新生鼠脑缺血再灌注后海马CA1区突触素的表达及意义
Expression of Syn in hippocampal CA1 region after cerebral ischemiareperfusion in newborn rats and its significance
SONG WenXiu, CAO YunTao, LIU HuaQing
1Department of Pediatrics, 5th Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zhuhai 519100, China, 2Department of Pediatrics, 3Department of Pathology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China
【Abstract】 AIM: To observe synaptophysin(Syp)expression in hippocampal CA1 region of 7dayold Wistar rats after cerebral ischemiareperfusion. METHODS: Immunohistochemical method was used to measure the expression of Syp in the hippocampal CA1 region after reperfusion. RESULTS: The expression of Syp in hippocampal CA1 region in cerebral ischemiareperfusion group increased at 3 d after reperfusion and reached the highest level at 7 d. The corrected optical density(COD) value was significantly higher than that in the shamoperation group (P<0.01). CONCLUSION: Neural plasticity occurrs at 3 d and continues to 14 d after cerebral ischemiareperfusion in newborn rats. Syp is a good index indicating the regeneration of neuron and nervous axons.
【Keywords】 cerebral ischemia; synaptophysin; hippocampal CA1 region; rats, Wistar, animals, newborn
【摘要】 目的： 观察新生Wistar大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区突触素的表达. 探讨中枢神经系统的可塑性. 方法： 应用免疫组化方法观察新生鼠脑缺血再灌注后不同时点脑组织突触素的表达. 结果： 缺血再灌注3 d突触素表达开始增高，7 d达高峰，14 d时免疫活性仍高，其矫正吸光度值与对照组比较有显著性差异(P<0.01). 结论： 新生Wistar大鼠脑神经细胞损伤后具有修复的可塑性，其时间持续至缺血再灌注后14 d. 突触素检测能较好地反映神经元和轴突的代偿再生情况.
【关键词】 脑缺血；突触膜糖蛋白；海马CA1区；大鼠，Wistar；动物，新生
0引言
突触素(synaptophysin, Syp)是一种与突触结构和功能密切相关的膜蛋白，Syp作为突触囊泡的一种特异标志性蛋白，其数量和分布密度可间接反映突触的密度[1]，突触重建时其表达明显增多，与神经可塑性密切相关. 近年来，国内外研究[2]发现机体在缺血缺氧时，能反映神经细胞代偿及重塑的Syp的表达和生成增加. 我们旨在研究新生鼠脑缺血再灌注后突触素的变化规律，探讨中枢神经系统的可塑性.
1材料和方法
1.1材料
出生后7 d Wistar大鼠70只(遵义医学院实验动物中心)，体质量18～22 g，雌雄不拘，随机分为假手术组和缺血再灌注组，每组35只. 1000 u青霉素ip预防感染， 30 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg) ip麻醉. 抗Syp抗体(即用型)：鼠抗人mAb(DAKO公司). Mias99B图像分析系统(四川大学图像图形研究所).
1.2方法
1.2.1脑缺血模型的制作① 假手术组： 分离动物右侧颈总动脉，不阻断血流；② 缺血再灌注组： 阻断右侧颈总动脉45 min再灌注. 两组均于术后7个时间点即2, 6, 12, 24 h和3, 7, 14 d断头处死动物，每时间点5只，取右侧大脑半球用40 g/L多聚甲醛固定待测. 制模成功标准为结扎右侧颈总动脉后2 h对侧(左侧)肢体活动障碍.
1.2.2标本制备及Syp检测采用免疫组织化学Envision二步法. 取标本固定24 h，石蜡包埋，进行海马CA1区、皮层连续冠状切片，片厚4 μm. 切片常规脱蜡和水化，微波抗原修复10 min，室温下自然冷却20 min，蒸馏水漂洗后置于PBS (pH=7.4)中，用30 g/L过氧化氢避光孵育20 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS漂洗5 min×3，加20 μL一抗，4℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗5 min×3，加20 μL相应的EnvisionTM复合物，37℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3，DAB显色，蒸馏水漂洗、复染及封片. 以PBS代替一抗作阴性对照.
