缺氧再氧合过程中CD147基因在卵巢癌细胞系中的表达
Hypoxiareoxygenationmediated expression of CD147 gene in human ovarian carcinoma cell lines
HAN FengHua, XIN XiaoYan, HOU XiangHua, YANG Hong, ZOU Wei
1Department of Experimental Surgery, 2Department of Gyneology and Obstetrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of CD147 gene in human ovarian carcinoma cell lines during hypoxiareoxygenation. METHODS: Ovarian cancer cell lines 3AO and HO8910PM, highly expressed CD147, were incubated in hypoxia incubator and incubated with 50 mL/L CO2 and 950 mL/L N2. After 30min exposure to hypoxia, all of the cells were reoxygenated 4 h and 8 h respectively. Reoxygenation was achieved by replenishing the fresh medium and returning the cell cultures to a normoxic environment. Expression and location of CD147 were assessed by confocal laser scanning microscope (CLSM). RESULTS: CD147 was located at cytoplasm. Hypoxia upregulated the CD147 expression, but reoxygenation decreased the CD147 expression. With reoxygenation for 4 h to 8 h, the levels of CD147 expression dropped to the lowest. CONCLUSION: Hypoxia upregulates the expression of CD147 in human ovarian carcinoma cell lines and reoxygenation downregulates CD147 expression. The upregulated expression of CD147 during hypoxia is reversible.
【Keywords】 ovarian cancer; hypoxia; reoxygenation; CD147; CLSM
【摘要】 目的：探讨缺氧再氧合过程中CD147基因在卵巢癌细胞系中的表达. 方法：卵巢癌细胞系3AO,HO8910PM分别在混合气体缺氧仓中缺氧30 min后更换新鲜培养液，给予再氧合, 常氧下继续培养0，4，8 h. 激光共聚焦显微镜定位，定量检测CD147的表达. 结果：CD147定位于细胞质. 急性缺氧30 min后两种卵巢癌细胞系中CD147表达量明显高于对照组，再氧合4,8 h时CD147的表达量明显降低. 两种细胞株均表现为再氧合4 h时CD147的表达与对照相比无明显差异(P>0.05)，再氧合8 h时降为最低. 结论：缺氧上调卵巢癌细胞系中CD147的表达，再氧合可使高表达回降.
【关键词】 卵巢肿瘤； CD147； 缺氧； 再氧合； 激光共聚焦显微镜
0引言
CD147属免疫超家族成员，与肿瘤浸润转移相关. 我们先前的研究[1]表明CD147在卵巢癌组织中有不同程度表达，它与卵巢癌的浸润转移有密切关系[2]，但其作用机制尚未明了. 缺氧是实体肿瘤普遍存在的特征[3]，CD147的3′末端有两个缺氧反应元件结合位点，可能与缺氧有关. 我们探讨缺氧参与卵巢肿瘤CD147表达的调控如下.
1材料和方法
1.1材料
CD147 mAb由第四军医大学细胞工程中心提供. FITC由本校电镜中心提供. 卵巢癌细胞系3AO，HO8910PM由本实验室提供. 混合气体缺氧仓由西京医院神经内科提供. Avlomni Measurement血气分析仪由西京医院ICU提供. BioRad MRC1024型激光共聚焦显微镜和软件分析系统由第四军医大学电镜中心提供. 胰蛋白酶购自北京生物技术有限公司.
1.2方法
取3AO,HO8910PM对数生长期细胞,2.5 g/L胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液,将细胞接种到预先消毒并放置了载玻片的培养皿中，CO2孵育箱培养过夜(8 h)至细胞贴壁，贴壁细胞放入缺氧仓(950 mL/L N2, 50 mL/L CO2)中30 min致急性缺氧. 缺氧后的细胞分别再氧合4，8 h. 再氧合即更换新的细胞培养液继续在37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 取对照组贴壁细胞和在混合气体培养仓中急性缺氧30 min的贴壁培养细胞瓶送血气分析. 取出盖玻片，0.01 mmol/L，pH 7.4的PBS冲洗2次，丙酮固定液固定10 min后放入盖片染色缸中，PBS振洗5 min，取出吹干，滴加1∶10 CD147 mAb 20 μL置湿盒内37℃保湿30～60 min，PBS振洗3次，5 min/次，吹干，滴加FITC羊抗小鼠IgG 20 μL,置湿盒内，37℃保湿30～60 min，PBS振洗2次，5 min/次，蒸馏水振洗1次，500 mL/L缓冲甘油封片. 激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察并拍照，软件定量分析. 用于FITC的激发波长为488 nm，共聚焦系统由BioRad公司提供的软件控制，在Pentium90计算机中运行，显微镜聚焦旋钮由步进马达控制，用于图像采集的物镜为PlanNeofluar40×油镜. 图像存为512×512像素类型. 利用软件在镜下随机选取5个细胞，对其进行CLSM检测定量分析，读取均数和标准差.
