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    SICHUAN CAOYUAN 四川草原 牧草科学

    苜蓿(Medicago sativa)作为最重要的豆科牧草，其再生体系的构建和遗传转化的研究受到广泛的重视。

    构建苜蓿再生体系的方法主要有： 愈伤组织再生途径、原生质体再生途径和胚状体再生途径。遗传转化的方

    法主要有农杆菌介导法和基因枪法等。本文主要讨论

    这些方法的研究进展及存在的问题。

    1 苜蓿再生体系的构建方法

    苜蓿再生体系的构建是苜蓿遗传转化研究中的一

    个重要组成部分， 为了提高转化效率， 缩短试验周期，解决苜蓿遗传转化中的嵌合体问题，国内外学者对不

    同途径的苜蓿再生体系进行了研究和优化。

    1.1 愈伤组织再生途径

    愈伤组织再生途径是指由外植体经脱分化形成愈

    伤组织， 并通过再分化培养而得再生植株的受体系统。

    舒文华[1]等(1993)通过B5和MS组合培养基，用单

    一激素2，4-D成功地进行了和田苜蓿的组织培养，愈

    伤分化率达到81.4%，60~70 d即可完成植株再生。张

    万军[2]等(2002)对秘鲁苜蓿等品种的子叶和下胚

    轴愈伤组织再生植株的过程进行系统研究，建立了紫

    花苜蓿愈伤成苗高频再生体系，该体系可使秘鲁苜蓿

    的子叶愈伤组织分化率达到100%， 下胚轴愈伤组织分

    化率达到92%以上，且完成植株再生只需60~70 d。肖

    荷霞[3]等(2003)以紫花苜蓿无菌苗的下胚轴、茎

    和叶3种不同外植体为材料，在添加不同浓度激素的

    MS培养基上诱导愈伤组织再生成功，且分化率较高，达90.9%。可见，该体系具有扩繁量大，外植体取材

    广泛，苜蓿多种器官及组织能实现再生的优点。但该

    体系在植物遗传转化的应用上，由于往往存在遗传变

    异大、不稳定、嵌合体较多，随着愈伤组织培养继代

    的延长，嵌合体比例增加的问题，在一定程度上限制

    了其在苜蓿遗传转化上的广泛应用。

    1.2 原生质体再生途径

    原生质体再生途径是指通过分离原生质体进行培

    养，经愈伤组织分化出再生植株的方法。其主要优点

    是外源DNA的摄取更加有效，嵌合体较少，但遗传变

    异更大、稳定性更差，培养周期较长、难度较大，植

    株的分化率较低。早在1980，Kao[4]等就用苜蓿叶肉

    分离原生质体并诱导成苗，同时还发现苜蓿同一品种

    不同单株分离原生质体在分裂频率及胚状体形成上有

    差异。黄邵兴[5]等(1991)利用电激法将GUS基因

    直接导入紫花苜蓿根原生质体，且再生植株成功。发

    现根原生质体经电击处理对成活率影响不大，并且再

    生的频率高，因此，它是直接基因转化研究的理想材

    料。徐子勤[6]等(1997)对胭脂碱型农杆菌转化的

    苜蓿愈伤组织进行原生质体的分离培养，并发现悬浮

    培养天数、悬浮培养基激素组成和选择培养基种类明

    显影响转化频率。但由于该法培养周期较长、难度较

    大，且植株的分化率较低，使得该再生体系在苜蓿遗

    摘 要：综述苜蓿遗传转化研究中，再生体系构建及基因导入方法的研究进展。

    关键词：苜蓿；再生；遗传转化；综述

    中图分类号：S551+

    . 7 文献标识码：A 文章编号：1006 1932(2005)03 0020 04

    李进军1

    ，吴跃明1

    ，朱 诚2

    ，刘建新1

    (1. 浙江大学动物科学院，杭州 310029；2. 浙江大学生命科学院，杭州 310029)