1.2.3图像分析用图像分析系统测量切片海马CA1区Syp吸光度值(A值)，每只鼠5张切片，每张切片测2次，每次所测面积大于海马CA1区的50%，取其平均值作为Syp的A值；同时测定同一张切片上胼胝体的A值以作为Syp的背景值，用CA(矫正吸光度)值进行比较和分析，CA＝实测值-背景值，以避免染色过程中非特异性染色所造成的误差.
1.2.4病理学检查取相应部位切片行HE染色，观察其病理学改变.
统计学处理： 各组CA值以x±s表示. 用完全随机设计两样本比较的秩和检验分析. P<0.01为有显著性差异.
2结果
2.1Syp的表达Syp阳性染色呈棕黄色点状或颗粒状沉积，位于胞质内，胼胝体、血管和胶质细胞不着色，阴性对照切片未见Syp免疫产物. 假手术组海马CA1区可见Syp表达，免疫反应物颗粒很小，分布弥散(Fig 1)，随日龄增加免疫反应产物CA值逐渐增高；缺血再灌注组海马CA1区Syp在脑缺血再灌注3 d免疫活性增高，7 d达高峰，14 d免疫活性仍高，免疫产物的颗粒较大、密集、染色深(Fig 2)； CA值高于假手术组，两组比较均有显著性差异(P<0.01, Tab 1).表1新生Wistar大鼠不同时间点海马CA1区Syp免疫反应复合物的CA值(略)
2.2病理学改变假手术组未见神经元损伤，缺血灌注组大鼠海马CA1区神经细胞自缺血12 h开始水肿、坏死，锥体细胞大部分受损，第3 日最重，第7日逐渐好转(Fig 3).
3讨论
Syp是一种Mr 38 000的酸性钙结合糖蛋白，在神经元胞体合成后主要转运至轴突终末,特异性地分布于突触前囊泡膜上. Syp分布非常广泛，在神经组织如脑、脊髓、视网膜和神经肌接头的突触前成分、肾上腺髓质，以及各类内分泌细胞等都有分布[3]. 免疫电镜研究证实，Syp位于小圆形或扁形突触囊泡质膜面，光镜下标记的Syp颗粒样物实际上是成簇的囊泡，而95%以上的新皮质突触前终末均含有这种小突触囊泡[4]. Syp作为突触前终末标记物，使用免疫组化方法及图像分析技术检测其免疫阳性物质在给定区域的吸光度值，可以间接评定突触的密度及分布. 免疫组化研究证实, Syp的免疫活性在成熟脑组织中高度集中在突触前轴突末梢内，围绕着神经元和其树突. 因此该蛋白被广泛用于标记轴突终末,是突触重建的重要标志. 我们的实验结果显示： 脑缺血再灌注组与假手术组相比，于再灌注2, 6, 24 h Syp的免疫活性未见明显变化(P>0.01)，第3, 7, 14日与假手术组比较有显著性差异(P<0.01). 这与Kojiro等[5]对成年大鼠所做的实验结果一致. Ishimaru等[6]通过制备脑缺血模型，检测Syp的免疫活性，表明在脑缺血后，海马CA1区的突触前的恶化先于CA1区的迟发性神经元死亡. 神经细胞在受到各种有害因素损伤后，其轴突在失去靶器官后会出现轴突的出芽和形成许多侧枝，其突触前囊泡的数量增加；另外其突触前膜功能也代偿性增加，使Syp免疫活性增高. 突触素能调节神经元突起延伸以及在中枢神经元中建立极性，分化出轴突. 一些细胞因子可以调节神经元突起的延伸，这种调节作用主要是通过PKA或者钙调蛋白激酶介导[7]. 有实验表明cAMP可促进神经元突起延伸，主要是通过PKA磷酸化突触素的一个氨基酸残基而打开神经元突起延伸的开关[8]. 该研究结果说明新生鼠脑缺血再灌注后神经系统存在可塑性. 我们的实验结果为新生儿窒息脑损伤的早期干预，促进神经细胞的代偿，减少神经系统后遗症提供了动物实验依据.
【参考文献】
[1] Saito S, Kobayashi S, Ohashi Y, et al. Decreased synaptic density in aged brains and its prevention by rearing under enriched environment as revealed by synaptophysin contents [J]. Neuroscience Res, 1994；39(1)：57-62.
