第 31 卷 第 1 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vo l . 31 No. 1

    2003 年 2 月 Jour . of No r thw est Sci2Tech U niv . of A gr i . and Fo r . (N at . Sci . Ed . ) Feb . 2003

    枸杞胚细胞悬浮培养系统建立的研究X

    胡博然1, 2

    , 徐文彪3

    , 马峰旺1

    (1 西北农林科技大学 园艺学院, 陕西 杨陵 712100; 2 宁夏农林科学院 园艺研究所, 宁夏 银川 750002;

    3 宁夏银川市园林局, 宁夏 银川 750002)

    [摘 要] 以宁夏农科院选育的新品种宁杞 1 号 3 年生树为试材, 对影响枸杞胚细胞悬浮培养及其再生系统

    建立的培养基与激素配比进行了研究。结果表明, 以人工授粉后 18 d 的幼果, 剖取成熟胚作为外植体, 选择M S+

    6BA 1. 0 mg? L + IBA 0. 5 mg? L 培养基诱导愈伤组织, 经单细胞悬浮培养建立了稳定的细胞系;M S+ 6BA 0. 2

    mg? L 培养基较为适宜枸杞胚状体萌发成苗, 该再生苗转移到M S+ NAA 0. 2 mg? L 生根培养基上, 诱导生根并获

    得完整植株; 共移栽成活 14 株, 成活率达38. 8%。

    [关键词] 宁夏枸杞; 胚培养; 细胞悬浮培养; 植株再生

    [中图分类号] S567. 1+

    9 [文献标识码] A [文章编号] 167129387 (2003) 0120097204

    枸杞(L y cium ba rba rnm L. )属茄科枸杞属, 是

    多年生双子叶落叶灌木。原产我国北部, 河北、内蒙

    古、山西、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆有野生分布,果实(枸杞子)、叶(天精叶)、根皮(地骨皮)均可入

    药。约在17 世纪中叶引入欧洲, 现在欧洲及地中海

    沿岸以及北美洲都有种植并成为野生。新品种“宁杞

    1 号”、“宁杞 2 号”的育成[ 1, 2 ]

    , 标志着人们对枸杞产

    量、果实大小和品质等性状的成功改良。随着我国近

    年对枸杞药用保健价值的进一步开发, 1999 年栽培

    面积已达2. 5 万hm 2

    , 年产干果2 000 万kg, 从而对

    枸杞育种工作提出了更高的要求。

    近年来, 国内外学者十分重视枸杞单细胞培养

    的研究, 张国柱等[ 3 ]

    以枸杞幼芽和叶片为外植体, 牛

    德水等[ 4, 5 ]

    以种子下胚轴为外植体, 均获得了单细胞

    培养的完整植株。本研究首次以枸杞成熟胚为外植

    体, 进行了单细胞分离悬浮培养, 并诱导形成了完整

    植株, 从而建立了枸杞单细胞实验体系, 为枸杞品种

    改良, 特别是为细胞突变体的筛选打下了基础。

    1 材料与方法

    1. 1 供试品种

    宁杞 1 号 3 年生结果幼树, 选自宁夏农科院园

    艺研究所试验基地。

    1. 2 培养基

    试验所用培养基为M S 固体与液体培养基。

    愈伤组织诱导培养基 A 1:M S+ 2, 42 D 0. 5

    m g? L + 蔗糖 30 g? L + 琼脂 6 g? L ; A 2:M S+ 6BA

    0. 5 m g? L + IBA 0. 5 m g? L + 蔗糖 30 g? L + 琼脂

    6 g? L;A 3:M S+ 6BA 1. 0 m g? L + IBA 0. 5 m g? L +

    蔗糖30 g? L + 琼脂6 g? L;A 4:M S+ 6BA 0. 5 m g? L

    + 蔗糖 30 g? L + 琼脂 6 g? L ;A 5:M S+ 蔗糖 30 g? L

    + 琼脂6 g? L。

    胚性愈伤组织诱导培养基 A 3 培养基+ 水解

    酪蛋白CH 500 m g? L。

    细胞悬浮培养培养基 (1)继代培养培养基:

