.6) mm3及Sham组(0.0±0.0) mm3明显缩小(P<0.01).
2.2Bcl2蛋白的表达Sham组仅有少量细胞Bcl2弱阳性表达(25.3±10.5)，I/R组有较强的Bcl2阳性表达(105.3±10.6)，与Sham组和I/R组相比，EA+I/R组Bcl2蛋白表达显著升高(265.7±14.4)(P<0.01, Fig 1).
2.3TUNEL染色Sham组仅可见0~2个散在的凋亡细胞(0.8±0.5)，I/R组的凋亡细胞明显增多(98.5±9.7, P<0.01)，与I/R组相比，EA+I/R组凋亡细胞数则显著减少(50.2±7.6, P<0.01,Fig 2).
3讨论
自1990年发现脑缺血耐受现象以来，这种通过激发机体的内源性保护机制，以增强对下一次严重损伤的抵抗能力的方法受到人们的广泛关注. 如低氧(110 mL/L O2 2 h) [2]，皮质扩散抑制(CSD) [3]，冰块[4], 3硝基丙酸(3NPA)[5]均可作为预处理手段诱导脑缺血耐受的发生. 然而，目前大多数的预处理A: Sham; B: I/R; C: EA+I/R.
手段都具有损伤性，适度的损伤可以激活机体的保护机制，刺激量和刺激时间的轻微变动则有可能导致耐受向损伤转化，从而限制了其临床应用. 电针作为传统针灸与现代电刺激技术结合的产物，在脑缺血性疾病的治疗中得到了广泛的应用[6]. 近年来研究发现[1]，重复电针刺激预处理也可诱导产生脑缺血耐受现象.
Bcl基因家族是与细胞凋亡密切相关的基因,其蛋白产物Bcl2主要抑制凋亡，Bax则促进凋亡. 目前认为，Bax蛋白受到凋亡刺激因素作用后,由胞质向线粒体外膜转位,与膜上的电压依赖性离子通道结合,使之激活,并促使凋亡相关蛋白如细胞色素C,A: Sham; B: I/R; C:EA+I/R.
caspase酶原等从线粒体间隙释放入胞质中，执行凋亡程序；Bcl2可通过与Bax竞争性结合，形成异源二聚体，封闭Bax形成孔道的活性，阻止细胞色素C等穿过线粒体膜进入细胞质，避免凋亡启动复合体的形成，从而抑制细胞凋亡[7]. 脑缺血再灌注的有关研究提示其表达在决定神经元存活方面发挥着重要的作用[8]. 我们应用大鼠MCAO模型研究了重复电针刺激对脑缺血再灌注损伤的预处理效应，结果表明电针刺激百会穴的预处理手段可明显缩小脑梗死体积，增加Bcl2蛋白的表达，减少神经元的凋亡. 因此我们推测重复电针刺激预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能部分是通过促进缺血侧大脑半球Bcl2蛋白的表达，减少神经元的凋亡来实现的.
【参考文献】
[1] 熊利泽，路志红. 重复电针预处理可减轻大鼠急性短暂性脑缺血损伤[J]. 第四军医大学学报, 2001; 22(21): 封2.
Xiong LZ, Lu ZH. Pretreatment with repeated electroacupunture attenuates transient focal cerebral ischemia injury in rats [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001; 22(21): Cover 2.
[2] Miller BA, Perez RS, Shah AR, et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemiareperfusion[J]. Neuroreport, 2001; 12(8):1663-1669.
[3] Douen AG, Akiyama K, Hogan MJ, et al. Preconditioning with cortical spreading depression decreases intraischemic cerebral glutamate levels and downregulates excitatory amino acid transporters EAAT1 and EAAT2 from rat cerebral cortex plasma membranes[J]. J Neurochem, 2000; 75(2):812-818.
[4] Nishio S, Yunoki M, Chen ZF, et al. Ischemic tolerance in the rat neocortex following hypothermic preconditioning[J]. J Neurosurg, 2000; 93(5):845-851.