统计学方法：利用SPSS软件进行单因素方差分析及LSDt检验.
2结果
2.1细胞终极培养液血气分析急性缺氧后细胞培养液pH 7.16. PO2为7.4 kPa;对照组pH为7.4，PO2为17.3 kPa. 缺氧仓中pH值试纸显示pH 5～6,说明仓中真实的环境PO2远低于7.4 kPa. PO2与氧浓度(FO2)的关系：PO2＝(吸入气压力-6.27)×FO2. 当PO2=18.6 kPa时，FO2=20%；且氧分压与氧浓度成正比关系. 本实验中FO2<8%，符合缺氧条件(<10%).
2.2CLSM检测CD147定位于细胞质中(Fig 1). 3AO,HO8910PM细胞均在为急性缺氧30 min后CD147表达量较对照组明显增加，再氧合4，8 h后CD147表达量明显降低(P=0.000). 采用LSDt进行均数多重比较，HO8910PM组在再氧合4，8 h和对照组比较均无明显差异(P>0.05)，余各组两两比较均有显著统计学差异(P<0.05)； 3AO组中各组比较均有显著统计学差异(P<0.05，Tab 1).表1缺氧再氧合过程中卵巢癌细胞系中CD147的表达(略)
3讨论
CLSM是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图，并能对抗原在细胞中的定位和定量作出精确的分析，较传统的免疫组化方法更为先进.
缺氧是肿瘤微环境的一种病理生理特征. 在实体肿瘤中, 由于肿瘤细胞增生迅速, 往往造成肿瘤局部的缺氧坏死. 同时, 缺氧作为一种应激反应还可诱导肿瘤相关显型基因表达增加，促进肿瘤的进展[4-6]. 我们先前的研究结果表明CD147在卵巢癌的发生、发展、浸润转移中起重要作用，可能是卵巢肿瘤的一个药靶分子. 本结果显示急性缺氧30 min后，卵巢癌细胞系8910PM和3AO中CD147的表达上调，而再氧合后卵巢癌细胞中CD147的表达下降，再氧合4～8 h时CD147的表达接近对照组表达量，且随着缺氧时间的延长CD147的表达逐渐降低,低于对照组. 可见缺氧所致卵巢癌细胞系中CD147的表达上调是可逆的，缺氧和再氧合可有效调控卵巢癌中CD147的表达，缺氧可能通过调控CD147的表达促进卵巢癌的发生、发展.
【参考文献】
[1] 贺书云, 辛晓燕, 王健. 基质金属蛋白酶2及CD147在卵巢上皮性肿瘤中的表达[J]. 第四军医大学学报,2001；22(5): 435-438.
He SY, Xin XY, Wang J. The expression of matrix metalloproteinase 2 and CD147 in ovarian cancer [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001；22(5): 435-438.
[2] 杨红，郑维国，辛晓燕，等. CD147反义核酸对卵巢癌细胞生物学行为的影响[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(18):1657-1660.
Yang H, Zhen WG, Xin XY, et al. The influence of CD147 antisense ribonic acid on ovarian cancer cell biological action[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002；23(18): 1657-1660.
[3] Semenza GL. HIF1 and tumor progression: Pathophysiology and therapeutics[J]. Trends Mol Med, 2002；8: 62-67.
[4] Knowles HJ, Harris AL. Hypoxia and oxidative stress in breast cancer: Hypoxia and tumourigenesis[J]. Breast Cancer Res, 2001；3(5):318-322.
[5] Pugh CW, Ratcliffe PJ. The von HippelLindau tumor suppressor, hypoxiainducible factor1 (HIF1) degradation, and cancer pathogenesis[J]. Semin Cancer Biol, 2003；13(1):83-89.
[6] Binley K, Askham Z, Martin L, et al. Hypoxiamediated tumour targeting[J]. Gene Ther, 2003; 10(7):540-549.
