结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性
Immunobiological properties of secretory protein MPT64 from Mycobacterium tuberculosis
BAI YinLan, XUE Ying, LI Yuan, XU ZhiKai, SHI ChangHong, ZHANG Hai
Department of Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To investigate the immunobiological properties of secretory protein MPT64 of MTB H37Rv. METHODS: BALB/c mice were immunized with MPT64 and ELISA was used to detect the antiMPT64 antibody titer in immunized mice sera. The level of IFNγ secreted from splenocytes of immunized mice after specificantigen stimulation was detected by a cytopathic effect reduction assay and the splenocytic proliferation of immunized mice in response to antigen restimulation was detected by MTT assay. RESULTS: MPT64immunized mice induced highertiters antiMPT64 antibodies and protective cellmediated immunity. Splenocytes of the immunized mice were restimulated by specific antigen in vitro and marked proliferation of splenocytes was observed. IFNγ levels of immunized mice was 1024 ng/L, while IFNγ levels of normal saline immunized mice was below 80 ng/L. CONCLUSION: MPT64 protein can be used as a component of a novel TB vaccine.
【Keywords】 mycobacterium; secretory protein; MPT64; immunobiology
【摘要】 目的：研究结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白MPT64的免疫学特性. 方法：用原核表达的MPT64蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果. 分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，MTT方法检测IFNγ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖，并对脾脏细菌负荷计数. 结果：MPT64免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫，免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激，淋巴细胞的增殖较显着. MTT方法检测小鼠的IFNγ量为1024 ng/L，而生理盐水对照组低于80 ng/L. 结论：MPT64蛋白有可能作为新型结核疫苗的组分.
【关键词】 结核分枝杆菌；分泌蛋白；MPT64；免疫学
0引言
研究表明，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白不但在豚鼠实验中可以引发迟发性超敏反应，在结核病(Tuberculosis,TB)患者体内也可诱导抗体的产生. 将MTB培养滤液(culture filtrate proteins，CFP)进行分馏得到多种蛋白，MPT64就是其中一种[1]. 研究发现MPT64可在动物感染模型引发T细胞反应和皮肤的迟发性超敏反应(delayedtype hypersensitivity，DTH)，可用作亚单位疫苗和特异性优于结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)的皮肤诊断试剂[2]. 我们在原核细胞中克隆表达了MTB分泌蛋白MTP64，并初步研究其免疫学特性，以期为后续的疫苗和诊断试剂研究奠定一定的基础.
1材料和方法
1.1材料
pProEX HTbMPT64为编码MPT64蛋白基因的原核表达质粒(第四军医大学微生物学教研室构建)[3]. E.coli DH5α,L929细胞、VSV由本室保存，RPMI 1640及MTT购自Sigma公司，IFNγ标准品购自晶美公司. BALB/c雌性小鼠，30只，6~8 wk龄，由第四军医大学实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1MPT64蛋白的原核诱导表达将pProEX HTbMPT64转化E.coli DH5α，IPTG诱导4 h,表达目的蛋白[3].
1.2.2动物免疫初次免疫采用皮下包埋的方法：MPT64表达菌经裂解后,先进行SDSPAGE,再行Westernblot，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,丽春红染色确定表达蛋白带后,将印有表达蛋白条带的硝酸纤维素膜剪下包埋于实验组小鼠(n=10)腹股沟皮下. 后2次免疫用剪下的SDSPAGE凝胶上的表达蛋白条带，匀浆后，5000 r/min离心5 min，取匀浆上清(简称上清),于小鼠后大腿每侧肌肉注射50 μL，同时设BCG免疫组(n=10)和生理盐水阴性对照组(n=10).
1.2.3血清中抗MPT64抗体的测定免疫完成后第4周剪鼠尾取血，分离血清，-20℃保存备检. 用MTB CFP(培养滤液蛋白)包被ELISA板，4℃过夜，10 g/L BSA 37℃封闭30 min，洗涤后加不同稀释度的待测血清，二抗为羊抗鼠1gGHRP OPD产物显色后，测A490 nm值，以正常鼠血清作阴性对照，P/N≥2.1为阳性.
1.2.4抗原特异的脾淋巴细胞增殖实验[4]分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，调整细胞数为5×108/L，每孔200 μL，在96孔板用含100 mL/L FCS的RPMI 1640完全培养液中培养，同时每孔加入匀浆上清50 μL为实验组，对照组不加匀浆上清，调零孔不加脾细胞，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养68 h后，每孔加入20 μL MTT (5 g/L,溶于PBS，pH 7.2)继续培养4 h后终止培养，弃尽上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测A490 nm值，结果用刺激指数(stimulation index, SI)SI=A(实验组)/A(对照组).