[5] Aketa S, Nakase H, Kamada Y, et al. Chemical preconditioning with 3nitroproionic acid in gerbil hippocampal slices: Therapeutic windows and the participation of adenosine receptor[J]. Exp Neurol, 2000; 166(2): 385-391.
[6] Si QM, Wu GC, Cao XD. Effect of electroacupuncture on acute cerebral infarction [J]. Acupunct Electrother Res, 1998; 23(2):117-124.
[7] Adams JM, Cory S. Lifeordeath decisions by the Bcl2 protein family [J]. Trends Biochem Sci, 2001; 26(1): 61-66.
[8] Guegar C, CeballosPicot I, Nicole A, et al. Recruitment of several neuroprotective pathways after permanent focal ischemia in mice[J]. Exp Neurol, 1998; 154(2):371-380.
作者简介：田代实(1979)，男(汉族)，湖北省仙桃市人. 硕士生(导师郭国际). Tel.(027)83646267Email.Tiandaishi@163.com
(华中科技大学同济医学院：1同济医院神经内科, 2神经生物学教研室，湖北 武汉 430030)
编辑王雪萍, 百拇医药(田代实，邓医宇，王光海，郭国际，茹立强)
TIAN DaiShi, DENG YiYu, WANG GuangHai, GUO GuoJi, RU LiQiang
1Department of Neurology, Tongji Hospital, 2Department of Neurobiology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
【Abstract】 AIM: To study the role of electroacupuncture preconditioning against neuronal apoptosis in rats with focal cerebral ischemia. METHODS: Model of focal ischemia was used by Middle cerebral artery occlusion (MCAO). Rats were randomly allocated to one of three groups: ①sham operation (sham); ②ischemic and reperfusion (I/R); ③electroacupuncture (30 min/d×5 d)followed by I/R (EA+I/R). The infarction volume, expression of Bcl2 protein, and neuronal apoptosis were determined. RESULTS: In preconditioned rats (EA+I/R), the infarction volume and numbers of neuronal apoptosis were significantly decreased (P<0.01), and expression of Bcl2 was significantly increased compared with I/R alone (P<0.01). CONCLUSION: Electroacupuncture preconditioning may alleviate cerebral ischemicreperfusion partly by increasing expression of Bcl2 and decreasing apoptosis.
【Keywords】 electroacupuncture; preconditioning; ischemia; Bcl2; apoptosis
【摘要】 目的：探讨针刺预处理对大鼠局灶性脑缺血的抗细胞凋亡作用. 方法： 利用大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血模型，实验动物随机分为假手术组(Sham)，单纯缺血再灌注组(I/R)，针刺预处理后缺血再灌注组(EA+I/R)，其中EA+I/R组缺血前行百会穴重复电针刺激(30 min/d×5 d). 行TTC染色观察脑梗死体积，利用免疫组化及TUNEL法观察缺血周边区域Bcl2蛋白表达及神经细胞凋亡的情况. 结果：与I/R 组相比，EA+I/R组脑梗死体积明显缩小(P<0.01)，Bcl2蛋白的表达显著增加(P<0.01)，神经元的凋亡数目明显减少(P<0.01). 结论：针刺预处理可以减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，可能是通过促进Bcl2蛋白的表达，减少神经元的凋亡来实现的.
【关键词】 电针；预处理；脑缺血；Bcl2蛋白；凋亡
0引言
重复电针刺激预处理可诱导产生脑缺血耐受现象[1]，其具体机制尚不明确. Bcl2是最重要的抗凋亡基因，可通过多种途径发挥神经保护作用. 我们采用重复电针刺激作为预处理手段，观察其对随之发生的脑缺血再灌注后Bcl2蛋白表达及神经细胞凋亡的影响，以进一步阐明针刺预处理诱导脑缺血耐受的机制.
1材料和方法
1.1材料
普通雄性SD大鼠36只，体质量250～300 g(华中科技大学实验动物中心提供)，随机分为3组(每组12只)：假手术组(Sham)，缺血再灌注组(I/R)，针刺预处理后缺血再灌注组(EA+I/R). 每组随机分为均等两部分，一部分断头处死，行TTC染色；另一部分行40 g/L多聚甲醛灌注固定后处死.