作者简介：韩风华(1950), 男(汉族)，河北省丰润县人.硕士，主任，副教授. Tel.(029)83375331Email.sywk@fmmu.edu.cn
(第四军医大学西京医院：1实验外科，2妇产科，陕西 西安 710033)
编辑王睿, http://www.100md.com(韩风华，辛晓燕，侯向华，杨红，邹伟)
HAN FengHua, XIN XiaoYan, HOU XiangHua, YANG Hong, ZOU Wei
1Department of Experimental Surgery, 2Department of Gyneology and Obstetrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of CD147 gene in human ovarian carcinoma cell lines during hypoxiareoxygenation. METHODS: Ovarian cancer cell lines 3AO and HO8910PM, highly expressed CD147, were incubated in hypoxia incubator and incubated with 50 mL/L CO2 and 950 mL/L N2. After 30min exposure to hypoxia, all of the cells were reoxygenated 4 h and 8 h respectively. Reoxygenation was achieved by replenishing the fresh medium and returning the cell cultures to a normoxic environment. Expression and location of CD147 were assessed by confocal laser scanning microscope (CLSM). RESULTS: CD147 was located at cytoplasm. Hypoxia upregulated the CD147 expression, but reoxygenation decreased the CD147 expression. With reoxygenation for 4 h to 8 h, the levels of CD147 expression dropped to the lowest. CONCLUSION: Hypoxia upregulates the expression of CD147 in human ovarian carcinoma cell lines and reoxygenation downregulates CD147 expression. The upregulated expression of CD147 during hypoxia is reversible.
【Keywords】 ovarian cancer; hypoxia; reoxygenation; CD147; CLSM
【摘要】 目的：探讨缺氧再氧合过程中CD147基因在卵巢癌细胞系中的表达. 方法：卵巢癌细胞系3AO,HO8910PM分别在混合气体缺氧仓中缺氧30 min后更换新鲜培养液，给予再氧合, 常氧下继续培养0，4，8 h. 激光共聚焦显微镜定位，定量检测CD147的表达. 结果：CD147定位于细胞质. 急性缺氧30 min后两种卵巢癌细胞系中CD147表达量明显高于对照组，再氧合4,8 h时CD147的表达量明显降低. 两种细胞株均表现为再氧合4 h时CD147的表达与对照相比无明显差异(P>0.05)，再氧合8 h时降为最低. 结论：缺氧上调卵巢癌细胞系中CD147的表达，再氧合可使高表达回降.
【关键词】 卵巢肿瘤； CD147； 缺氧； 再氧合； 激光共聚焦显微镜
0引言
CD147属免疫超家族成员，与肿瘤浸润转移相关. 我们先前的研究[1]表明CD147在卵巢癌组织中有不同程度表达，它与卵巢癌的浸润转移有密切关系[2]，但其作用机制尚未明了. 缺氧是实体肿瘤普遍存在的特征[3]，CD147的3′末端有两个缺氧反应元件结合位点，可能与缺氧有关. 我们探讨缺氧参与卵巢肿瘤CD147表达的调控如下.
1材料和方法
1.1材料
CD147 mAb由第四军医大学细胞工程中心提供. FITC由本校电镜中心提供. 卵巢癌细胞系3AO，HO8910PM由本实验室提供. 混合气体缺氧仓由西京医院神经内科提供. Avlomni Measurement血气分析仪由西京医院ICU提供. BioRad MRC1024型激光共聚焦显微镜和软件分析系统由第四军医大学电镜中心提供. 胰蛋白酶购自北京生物技术有限公司.
1.2方法
取3AO,HO8910PM对数生长期细胞,2.5 g/L胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液,将细胞接种到预先消毒并放置了载玻片的培养皿中，CO2孵育箱培养过夜(8 h)至细胞贴壁，贴壁细胞放入缺氧仓(950 mL/L N2, 50 mL/L CO2)中30 min致急性缺氧. 缺氧后的细胞分别再氧合4，8 h. 再氧合即更换新的细胞培养液继续在37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 取对照组贴壁细胞和在混合气体培养仓中急性缺氧30 min的贴壁培养细胞瓶送血气分析. 取出盖玻片，0.01 mmol/L，pH 7.4的PBS冲洗2次，丙酮固定液固定10 min后放入盖片染色缸中，PBS振洗5 min，取出吹干，滴加1∶10 CD147 mAb 20 μL置湿盒内37℃保湿30～60 min，PBS振洗3次，5 min/次，吹干，滴加FITC羊抗小鼠IgG 20 μL,置湿盒内，37℃保湿30～60 min，PBS振洗2次，5 min/次，蒸馏水振洗1次，500 mL/L缓冲甘油封片. 激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察并拍照，软件定量分析. 用于FITC的激发波长为488 nm，共聚焦系统由BioRad公司提供的软件控制，在Pentium90计算机中运行，显微镜聚焦旋钮由步进马达控制，用于图像采集的物镜为PlanNeofluar40×油镜. 图像存为512×512像素类型. 利用软件在镜下随机选取5个细胞，对其进行CLSM检测定量分析，读取均数和标准差.