1.2.5IFNγ的诱生和测定[5]5×109/ L脾细胞在96孔板用含100 mL/L FCS的RPMI 1640完全培养液培养，每孔200 μL,同时每孔加入匀浆上清50 μL, 37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养72 h后，每组3个孔中的培养液混合，5000 r/min离心5 min,取上清于-20℃冻存备检. MTT法检测IFNγ含量. L929细胞用含50 mL/L FCS的RPMI 1640完全培养液在96孔板培养，每孔约3×104个细胞，各加不同稀释度的待检样品和IFNγ标准品，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养24 h，再加50 μL 100TCID50 VSV攻击20 h,每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h后终止培养，同上检测A490 nm值，以标准IFNγ为准根据直线作图法计算待测IFNγ含量.
2结果
2.1MPT64蛋白的原核诱导表达取一组重组菌诱导表达产物进行SDSPAGE ，诱导的重组菌约在Mr 2.6×104处有一蛋白带，同预计的大小相吻合，而未诱导菌无此条带(Fig 1).
2.2免疫血清中抗MPT64抗体水平用ELISA的方法检测MPT64免疫组鼠血清抗MPT64抗体滴度平均为1∶100，生理盐水对照组抗体为阴性.
2.3脾淋巴细胞增殖实验在体外用抗原刺激，结果可见MPT64蛋白免疫小鼠和BCG免疫小鼠的淋巴细胞增殖显著，其刺激指数分别为2.3和3.1. 而生理盐水对照组淋巴细胞的增殖不显著，刺激指数为1.0(Fig 2).
2.4IFNγ的含量测定MPT64蛋白免疫小鼠的脾细胞悬液可检测到IFNγ的含量显着增加，为1024 ng/L，但是和BCG免疫小鼠组IFNγ含量1470 ng/L还有一定差距. 生理盐水对照组IFNγ的含量低于80 ng/L(1 U相当于100 pg).
3讨论
在本实验中，我们用原核表达载体表达的MPT64融合蛋白免疫小鼠，可诱导产生相应的抗体，脾淋巴细胞增殖实验结果显示MPT64组小鼠脾细胞的增殖指数明显高于生理盐水阴性对照组. 生物学方法检测IFNγ的结果显示，MPT64组和BCG组小鼠的脾细胞悬液中均可检测到IFNγ含量的增加，说明MPT64蛋白可诱导小鼠获得性免疫反应，但是作为单一抗原，其免疫保护力与BCG相比还是有一定差距. 有研究认为MPT64蛋白主要存在于分枝杆菌毒株中[6]，因此可能与致病性相关，在本研究中，重组MPT64蛋白免疫的小鼠无不良反应.
多种研究表明由MHCII类分子介导的CD4+T细胞在抗MTB和牛型分枝杆菌感染的保护性免疫中起主要作用，这类细胞亚群是刺激巨噬细胞产生抗菌细胞因子如IFNγ的主要源泉，因而在控制感染方面有重要作用. 将感染小鼠T细胞分离出来，过继免疫正常小鼠，并用毒株攻击，结果证实消灭细胞内寄生菌需要CD4+和CD8+T细胞共同作用. 现在研制的疫苗中，大多以引起CD4+ Th1型细胞免疫反应为主. 在引起人类T细胞针对MTB特异反应抗原中，MPT64是一种比较重要和相对特异的蛋白，天然MPT64蛋白是Mr 23×103的分泌蛋白，在MTB培养早期分泌到滤液中. Roche等[7]绘制了MPT64蛋白的免疫原性表位，发现T细胞决定簇遍布分子的全序，C末端序列184～228aa是相对特异的T细胞表位， (190～198)多肽为H2D(b)限制性的CD8+T细胞表位. 因此，在TB疫苗免疫的策略中，加入激活特异性的CD8+T细胞抗原成分可能提高疫苗的整体保护率[8].
【参考文献】
[1] Feng CG, Blanchard TJ, Smith GL, et al. Induction of CD8+ Tlymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus [J]. Immunol Cell Biol, 2001;79(6):569-575.
