菌 物 学 报 24(1)：42~47, 2005

    Mycosystema

    茯苓与凤尾菇目间原生质体融合研究初报

    彭卫红 甘炳成 郑林用 王 勇 刘本洪 谭 伟

    黄忠乾 唐家蓉 肖在勤

    (四川省农业科学院土壤肥料研究所 农业部长江上游资源与环境重点开放实验室 成都610066)

    摘 要：以无锁状联合的茯苓次级菌丝和具锁状联合的凤尾菇次级菌丝为亲本制备原生质体,以 PEG 为促融剂， 在高钙、高 pH条件下，将茯苓(或凤尾菇) 原生质体热灭活,与凤尾菇 (或

    茯苓)原生质体融合，从再生菌株中均能选择选择出能够再形成双核的单核菌株。栽培实验

    结果显示，单核菌株经诱导形成双核菌株后可以形成子实体或原基，若单核菌株不经诱导,则始终维持稳定的单核状态，且难以形成子实体。

    关键词：锁状联合，单核菌株，双核菌株

    中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472(2005)01-0042-0047

    细胞融合技术是改进品种风味和创造新品种的有效方法之一，在我国、日本和西欧的研

    究进展较快。近 30 年来已经在种内、种间、属间科间获得了以异核体为主的大量融合子，但

    异核体不稳定，常造成分离(张树庭和林芳灿, 1997) 。很多学者认为不亲和性亲本融合的产

    物,只有在核融合的情况下才稳定(赵永昌和张树庭，1995) ，结果同时也表明在原生质体融

    合中,发生核融合的频率很低，而且即使核融合后得到的融合子也难以形成子实体。多年以来,原生质体融合的相关研究中，对亲本细胞质核细胞核都发生了融合的单核融合子研究不多。

    在我们对食用菌单核再生菌株进行研究的过程中，发现部分单核再生菌株经过适当的诱

    导能形成双核并产生子实体，并相继在金针菇Flammulina velutipes (M.A. Curt：Fr.)和凤

    尾菇Pleurotus pulmonarius(Fr.)Qué l. 的科间融合(肖在勤等，1998) ，金针菇 F. velutipes

    与白色糙皮侧耳Pleurotus ostreatus(Jacq. : Fr.)Qué l. 的科间融合(彭卫红等，2001 年) ，以

    及长根菇 Oudemanisella radicata (Relhan： Fr.) Singer与鸡 Termitomyces albuminosus (Berk.)

    Heim的属间融合(彭卫红等，2002 年)中得到可以出菇的优良菌株在生产中应用。

    非褶菌目 Aphyllophorales多孔菌科Polyporaceae的茯苓Poria cocos(Schwein.)Wolf和

    伞菌目 Agaricales侧耳科Pleurotaceae的凤尾菇P. pulmonarius分属不同的目， 亲缘关系较远,常规原生质体融合技术难以得到可以出菇的融合子，在本项研究中，我们以融合再生单核菌

    株为研究对象，获得了8 株可以双核化的单核菌株，现将研究结果报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 供试菌株

    基金项目：

    农业部重点项目 (核融合及融合核分裂技术在食用菌良种选育中的应用研究，编号，99-农-06)