    收稿日期： 2004-09-01

    作者简介： 李进军 (1979— ) ， 男， 山西壶关人， 硕士研究生， 主

    要研究方向为牧草生物技术育种。

    责 任 编 辑

    向

    锦

    陈

    琴

    苜蓿遗传转化的研究进展2 0 0 5 年第3 期 总第1 1 2 期

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    传转化上的研究应用较少。

    1.3 胚状体再生途径

    在组织培养离体状态条件下，任何体细胞均可诱

    导胚胎发生，经体细胞胚发生而形成的在形态结构和

    功能上类似于有性胚的结构称之为体细胞胚或胚状体。

    胚状体的诱导和发育是植物细胞全能性的最可信证明，依此建立的再生体系也是最为理想的基因转化受体系

    统。其优点是转化率高、嵌合体较少、遗传性一致。

    而且，由于胚状体具有两极性，在发育过程中可同时

    分化出芽和根，形成完整植株，从而减少了不定芽发

    育过程中较为困难的环节“生根培养” 。有关利用苜

    蓿上胚轴、叶柄、花药等外植体在MS、SH等培养基

    上分化体细胞胚并再生植株的研究报道很多。宫相忠

    [7]等(1997)利用苜蓿无菌苗的下胚轴先在含2 mgL

    2.4-D和0.5 mgL 6BA的MS培养基中诱导出愈伤组

    织，并将它转接在含3 mgLNAA和1.5 mgLKT的SH

    培养基中，三个月后形成胚性愈伤组织，最终再生出

    完整的植株。同时发现苜蓿体细胞胚的发生源于单个

    胚性细胞，它既可在愈伤组织表面，也可在愈伤组织

    内部发生。李望丰[8]等(2002)通过不同浓度的2，4-D对几个苜蓿品种进行诱导研究，筛选出对2，4-D

    敏感、 体细胞胚发生能力和分化率均较高的苜蓿品种，进一步完善了胚状体再生体系。 梁慧敏[9， 10]等 (2003)

    以5个紫花苜蓿品种的下胚轴、叶片和子叶为外植体，成功地诱导出胚性愈伤组织和胚状体， 并再生出植株。

    同时，在此基础上建立了苜蓿高频胚状体再生体系，为今后通过转基因手段改良苜蓿品种打下了基础。

    2 苜蓿遗传转化的研究进展

    目前，关于苜蓿遗传转化进展的研究不仅在其转

    化的机理、 方法和转化条件的优化等方面均取得了很大

    进展，而且还获得了一些高产、高品质、抗病、抗虫的

    转基因苜蓿品种。 苜蓿遗传转化最常用的方法有农杆菌

    介导法和基因枪法， 而其他方法如显微注射法的研究报

    道则较少。以下就这两种方法的研究概况作一阐述。

    2.1 农杆菌介导法的基本原理及其在苜蓿转基因上的

    应用

    2.1.1 基本原理及其方法：土壤农杆菌属于根瘤菌科

    (Rhizobiaceuse) ，几乎能侵染所有受伤的双子叶植物

    和少数单子叶植物，目前有两种类型的农杆菌与植物

    基因转化有关：一是根癌农杆菌(Agrobacterium tum-

    efaciens) ， 含有Ti质粒； 二是发根农杆菌 (Agrobacterium

    rhizogenes) ，含有Ri质粒。农杆菌侵染植物时，受植

    物所释放的酚类物质诱导， 活化质粒上Vir区基因的表

    达，可将质粒上的一段DNA(Transfer DNA，称为T-

    DNA)共价整合到植物的基因组上，在植物体内表达

    从而改变植物的遗传性状。因此，利用农杆菌的这一

    特性，可将外源基因和筛选标记基因构建在质粒载体

    上，借助农杆菌的侵染将外源基因导入植株体内，再

    经组织培养筛选得到再生的转化植株。利用农杆菌进

    行转基因的优点在于：可以精确地把两个边界序列之

    间的DNA片段导入植物细胞， 且导入的基因大多数情

    况下是以单拷贝形式整合到植物细胞核的基因组中；

    允许插入T-DNA中的外源DNA片段较大。 但缺点是农

    杆菌有明显的宿主局限性。

    2.1.2 在苜蓿转基因中的应用：早在1986年，Deak[11]

    等就通过农杆菌介导法成功地将nptII基因导入苜蓿 ......