[2] Martinez G, Di Giacomo C, Carnazza ML, et al. MAP2, synaptophysin immunostaining in rat brain and behavioral modifications after cerebral postischemic reperfusion [J]. Dev Neurosci, 1997；19(6): 457-464.
[3] Wiedenmann B, Franke WW. Identification and localization of synaptophysin, an integral membrane glycoprotein of Mr 38,000 characteristic of presynaptic vesicles [J]. Cell, 1985；41(3):1017-1028.
[4] Walaas SI, Jahn R, Greengard P. Quantitation of nerve terminal population: Synaptic vesicleassociated proteins as markers for synaptic density in the rat neostriatum [J]. Synapse, 1988；2：516-520.
[5] Kojiro K, Statoshi G, Shinji N, et al. Changes of immunoreactivity for synaptophysin following a transient cerebral ischemia in the rat striatum [J]. Brain Research, 1993；616:320-324.
[6] Ishimaru H, Casamenti F, Ueda K, et al. Changes in presynaptic proteins, SNAP25 and synaptophysin, in the hippocampal CA1 area in ischemic gerbils [J]. Brain Res, 2001； 903(12):94-101.
[7] Angers A, Fioravante D, Chin J, et al. Serotonin stimulates phosphorylation of Aplysia synapsin and alters its subcellular distribution in sensory neurons. [J]. Neurosci, 2002；22(13):5412-5422.
[8] Kao HT, Song HJ, Porton B, et al. A protein kinase Adependent molecular switch in synapsins regulates neurite outgrowth [J]. Nat Neurosci, 2002；(5):431-437.
基金项目：贵州省卫生厅资助项目(D143)，贵州省省教育厅立项
通讯作者：曹云涛. Tel. (0852)8608561Email. cyto827@yahoo.com.cn
作者简介：宋文秀(1972)，女(白族)，贵州省盘县人. 硕士生(导师曹云涛)，主治医师. Tel. (0756)5523616Email. songwenxiou@163.com
(1珠海市斗门区遵义医学院第五附属医院儿科，广东 珠海 519100， 遵义医学院附属医院： 2儿科， 3病理科，贵州 遵义 563003)
编辑王睿, http://www.100md.com(宋文秀，曹云涛，刘华庆)
SONG WenXiu, CAO YunTao, LIU HuaQing
1Department of Pediatrics, 5th Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zhuhai 519100, China, 2Department of Pediatrics, 3Department of Pathology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China
【Abstract】 AIM: To observe synaptophysin(Syp)expression in hippocampal CA1 region of 7dayold Wistar rats after cerebral ischemiareperfusion. METHODS: Immunohistochemical method was used to measure the expression of Syp in the hippocampal CA1 region after reperfusion. RESULTS: The expression of Syp in hippocampal CA1 region in cerebral ischemiareperfusion group increased at 3 d after reperfusion and reached the highest level at 7 d. The corrected optical density(COD) value was significantly higher than that in the shamoperation group (P<0.01). CONCLUSION: Neural plasticity occurrs at 3 d and continues to 14 d after cerebral ischemiareperfusion in newborn rats. Syp is a good index indicating the regeneration of neuron and nervous axons.
【Keywords】 cerebral ischemia; synaptophysin; hippocampal CA1 region; rats, Wistar, animals, newborn
【摘要】 目的： 观察新生Wistar大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区突触素的表达. 探讨中枢神经系统的可塑性. 方法： 应用免疫组化方法观察新生鼠脑缺血再灌注后不同时点脑组织突触素的表达. 结果： 缺血再灌注3 d突触素表达开始增高，7 d达高峰，14 d时免疫活性仍高，其矫正吸光度值与对照组比较有显著性差异(P<0.01). 结论： 新生Wistar大鼠脑神经细胞损伤后具有修复的可塑性，其时间持续至缺血再灌注后14 d. 突触素检测能较好地反映神经元和轴突的代偿再生情况.
【关键词】 脑缺血；突触膜糖蛋白；海马CA1区；大鼠，Wistar；动物，新生
0引言
突触素(synaptophysin, Syp)是一种与突触结构和功能密切相关的膜蛋白，Syp作为突触囊泡的一种特异标志性蛋白，其数量和分布密度可间接反映突触的密度[1]，突触重建时其表达明显增多，与神经可塑性密切相关. 近年来，国内外研究[2]发现机体在缺血缺氧时，能反映神经细胞代偿及重塑的Syp的表达和生成增加. 我们旨在研究新生鼠脑缺血再灌注后突触素的变化规律，探讨中枢神经系统的可塑性.