统计学方法：利用SPSS软件进行单因素方差分析及LSDt检验.
2结果
2.1细胞终极培养液血气分析急性缺氧后细胞培养液pH 7.16. PO2为7.4 kPa;对照组pH为7.4，PO2为17.3 kPa. 缺氧仓中pH值试纸显示pH 5～6,说明仓中真实的环境PO2远低于7.4 kPa. PO2与氧浓度(FO2)的关系：PO2＝(吸入气压力-6.27)×FO2. 当PO2=18.6 kPa时，FO2=20%；且氧分压与氧浓度成正比关系. 本实验中FO2<8%，符合缺氧条件(<10%).
2.2CLSM检测CD147定位于细胞质中(Fig 1). 3AO,HO8910PM细胞均在为急性缺氧30 min后CD147表达量较对照组明显增加，再氧合4，8 h后CD147表达量明显降低(P=0.000). 采用LSDt进行均数多重比较，HO8910PM组在再氧合4，8 h和对照组比较均无明显差异(P>0.05)，余各组两两比较均有显著统计学差异(P<0.05)； 3AO组中各组比较均有显著统计学差异(P<0.05，Tab 1).表1缺氧再氧合过程中卵巢癌细胞系中CD147的表达(略)
3讨论
CLSM是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图，并能对抗原在细胞中的定位和定量作出精确的分析，较传统的免疫组化方法更为先进.
缺氧是肿瘤微环境的一种病理生理特征. 在实体肿瘤中, 由于肿瘤细胞增生迅速, 往往造成肿瘤局部的缺氧坏死. 同时, 缺氧作为一种应激反应还可诱导肿瘤相关显型基因表达增加，促进肿瘤的进展[4-6]. 我们先前的研究结果表明CD147在卵巢癌的发生、发展、浸润转移中起重要作用，可能是卵巢肿瘤的一个药靶分子. 本结果显示急性缺氧30 min后，卵巢癌细胞系8910PM和3AO中CD147的表达上调，而再氧合后卵巢癌细胞中CD147的表达下降，再氧合4～8 h时CD147的表达接近对照组表达量，且随着缺氧时间的延长CD147的表达逐渐降低,低于对照组. 可见缺氧所致卵巢癌细胞系中CD147的表达上调是可逆的，缺氧和再氧合可有效调控卵巢癌中CD147的表达，缺氧可能通过调控CD147的表达促进卵巢癌的发生、发展.
【参考文献】
[1] 贺书云, 辛晓燕, 王健. 基质金属蛋白酶2及CD147在卵巢上皮性肿瘤中的表达[J]. 第四军医大学学报,2001；22(5): 435-438.
He SY, Xin XY, Wang J. The expression of matrix metalloproteinase 2 and CD147 in ovarian cancer [J]. J Fourth Mil Med Univ, 2001；22(5): 435-438.
[2] 杨红，郑维国，辛晓燕，等. CD147反义核酸对卵巢癌细胞生物学行为的影响[J]. 第四军医大学学报, 2002;23(18):1657-1660.
Yang H, Zhen WG, Xin XY, et al. The influence of CD147 antisense ribonic acid on ovarian cancer cell biological action[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2002；23(18): 1657-1660.
[3] Semenza GL. HIF1 and tumor progression: Pathophysiology and therapeutics[J]. Trends Mol Med, 2002；8: 62-67.
[4] Knowles HJ, Harris AL. Hypoxia and oxidative stress in breast cancer: Hypoxia and tumourigenesis[J]. Breast Cancer Res, 2001；3(5):318-322.
[5] Pugh CW, Ratcliffe PJ. The von HippelLindau tumor suppressor, hypoxiainducible factor1 (HIF1) degradation, and cancer pathogenesis[J]. Semin Cancer Biol, 2003；13(1):83-89.
[6] Binley K, Askham Z, Martin L, et al. Hypoxiamediated tumour targeting[J]. Gene Ther, 2003; 10(7):540-549.
作者简介：韩风华(1950), 男(汉族)，河北省丰润县人.硕士，主任，副教授. Tel.(029)83375331Email.sywk@fmmu.edu.cn
(第四军医大学西京医院：1实验外科，2妇产科，陕西 西安 710033)
编辑王睿, http://www.100md.com(韩风华，辛晓燕，侯向华，杨红，邹伟)