    A 3 培养基(不加琼脂) + CH 500 m g? L; (2)胚状体

    分化培养基é :M S (不加琼脂) + 6BA 0. 2 m g? L +

    蔗糖 30 g? L; 胚状体分化培养基ê :M S (不加琼脂)

    + 2, 42 D 0. 2 m g? L + 蔗糖30 g? L。胚状体分化(固

    体)培养基, C1:M S+ 蔗糖 30 g? L + 琼脂 6 g? L , C2:

    M S+ NAA 0. 1 m g? L + 蔗糖 30 g? L + 琼脂 6 g? L ,C3:M S+ NAA 0. 1m g? L + KT 0. 1m g? L + 蔗糖30

    g? L + 琼脂 6 g? L , C4:M S+ 6BA 0. 2 m g? L + 蔗糖

    30 g? L + 琼脂 6 g? L; 胚状体生根培养基:M S +

    NAA 0. 2 m g? L + 蔗糖30 g? L + 琼脂6 g? L。

    1. 3 外植体的获取

    将宁杞 1 号授粉后 18 d 的幼果, 经体积分数

    75%的乙醇浸泡 3 s, 放入体积分数 0. 2%的HgCl2

    溶液中消毒5 m in, 随后用无菌水冲洗3 次。在无菌

    条件下, 借助解剖镜, 用解剖刀将种子从种脊切开,X [收稿日期] 2002208220

    [基金项目] 宁夏回族自治区科委重点资助项目(970117014)

    [作者简介] 胡博然(1966- ) , 女, 河北博野人, 副研究员, 在读博士, 主要从事果树生物技术与葡萄酒研究。

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.将成熟胚取出接种于含不同激素的M S (附加

    30 g? L蔗糖和 6 g? L 琼脂)培养基上进行培养。

    1. 4 愈伤组织诱导

    采用A 1,A 2,A 3,A 4,A 5 5 种含不同激素的M S

    培养基诱导愈伤组织, 每处理接种胚20 个。培养条

    件为先暗培养24 h 后转入正常培养, 培养温度为25

    ～ 28 ℃, 光照12 h? d, 光照强度2 000 lx。

    1. 5 胚性愈伤组织继代培养

    取生长致密、白色略透明的愈伤组织块接种到

    胚性愈伤组织诱导培养基, 每 3 周继代 1 次。2～ 3

    次继代后, 出现疏松颗粒状胚性愈伤组织, 选择颗粒

    较细的愈伤组织按其生长速度, 加快继代频率(2 周

    1 次)。当愈伤组织松散易脆, 颗粒均匀且生长迅速

    时, 改为3 周1 次, 以保持愈伤组织的胚性状态。

    1. 6 单细胞的分离

    取鲜重 1～ 2 g 上述愈伤组织, 置于盛有 20 mL

    培养基的 100 mL 三角瓶中, 用玻璃棒将愈伤组织

    捣碎, 然后放在振荡速度为 100 r? m in 的摇床上暗

    培养约3 周, 所用培养基与继代培养基相同。培养温

    度(26±1) ℃, 然后用直径 0. 147 mm 镍丝网过滤,除去愈伤组织碎片及较大的细胞聚集体。经过滤后

    获得95%左右的单个游离细胞。

    1. 7 细胞悬浮培养

    将上述计算起始密度所剩余的 1? 3 上清液倒入

    离心管中, 并根据需要起始密度, 补充加入新鲜的培

    养基。如经过分离过程细胞活性变化不大, 即可将悬

    浮液继续在 110 r? m in 旋转式摇床上振荡培养。暗

    培养温度(27±1) ℃, 连续10 d, 每天取样进行细胞

    密度计数, 并绘制细胞生长曲线 ......