1材料和方法
1.1材料
出生后7 d Wistar大鼠70只(遵义医学院实验动物中心)，体质量18～22 g，雌雄不拘，随机分为假手术组和缺血再灌注组，每组35只. 1000 u青霉素ip预防感染， 30 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg) ip麻醉. 抗Syp抗体(即用型)：鼠抗人mAb(DAKO公司). Mias99B图像分析系统(四川大学图像图形研究所).
1.2方法
1.2.1脑缺血模型的制作① 假手术组： 分离动物右侧颈总动脉，不阻断血流；② 缺血再灌注组： 阻断右侧颈总动脉45 min再灌注. 两组均于术后7个时间点即2, 6, 12, 24 h和3, 7, 14 d断头处死动物，每时间点5只，取右侧大脑半球用40 g/L多聚甲醛固定待测. 制模成功标准为结扎右侧颈总动脉后2 h对侧(左侧)肢体活动障碍.
1.2.2标本制备及Syp检测采用免疫组织化学Envision二步法. 取标本固定24 h，石蜡包埋，进行海马CA1区、皮层连续冠状切片，片厚4 μm. 切片常规脱蜡和水化，微波抗原修复10 min，室温下自然冷却20 min，蒸馏水漂洗后置于PBS (pH=7.4)中，用30 g/L过氧化氢避光孵育20 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS漂洗5 min×3，加20 μL一抗，4℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗5 min×3，加20 μL相应的EnvisionTM复合物，37℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3，DAB显色，蒸馏水漂洗、复染及封片. 以PBS代替一抗作阴性对照.
1.2.3图像分析用图像分析系统测量切片海马CA1区Syp吸光度值(A值)，每只鼠5张切片，每张切片测2次，每次所测面积大于海马CA1区的50%，取其平均值作为Syp的A值；同时测定同一张切片上胼胝体的A值以作为Syp的背景值，用CA(矫正吸光度)值进行比较和分析，CA＝实测值-背景值，以避免染色过程中非特异性染色所造成的误差.
1.2.4病理学检查取相应部位切片行HE染色，观察其病理学改变.
统计学处理： 各组CA值以x±s表示. 用完全随机设计两样本比较的秩和检验分析. P<0.01为有显著性差异.
2结果
2.1Syp的表达Syp阳性染色呈棕黄色点状或颗粒状沉积，位于胞质内，胼胝体、血管和胶质细胞不着色，阴性对照切片未见Syp免疫产物. 假手术组海马CA1区可见Syp表达，免疫反应物颗粒很小，分布弥散(Fig 1)，随日龄增加免疫反应产物CA值逐渐增高；缺血再灌注组海马CA1区Syp在脑缺血再灌注3 d免疫活性增高，7 d达高峰，14 d免疫活性仍高，免疫产物的颗粒较大、密集、染色深(Fig 2)； CA值高于假手术组，两组比较均有显著性差异(P<0.01, Tab 1).表1新生Wistar大鼠不同时间点海马CA1区Syp免疫反应复合物的CA值(略)
2.2病理学改变假手术组未见神经元损伤，缺血灌注组大鼠海马CA1区神经细胞自缺血12 h开始水肿、坏死，锥体细胞大部分受损，第3 日最重，第7日逐渐好转(Fig 3).