[2] Roche PW, Winter N, Triccas JA, et al. Expression of Mycobacterium tuberculosis MPT64 in recombinant Myco. smegmatis: Purification, immunogenicity and application to skin tests for tuberculosis [J]. Clin Exp Immunol, 1996;103(2):226-232.
[3] 柏银兰，李元，李别虎，等. 结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定[J]. 第四军医大学学报，2003;24(1):43-45.
Bai YL, Li Y, Li BH, et al. Cloning and expression of secreted protein MPT64 of Mycobacterium tuberculosis [J]. J Fourth Mil Med Univ，2003;24(1):43-45.
[4] 薛莹,李元,史皆然，等. 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性[J]. 第四军医大学学报，2002;23(13):1203-1205.
Xue Y, Li Y, Shi JR, et al. Immunobiological properties of secretory protein Ag85B from Mycobacterium tuberculosis [J]. J Fourth Mil Med Univ，2002;23(13):1203-1205.
[5] 范雄林，徐志凯，李元，等. 结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫[J]. 第四军医大学学报，2001；22(14)：1283-1287.
Fan XL，Xu ZK，Li Y，et al. Gene vaccination of Mycobacterium tuberculosis DNA vaccine encoding mature form of Ag85B [J]. J Fourth Mil Med Univ，2001；22(14)：1283-1287.
[6] Repique CJ, Li A, Collins F, et al. DNA immunization in a mouse model of latent tuberculosis: Effect of DNA vaccination on reactivation of disease and on reinfection with a secondary challenge [J]. Infect Immun, 2002; 70(7):3318-3323.
[7] Roche PW, Feng CG, Britton WJ. Human Tcell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64 [J]. Scand J Immunol, 1996; 43(6):662-670.
[8] Rao V, Dhar N, Tyagi AK. Modulation of host immune responses by overexpression of immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis in bacille calmetteguerin [J]. Scand J Immunol, 2003;58(4):449-461.
基金项目：军队“十五”重点课题(01Z083)
通讯作者：李元. Tel.(029)83374527 Email.liyuan@fmmu.edu.cn
作者简介：柏银兰(1975)，女(汉族)，宁夏回族自治区银川市人. 助教. Tel.(029)83374527
(第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
编辑甄志强, 百拇医药(柏银兰，薛莹，李元，徐志凯，师长宏，张海)
BAI YinLan, XUE Ying, LI Yuan, XU ZhiKai, SHI ChangHong, ZHANG Hai
Department of Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China
【Abstract】 AIM: To investigate the immunobiological properties of secretory protein MPT64 of MTB H37Rv. METHODS: BALB/c mice were immunized with MPT64 and ELISA was used to detect the antiMPT64 antibody titer in immunized mice sera. The level of IFNγ secreted from splenocytes of immunized mice after specificantigen stimulation was detected by a cytopathic effect reduction assay and the splenocytic proliferation of immunized mice in response to antigen restimulation was detected by MTT assay. RESULTS: MPT64immunized mice induced highertiters antiMPT64 antibodies and protective cellmediated immunity. Splenocytes of the immunized mice were restimulated by specific antigen in vitro and marked proliferation of splenocytes was observed. IFNγ levels of immunized mice was 1024 ng/L, while IFNγ levels of normal saline immunized mice was below 80 ng/L. CONCLUSION: MPT64 protein can be used as a component of a novel TB vaccine.
【Keywords】 mycobacterium; secretory protein; MPT64; immunobiology
【摘要】 目的：研究结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白MPT64的免疫学特性. 方法：用原核表达的MPT64蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果. 分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原再刺激，MTT方法检测IFNγ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖，并对脾脏细菌负荷计数. 结果：MPT64免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫，免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激，淋巴细胞的增殖较显着. MTT方法检测小鼠的IFNγ量为1024 ng/L，而生理盐水对照组低于80 ng/L. 结论：MPT64蛋白有可能作为新型结核疫苗的组分.
【关键词】 结核分枝杆菌；分泌蛋白；MPT64；免疫学
0引言
研究表明，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白不但在豚鼠实验中可以引发迟发性超敏反应，在结核病(Tuberculosis,TB)患者体内也可诱导抗体的产生. 将MTB培养滤液(culture filtrate proteins，CFP)进行分馏得到多种蛋白，MPT64就是其中一种[1]. 研究发现MPT64可在动物感染模型引发T细胞反应和皮肤的迟发性超敏反应(delayedtype hypersensitivity，DTH)，可用作亚单位疫苗和特异性优于结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)的皮肤诊断试剂[2]. 我们在原核细胞中克隆表达了MTB分泌蛋白MTP64，并初步研究其免疫学特性，以期为后续的疫苗和诊断试剂研究奠定一定的基础.
