连翘的组织培养和连翘苷形成的研究

    刘幼琪, 汤行春

    (湖北大学 生命科学学院 ,湖北 武汉 430062)

    [摘要] 目的:研究影响连翘愈伤组织生长和连翘苷生物合成的培养条件。 方法:选用不同的培养基和不同

    的光照条件 ,测定愈伤组织生长干重和连翘苷含量。结果和结论:连翘细胞生长周期为28 d ,采用MS基本培养基 ,附加激素为 1 mg· L - 1

    2 ,42D ,0. 5 mg· L - 1

    KT ,0. 5 mg· L - 1

    62BA ,在光照条件下可有效促进细胞生长和连翘苷的生

    物合成。

    [关键词] 连翘;愈伤组织培养;连翘苷

    [中图分类号] S 567 [文献标识码] A [文章编号] 100125302 (2003) 0420321203

    连翘作为传统中药 ,早已收入我国药典。目前

    国内外学者对连翘的化学成分及其药理活性研究较

    多 ,已分离出萜类、苷类、木脂素类、黄酮类、苯乙醇

    等化合物近百种。根据药理实验 ,从连翘中分离得

    到的苯乙醇苷类具有较强的抗菌活性 ,且对 cAMP

    磷酸二酯酶活性有很强的抑制作用。连翘在临床上

    用于治疗急性肾炎 ,紫癜病 ,肺脓肿和视网膜出血等

    症 ,有较好疗效。此外 ,连翘还有抗糖尿病和抗流感

    病毒作用。根据市场调查 ,近两年来 ,连翘的需求量

    不断上升。大量采集 ,必然破坏生态环境 ,大量种

    植 ,势必占用有限的耕地资源。因此 ,利用组织培养

    技术获得连翘次生代谢产物具有极其重要的意义。

    本研究意在探索连翘的组织培养的条件及其对连翘

    细胞中连翘苷生成的影响。

    1 材料与方法

    1. 1 培 养 材 料 连 翘 Forsythia suspensa

    ( Thunb. ) Vahl 采于湖北大学校园。由湖北大学生

    命科学学院王万贤教授鉴定。当年生茎段流水洗净

    后 ,用 0. 1 %升汞浸泡 15 min ,无菌水漂洗 5 次后 ,接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导。

    在继代培养和增殖培养中 ,得到了黄色和绿色两种

    不同的愈伤组织细胞系 ,经过检测 ,其中黄色愈伤组

    织中连翘苷含量较高 ,因此 ,以这种愈伤组织作为试

    验材料。

    [收稿日期] 2002206220

    [基金项目] 武汉市科委科技攻关项目(9920046G)

    [通讯作者] Tel : (027) 88663978

    1. 2 培养条件 在愈伤组织诱导试验中,除培养

    基种类试验外 ,所用的基本培养基均为 MS培养基。

    除植物激素浓度试验外 ,所附加的激素为 1. 0 mg·

    L - 1

    2 ,42D ,0. 5 mg· L - 1

    KT ,0. 5 mg· L - 1

    62BA ,所有

    培养基附加蔗糖3 % ,固体培养基中附加琼脂

    0. 65 % ,pH 5. 8 ,光照强度为 2 000 lx ,光周期 12 h·

    d - 1

    ,培养温度(25 ±1) ℃。

    1. 3 愈伤组织系生长的测定 以每瓶愈伤组织的

    干重表示培养过程中细胞生长的变化 ,愈伤组织的

    增长量 =收获量瓶 - 接种量瓶;愈伤组织增长指

    数 =愈伤组织增长量 × 100愈伤组织接种干重。

    1. 4 连翘苷含量测定 愈伤组织样品液的制备:

    鲜愈伤组织烘干后 ,研细、 40 目筛网过筛 ,精密称取

    粉末 ,置于 Soxhlet 提取器中 ,加入甲醇70 mL ,恒温

    水浴锅中 80 ℃热回流提取 6 h。旋转蒸发仪减压

    浓缩 ,甲醇定容 , 0. 45μm 抗有机滤膜超滤 ,制得愈

    伤组织样品液。连翘苷标准样品购于中国药品生物

    制品检定所。样品和对照品色谱图见图 1 和图 2。

    愈伤组织中连翘苷的测定用 Shimadzu LC26A

    高效液相色谱仪 ,shimadzu SPD26A 紫外检测器 ,色

    谱柱为 YWGC18柱(250 mm×4. 6 mm ,10μm) 。流

    动相为甲醇2水(45∶ 55) ,流速为 1. 0 mL· min - 1

    ,检

    测波长为2 8 0 nm 。连翘苷的特征峰保留时间为

    10. 2 min ,根据峰面积计算出连翘苷的含量 ,以每

    克愈伤组织干重所含连翘苷的毫克数表示。试验中

    各处理的生长数据为 8 个重复 ,连翘苷含量为 3 个

    重复。

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    第28 卷第4 期

    2003 年4 月 中 国 中 药 杂 志

    China Journal of Chinese Materia Medica

    Vol . 28 ,No. 4

    Apr . ,2003

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.图 1 连翘苷标准品色谱图

    1. phillyrin 图2 同

    图 2 愈伤组织样品中连翘苷色谱图

    1. 5 数据处理 各项检测数据用 MiNi2TAB 统计

    软件统计处理 ,组合间比较用 LSR 测验、 t 测验及

    相关分析 ,数据以 x ±s 表示 ......