3讨论
Syp是一种Mr 38 000的酸性钙结合糖蛋白，在神经元胞体合成后主要转运至轴突终末,特异性地分布于突触前囊泡膜上. Syp分布非常广泛，在神经组织如脑、脊髓、视网膜和神经肌接头的突触前成分、肾上腺髓质，以及各类内分泌细胞等都有分布[3]. 免疫电镜研究证实，Syp位于小圆形或扁形突触囊泡质膜面，光镜下标记的Syp颗粒样物实际上是成簇的囊泡，而95%以上的新皮质突触前终末均含有这种小突触囊泡[4]. Syp作为突触前终末标记物，使用免疫组化方法及图像分析技术检测其免疫阳性物质在给定区域的吸光度值，可以间接评定突触的密度及分布. 免疫组化研究证实, Syp的免疫活性在成熟脑组织中高度集中在突触前轴突末梢内，围绕着神经元和其树突. 因此该蛋白被广泛用于标记轴突终末,是突触重建的重要标志. 我们的实验结果显示： 脑缺血再灌注组与假手术组相比，于再灌注2, 6, 24 h Syp的免疫活性未见明显变化(P>0.01)，第3, 7, 14日与假手术组比较有显著性差异(P<0.01). 这与Kojiro等[5]对成年大鼠所做的实验结果一致. Ishimaru等[6]通过制备脑缺血模型，检测Syp的免疫活性，表明在脑缺血后，海马CA1区的突触前的恶化先于CA1区的迟发性神经元死亡. 神经细胞在受到各种有害因素损伤后，其轴突在失去靶器官后会出现轴突的出芽和形成许多侧枝，其突触前囊泡的数量增加；另外其突触前膜功能也代偿性增加，使Syp免疫活性增高. 突触素能调节神经元突起延伸以及在中枢神经元中建立极性，分化出轴突. 一些细胞因子可以调节神经元突起的延伸，这种调节作用主要是通过PKA或者钙调蛋白激酶介导[7]. 有实验表明cAMP可促进神经元突起延伸，主要是通过PKA磷酸化突触素的一个氨基酸残基而打开神经元突起延伸的开关[8]. 该研究结果说明新生鼠脑缺血再灌注后神经系统存在可塑性. 我们的实验结果为新生儿窒息脑损伤的早期干预，促进神经细胞的代偿，减少神经系统后遗症提供了动物实验依据.
【参考文献】
[1] Saito S, Kobayashi S, Ohashi Y, et al. Decreased synaptic density in aged brains and its prevention by rearing under enriched environment as revealed by synaptophysin contents [J]. Neuroscience Res, 1994；39(1)：57-62.
[2] Martinez G, Di Giacomo C, Carnazza ML, et al. MAP2, synaptophysin immunostaining in rat brain and behavioral modifications after cerebral postischemic reperfusion [J]. Dev Neurosci, 1997；19(6): 457-464.
[3] Wiedenmann B, Franke WW. Identification and localization of synaptophysin, an integral membrane glycoprotein of Mr 38,000 characteristic of presynaptic vesicles [J]. Cell, 1985；41(3):1017-1028.
[4] Walaas SI, Jahn R, Greengard P. Quantitation of nerve terminal population: Synaptic vesicleassociated proteins as markers for synaptic density in the rat neostriatum [J]. Synapse, 1988；2：516-520.
[5] Kojiro K, Statoshi G, Shinji N, et al. Changes of immunoreactivity for synaptophysin following a transient cerebral ischemia in the rat striatum [J]. Brain Research, 1993；616:320-324.
[6] Ishimaru H, Casamenti F, Ueda K, et al. Changes in presynaptic proteins, SNAP25 and synaptophysin, in the hippocampal CA1 area in ischemic gerbils [J]. Brain Res, 2001； 903(12):94-101.
[7] Angers A, Fioravante D, Chin J, et al. Serotonin stimulates phosphorylation of Aplysia synapsin and alters its subcellular distribution in sensory neurons. [J]. Neurosci, 2002；22(13):5412-5422.
[8] Kao HT, Song HJ, Porton B, et al. A protein kinase Adependent molecular switch in synapsins regulates neurite outgrowth [J]. Nat Neurosci, 2002；(5):431-437.
基金项目：贵州省卫生厅资助项目(D143)，贵州省省教育厅立项
通讯作者：曹云涛. Tel. (0852)8608561Email. cyto827@yahoo.com.cn
作者简介：宋文秀(1972)，女(白族)，贵州省盘县人. 硕士生(导师曹云涛)，主治医师. Tel. (0756)5523616Email. songwenxiou@163.com
(1珠海市斗门区遵义医学院第五附属医院儿科，广东 珠海 519100， 遵义医学院附属医院： 2儿科， 3病理科，贵州 遵义 563003)
编辑王睿, http://www.100md.com(宋文秀，曹云涛，刘华庆)