1.2方法
针刺预处理用DMA定量针麻仪(北京海淀电子仪器厂)给予SD大鼠顶骨正中百会穴电针刺激，采用频率为4~16 Hz的间断疏密波，电流强度1 mA，每次30 min，1次/d，持续5 d. 大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的制备：100 g/L水合氯醛麻醉(300 mg/kg, ip)，常规消毒，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，分离、结扎并切断颈外动脉，在其近心端剪一小口，插入尖端涂以清漆的4.0单尼龙线，轻推其尾端使之由颈外进入颈内动脉，深度约(18.5±0.5) mm，直到有轻微阻力感. 假手术组插入深度约10 mm. EA+I/R在最后一次处理24 h后与I/R组及sham组一起行右侧MCAO，闭塞2 h后抽出尼龙线，恢复再灌流，6 h后一部分直接断头处死，另一部分灌注固定后处死.
1.2.1脑梗死体积测定采用TTC染色法. 大鼠迅速断头取脑，置于冰盐水中10 min，距额极2 mm向后连续取冠状面均匀切成2 mm厚的脑片，于37℃水浴、闭光条件下，置入20 g/L TTC (Sigma, USA)溶液中染色30 min. 数码相机摄像后，进行图像分析，以损伤对侧半球的面积减去损伤侧TTC染色正常区的面积，求得梗死面积，所有脑片梗死面积之和乘以脑片的厚度即为梗死体积.
1.2.2免疫组化染色断头取脑后,系列脱水，石蜡包埋，冠状切片，取前囟后3.8 mm处相邻切片2张(6 μm). 脱蜡至水，行微波抗原修复10 min, H2O2阻断内源性过氧化物酶15 min，滴加Bcl2多克隆抗体(北京中山公司，1∶400)50 μL, 4℃孵育过夜，PBS冲洗后，参照SP试剂盒(北京中山公司)说明进行，DAB H2O2显色，封片，光镜下观察，胞质棕黄色染色者为阳性细胞.
1.2.3TUNEL染色切片常规脱蜡至水，参照TUNEL试剂盒(德国宝灵曼公司)说明书操作，DAB显色，苏木素轻度复染，镜下细胞核有棕色颗粒并表现凋亡形态学特征的为阳性凋亡细胞.
统计学处理：每张切片选取梗死灶周边区域5个高倍视野，共计数10个视野内阳性细胞总数. 所测数据以x±s表示,组间差异比较采用q检验，P<0.05有统计学意义.
2结果
2.1脑梗死体积TTC染色显示正常组织染成玫瑰红色，梗死组织为白色. EA+I/R组梗死体积为(64.2±13.5) mm3, 较I/R组(153.4±18.6) mm3及Sham组(0.0±0.0) mm3明显缩小(P<0.01).
2.2Bcl2蛋白的表达Sham组仅有少量细胞Bcl2弱阳性表达(25.3±10.5)，I/R组有较强的Bcl2阳性表达(105.3±10.6)，与Sham组和I/R组相比，EA+I/R组Bcl2蛋白表达显著升高(265.7±14.4)(P<0.01, Fig 1).
2.3TUNEL染色Sham组仅可见0~2个散在的凋亡细胞(0.8±0.5)，I/R组的凋亡细胞明显增多(98.5±9.7, P<0.01)，与I/R组相比，EA+I/R组凋亡细胞数则显著减少(50.2±7.6, P<0.01,Fig 2).
3讨论
自1990年发现脑缺血耐受现象以来，这种通过激发机体的内源性保护机制，以增强对下一次严重损伤的抵抗能力的方法受到人们的广泛关注. 如低氧(110 mL/L O2 2 h) [2]，皮质扩散抑制(CSD) [3]，冰块[4], 3硝基丙酸(3NPA)[5]均可作为预处理手段诱导脑缺血耐受的发生. 然而，目前大多数的预处理A: Sham; B: I/R; C: EA+I/R.