    收原稿日期：2004-03-15，收修改稿日期：2004-08-10 1期 彭卫红等：茯苓与凤尾菇目间原生质体融合研究初报 43

    茯苓 Poria cocos(次级菌丝无锁状联合) ，凤尾菇 P. pulmonarius， (次级菌丝具锁状联

    合) ，以上菌株均为四川省农业科学院土壤肥料研究所微生物室保藏菌种。

    1.2 培养基

    1.2.1 试管培养基：马铃薯20%，蔗糖2%，琼脂2%。

    1.2.2 液体培养基： 即发干酵母粉 0.5%，蛋白胨 0.05%，蔗糖 2%，磷酸二氢钾 0.05%，硫

    酸镁0.05%。

    1.2.3 再生培养基： 蔗糖0.4molL，即发干酵母粉0.5%，蛋白胨0.05%，琼脂下层用2%, 上

    层用0.3%。

    1.2.4 瓶栽出菇料配方：棉籽壳93%，麸皮4%，蔗糖1%，石膏1%，石灰1%，含水量65%,pH自然

    1.3 试剂

    1.3.1 酶制剂：溶壁酶(Lywallzyme)购于广东微生物所，用0.6molL MgSO4配制成 1.5%浓

    度的酶液，现配现用。

    1.3.2 融合剂：PEG 25%，CaCl2·H2O50mmolL，甘露醇0.6molL，PH8.0。

    1.4 方法

    1.4.1 适龄菌丝体培养：采用三角瓶液体浅层静培5～6d，无菌条件下切取边缘幼嫩菌丝备用

    1.4.2 原生质体分离与计数：称取约600mg供试菌株适龄湿菌丝体置于50ml 三角瓶中，注入

    2ml酶液，于28℃摇床上酶解3.5hr，过滤、离心、清洗后定容至2ml，用血球计数板计算原

    生质体数。

    1.4.3 灭活茯苓原生质体与凤尾菇原生质体的融合

    热灭活处理：将茯苓原生质体置于55℃水浴内灭活处理45min。原生质体融合与再生培

    养：取热灭活茯苓原生质体 1ml，加入凤尾菇原生质体 1ml，再加入 2ml 融合剂，在 32℃下

    温育 25min，离心，去除融合剂，清洗 2 次，适当稀释。分别吸取 0.1ml 经热灭活的茯苓原

    生质体，稀释后的凤尾菇原生质体，以及融合处理后稀释的原生质体，各涂10 皿，覆盖一薄

    层上层再生培养基，置24℃培养箱中培养后观察计数。

    1.4.4 单核再生菌株的选择：将再生菌株逐一分别转接于斜面培养基上培养后，挑取少量菌

    丝制片镜检，选择出无锁状联合菌株。并将其分别与凤尾菇的单孢菌株杂交，保留经杂交不

    产生锁状联合的单核菌株。

    1.4.5 单核菌株的双核化：将1.4.4 所得无锁状联合的菌株进行双核化处理(彭卫红等，2001

    年) ，并分别保留单核菌株和经过双核化处理后得到的双核菌株

    1.4.6 单核、双核菌株的栽培出菇试验：将1.4.4 和1.4.5 所得单核、双核菌株分别进行瓶栽，观察记录出菇情况。常规灭菌、接种、培养发菌和出菇管理。

    1.4.7 单核菌株及其衍生双核化菌株的稳定性观察：将单核菌株和双核化后的菌株进行出菇

    实验，观察菌株在形态、温型、色泽等农艺性状上的稳定情况。

    1.4.8 对照试验：灭活凤尾菇原生质体与茯苓原生质体的融合

    热灭活处理：将凤尾菇原生质体置于55℃水浴内灭活处理45min；原生质体融合与再生

    培养同1.4.3；再生菌株检出与双核化：将再生菌株逐一分别转接于斜面培养基上，挑取少量

    菌丝制片镜检，选择无锁状联合的单核菌株，将其分别与亲本茯苓单孢菌株进行拮抗实验,保留产生拮抗的再生菌株。将与亲本单孢菌株产生拮抗的单核再生菌株进行双核化处理。之

    后处理与上相同 44 菌 物 学 报 24卷

    2 试验结果

    2.1 灭活茯苓原生质体与凤尾菇原生质体的融合

    2.1.1原生质体数： 茯苓原生质体数为1.132×107

    个ml； 凤尾菇原生质体数为1.012×104

    个ml。

    2.1.2 热灭活结果：10 皿共涂1.132×107

    个ml热灭活的茯苓原生质体，培养15d后观察，没

    有出现再生菌株，再生率为0，表明茯苓原生质体经热灭活处理后已全部失去再生能力。

    2.1.3 凤尾菇原生质体再生率：10 皿共涂1.012×104

    个凤尾菇原生质体，再生培养出2657 个

    菌株，再生率为26.25%。

    2.1.4 融合处理后的再生菌株数： 热灭活茯苓原生质体与凤尾菇原生质体融合处理后 ......