1材料和方法
1.1材料
pProEX HTbMPT64为编码MPT64蛋白基因的原核表达质粒(第四军医大学微生物学教研室构建)[3]. E.coli DH5α,L929细胞、VSV由本室保存，RPMI 1640及MTT购自Sigma公司，IFNγ标准品购自晶美公司. BALB/c雌性小鼠，30只，6~8 wk龄，由第四军医大学实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1MPT64蛋白的原核诱导表达将pProEX HTbMPT64转化E.coli DH5α，IPTG诱导4 h,表达目的蛋白[3].
1.2.2动物免疫初次免疫采用皮下包埋的方法：MPT64表达菌经裂解后,先进行SDSPAGE,再行Westernblot，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,丽春红染色确定表达蛋白带后,将印有表达蛋白条带的硝酸纤维素膜剪下包埋于实验组小鼠(n=10)腹股沟皮下. 后2次免疫用剪下的SDSPAGE凝胶上的表达蛋白条带，匀浆后，5000 r/min离心5 min，取匀浆上清(简称上清),于小鼠后大腿每侧肌肉注射50 μL，同时设BCG免疫组(n=10)和生理盐水阴性对照组(n=10).
1.2.3血清中抗MPT64抗体的测定免疫完成后第4周剪鼠尾取血，分离血清，-20℃保存备检. 用MTB CFP(培养滤液蛋白)包被ELISA板，4℃过夜，10 g/L BSA 37℃封闭30 min，洗涤后加不同稀释度的待测血清，二抗为羊抗鼠1gGHRP OPD产物显色后，测A490 nm值，以正常鼠血清作阴性对照，P/N≥2.1为阳性.
1.2.4抗原特异的脾淋巴细胞增殖实验[4]分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，调整细胞数为5×108/L，每孔200 μL，在96孔板用含100 mL/L FCS的RPMI 1640完全培养液中培养，同时每孔加入匀浆上清50 μL为实验组，对照组不加匀浆上清，调零孔不加脾细胞，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养68 h后，每孔加入20 μL MTT (5 g/L,溶于PBS，pH 7.2)继续培养4 h后终止培养，弃尽上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测A490 nm值，结果用刺激指数(stimulation index, SI)SI=A(实验组)/A(对照组).
1.2.5IFNγ的诱生和测定[5]5×109/ L脾细胞在96孔板用含100 mL/L FCS的RPMI 1640完全培养液培养，每孔200 μL,同时每孔加入匀浆上清50 μL, 37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养72 h后，每组3个孔中的培养液混合，5000 r/min离心5 min,取上清于-20℃冻存备检. MTT法检测IFNγ含量. L929细胞用含50 mL/L FCS的RPMI 1640完全培养液在96孔板培养，每孔约3×104个细胞，各加不同稀释度的待检样品和IFNγ标准品，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养24 h，再加50 μL 100TCID50 VSV攻击20 h,每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h后终止培养，同上检测A490 nm值，以标准IFNγ为准根据直线作图法计算待测IFNγ含量.
2结果
2.1MPT64蛋白的原核诱导表达取一组重组菌诱导表达产物进行SDSPAGE ，诱导的重组菌约在Mr 2.6×104处有一蛋白带，同预计的大小相吻合，而未诱导菌无此条带(Fig 1).
2.2免疫血清中抗MPT64抗体水平用ELISA的方法检测MPT64免疫组鼠血清抗MPT64抗体滴度平均为1∶100，生理盐水对照组抗体为阴性.
2.3脾淋巴细胞增殖实验在体外用抗原刺激，结果可见MPT64蛋白免疫小鼠和BCG免疫小鼠的淋巴细胞增殖显著，其刺激指数分别为2.3和3.1. 而生理盐水对照组淋巴细胞的增殖不显著，刺激指数为1.0(Fig 2).
2.4IFNγ的含量测定MPT64蛋白免疫小鼠的脾细胞悬液可检测到IFNγ的含量显着增加，为1024 ng/L，但是和BCG免疫小鼠组IFNγ含量1470 ng/L还有一定差距. 生理盐水对照组IFNγ的含量低于80 ng/L(1 U相当于100 pg).