手段都具有损伤性，适度的损伤可以激活机体的保护机制，刺激量和刺激时间的轻微变动则有可能导致耐受向损伤转化，从而限制了其临床应用. 电针作为传统针灸与现代电刺激技术结合的产物，在脑缺血性疾病的治疗中得到了广泛的应用[6]. 近年来研究发现[1]，重复电针刺激预处理也可诱导产生脑缺血耐受现象.
Bcl基因家族是与细胞凋亡密切相关的基因,其蛋白产物Bcl2主要抑制凋亡，Bax则促进凋亡. 目前认为，Bax蛋白受到凋亡刺激因素作用后,由胞质向线粒体外膜转位,与膜上的电压依赖性离子通道结合,使之激活,并促使凋亡相关蛋白如细胞色素C,A: Sham; B: I/R; C:EA+I/R.
caspase酶原等从线粒体间隙释放入胞质中，执行凋亡程序；Bcl2可通过与Bax竞争性结合，形成异源二聚体，封闭Bax形成孔道的活性，阻止细胞色素C等穿过线粒体膜进入细胞质，避免凋亡启动复合体的形成，从而抑制细胞凋亡[7]. 脑缺血再灌注的有关研究提示其表达在决定神经元存活方面发挥着重要的作用[8]. 我们应用大鼠MCAO模型研究了重复电针刺激对脑缺血再灌注损伤的预处理效应，结果表明电针刺激百会穴的预处理手段可明显缩小脑梗死体积，增加Bcl2蛋白的表达，减少神经元的凋亡. 因此我们推测重复电针刺激预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能部分是通过促进缺血侧大脑半球Bcl2蛋白的表达，减少神经元的凋亡来实现的.
【参考文献】
[1] 熊利泽，路志红. 重复电针预处理可减轻大鼠急性短暂性脑缺血损伤[J]. 第四军医大学学报, 2001; 22(21): 封2.
Xiong LZ, Lu ZH. Pretreatment with repeated electroacupunture attenuates transient focal cerebral ischemia injury in rats [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001; 22(21): Cover 2.
[2] Miller BA, Perez RS, Shah AR, et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemiareperfusion[J]. Neuroreport, 2001; 12(8):1663-1669.
[3] Douen AG, Akiyama K, Hogan MJ, et al. Preconditioning with cortical spreading depression decreases intraischemic cerebral glutamate levels and downregulates excitatory amino acid transporters EAAT1 and EAAT2 from rat cerebral cortex plasma membranes[J]. J Neurochem, 2000; 75(2):812-818.
[4] Nishio S, Yunoki M, Chen ZF, et al. Ischemic tolerance in the rat neocortex following hypothermic preconditioning[J]. J Neurosurg, 2000; 93(5):845-851.
[5] Aketa S, Nakase H, Kamada Y, et al. Chemical preconditioning with 3nitroproionic acid in gerbil hippocampal slices: Therapeutic windows and the participation of adenosine receptor[J]. Exp Neurol, 2000; 166(2): 385-391.
[6] Si QM, Wu GC, Cao XD. Effect of electroacupuncture on acute cerebral infarction [J]. Acupunct Electrother Res, 1998; 23(2):117-124.
[7] Adams JM, Cory S. Lifeordeath decisions by the Bcl2 protein family [J]. Trends Biochem Sci, 2001; 26(1): 61-66.
[8] Guegar C, CeballosPicot I, Nicole A, et al. Recruitment of several neuroprotective pathways after permanent focal ischemia in mice[J]. Exp Neurol, 1998; 154(2):371-380.
作者简介：田代实(1979)，男(汉族)，湖北省仙桃市人. 硕士生(导师郭国际). Tel.(027)83646267Email.Tiandaishi@163.com
(华中科技大学同济医学院：1同济医院神经内科, 2神经生物学教研室，湖北 武汉 430030)
编辑王雪萍, 百拇医药(田代实，邓医宇，王光海，郭国际，茹立强)