3讨论
在本实验中，我们用原核表达载体表达的MPT64融合蛋白免疫小鼠，可诱导产生相应的抗体，脾淋巴细胞增殖实验结果显示MPT64组小鼠脾细胞的增殖指数明显高于生理盐水阴性对照组. 生物学方法检测IFNγ的结果显示，MPT64组和BCG组小鼠的脾细胞悬液中均可检测到IFNγ含量的增加，说明MPT64蛋白可诱导小鼠获得性免疫反应，但是作为单一抗原，其免疫保护力与BCG相比还是有一定差距. 有研究认为MPT64蛋白主要存在于分枝杆菌毒株中[6]，因此可能与致病性相关，在本研究中，重组MPT64蛋白免疫的小鼠无不良反应.
多种研究表明由MHCII类分子介导的CD4+T细胞在抗MTB和牛型分枝杆菌感染的保护性免疫中起主要作用，这类细胞亚群是刺激巨噬细胞产生抗菌细胞因子如IFNγ的主要源泉，因而在控制感染方面有重要作用. 将感染小鼠T细胞分离出来，过继免疫正常小鼠，并用毒株攻击，结果证实消灭细胞内寄生菌需要CD4+和CD8+T细胞共同作用. 现在研制的疫苗中，大多以引起CD4+ Th1型细胞免疫反应为主. 在引起人类T细胞针对MTB特异反应抗原中，MPT64是一种比较重要和相对特异的蛋白，天然MPT64蛋白是Mr 23×103的分泌蛋白，在MTB培养早期分泌到滤液中. Roche等[7]绘制了MPT64蛋白的免疫原性表位，发现T细胞决定簇遍布分子的全序，C末端序列184～228aa是相对特异的T细胞表位， (190～198)多肽为H2D(b)限制性的CD8+T细胞表位. 因此，在TB疫苗免疫的策略中，加入激活特异性的CD8+T细胞抗原成分可能提高疫苗的整体保护率[8].
【参考文献】
[1] Feng CG, Blanchard TJ, Smith GL, et al. Induction of CD8+ Tlymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus [J]. Immunol Cell Biol, 2001;79(6):569-575.
[2] Roche PW, Winter N, Triccas JA, et al. Expression of Mycobacterium tuberculosis MPT64 in recombinant Myco. smegmatis: Purification, immunogenicity and application to skin tests for tuberculosis [J]. Clin Exp Immunol, 1996;103(2):226-232.
[3] 柏银兰，李元，李别虎，等. 结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定[J]. 第四军医大学学报，2003;24(1):43-45.
Bai YL, Li Y, Li BH, et al. Cloning and expression of secreted protein MPT64 of Mycobacterium tuberculosis [J]. J Fourth Mil Med Univ，2003;24(1):43-45.
[4] 薛莹,李元,史皆然，等. 结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性[J]. 第四军医大学学报，2002;23(13):1203-1205.
Xue Y, Li Y, Shi JR, et al. Immunobiological properties of secretory protein Ag85B from Mycobacterium tuberculosis [J]. J Fourth Mil Med Univ，2002;23(13):1203-1205.
[5] 范雄林，徐志凯，李元，等. 结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫[J]. 第四军医大学学报，2001；22(14)：1283-1287.
Fan XL，Xu ZK，Li Y，et al. Gene vaccination of Mycobacterium tuberculosis DNA vaccine encoding mature form of Ag85B [J]. J Fourth Mil Med Univ，2001；22(14)：1283-1287.
[6] Repique CJ, Li A, Collins F, et al. DNA immunization in a mouse model of latent tuberculosis: Effect of DNA vaccination on reactivation of disease and on reinfection with a secondary challenge [J]. Infect Immun, 2002; 70(7):3318-3323.
[7] Roche PW, Feng CG, Britton WJ. Human Tcell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64 [J]. Scand J Immunol, 1996; 43(6):662-670.
[8] Rao V, Dhar N, Tyagi AK. Modulation of host immune responses by overexpression of immunodominant antigens of Mycobacterium tuberculosis in bacille calmetteguerin [J]. Scand J Immunol, 2003;58(4):449-461.
基金项目：军队“十五”重点课题(01Z083)
通讯作者：李元. Tel.(029)83374527 Email.liyuan@fmmu.edu.cn
作者简介：柏银兰(1975)，女(汉族)，宁夏回族自治区银川市人. 助教. Tel.(029)83374527
(第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
编辑甄志强, 百拇医药(柏银兰，薛莹，李元，徐志凯，师长宏，张海)