苜蓿愈伤组织诱导及再分化研究

    王 艳1

    ,李 波2

    ,徐长绘2

    (1.齐齐哈尔市师范高等专科学校 ,齐齐哈尔 161006 ;2.齐齐哈尔大学生命科学与工程学院)

    摘要:以 MS和改良 SH 为基本培养基 ,附加不同浓度的 KT、 2 ,4 D、 6 BA ,对苜蓿的子叶、 下胚轴、 茎段进行

    愈伤组织培养 ,产生的愈伤组织接种于不同浓度的 KT、 NAA 的 SH 培养基中分化培养 ,从中筛选出最佳诱导愈伤

    组织培养基和增殖培养基。

    关键词:苜蓿;愈伤组织;诱导;再生

    苜蓿属豆科优良牧草 ,在农业种植系统中 ,苜蓿

    可以于根瘤菌共生固氮 ,改良、 肥沃土壤。畜牧业的

    持续发展对优质饲料的需求必然不断扩大 ,本文对

    苜蓿愈伤组织的诱导及再分化做深入研究 ,从而建

    立高效、 高繁和稳定的再生体系。

    1 材料与方法

    1. 1 供体材料

    以龙牧 803 苜蓿作为试材,选取饱满种子在无

    菌水中浸泡 45min ,然后用 0. 1 %氯化汞溶液消毒

    10min ,再用无菌水冲洗 4～6 次 ,接种于不含任何

    激素的 MS培养基中 ,于 28 ℃的培养箱中萌发。5d

    后,当子叶完全展开、 真叶尚未展开时,取子叶横向

    切成 3～4mm 小段 ,下胚轴切成 4～6mm 小段 ,接

    种于不同成分诱导培养基中;10d 后 ,当无菌苗长到

    4 片真叶时,取 4～6mm长的茎段 ,接种于不同成分

    诱导培养基中。温度(23 ±1) ℃,光照 12h d ,光照

    度约 2500lx。

    1. 2 试验方法

    1. 2. 1 愈伤组织的诱导

    基本培养基为 MS和改良 SH 培养基(改良 SH

    培养基的无机盐成分同于 SH 培养基 ,有机成分同

    于 MS培养基) 。蔗糖浓度 3. 0 % ,琼脂 0. 7 %,水解

    酪蛋白 250mg L ,p H 值为 5. 8 ,附加不同浓度的激

    素,见表1。

    表 1 诱导愈伤组织各培养基激素浓度 mg L

    激

    素

    MS

    M1 M2 M3 M4 M5 M6

    SH

    S1 S2 S3 S4

    1 0. 01 0. 05 0. 10 0. 50 0 0 0. 01 0. 05 0. 10 0. 50

    2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2

    3 0 0 0 0 0. 5 0. 5 0 0 0 0

    注:表中激素 1～3 分别为 KT、 2 ,4 D、 6 BA。

    收稿日期:2005 02 21

    基金项目:黑龙江省教育委员会科研计划项目

    1. 2. 2 愈伤组织的继代培养

    继代培养基成分为 MS + 2 ,4 D 1. 0mg L +

    6 BA 0. 5mg L ,水解酪蛋白 250mg L。

    1. 2. 3 愈伤组织的分化培养

    分化芽培养基为改良 SH 培养基 ,蔗糖浓度

    2 % ,琼脂 0. 7 % , 水解酪蛋白 250mg L , 肌醇

    100mg L ,附加不同浓度的激素。培养基 SH1 加入

    KT 0. 4mg L ;培养基 SH2 加入 KT 0. 1mg L、NAA 1. 0mg L ;培养基 SH3 加入 KT 0. 4mg L、NAA 1. 0mg L ;培养基 SH4 加入 KT 0. 1mg L、NAA 1. 5mg L。待出愈后 ,全部转接到含 2 ,4 D

    1mg L、 6 BA 0. 5mg L 的 MS 培养基中 ,高繁愈

    伤组织 ,达到一定数量后放入 SH 分化培养基中分

    化培养。将分化出芽的愈伤组织转入根的诱导培养

    基 ,即1 2MS附加 IAA 0. 5mg L ,蔗糖浓度2 % ,琼

    脂 0. 7 %。

    2 结果与分析

    2. 1 外植体对愈伤组织的诱导

    用上述无菌苗 5 日龄子叶、 下胚轴和 10 日龄茎

    段分别进行诱导愈伤组织试验 ,观察其生长情况 ,结

    果见表 2。

    苜蓿子叶、 下胚轴、 茎段 3 种外植体均能产生愈

    伤组织 ,且长势相似。但苜蓿的不同部位对愈伤组

    织的诱导差异很大 ,这种差异主要表现在膨大时间、启动愈伤组织时间及诱导频率上。子叶产生愈伤组

    织时间较长 ,明显膨大需 8～9d ,愈伤组织形成需 12

    ～13d ,平均诱导频率仅为 62. 7 %;而下胚轴较易产

    生愈伤组织并启动发生 ,平均诱导频率可达89. 0 %。

    由此可见 ,苜蓿不同部位诱导愈伤组织有明显差异 ,按优越性排序:下胚轴 >茎段 >子叶。

    2. 2 不同成分培养基对愈伤组织诱导频率的影响

    组织培养分化方向 ,很大程度取决于培养基的

    1 苜蓿愈伤组织诱导及再分化研究 王 艳 李 波 徐长绘

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表 2 苜蓿外植体诱导愈伤组织结果

    培养基 下胚轴

    膨大时间 d 出愈时间 d 诱导频率 %

    子 叶

    膨大时间 d 出愈时间 d 诱导频率 %

    茎 段

    膨大时间 d 出愈时间 d 诱导频率 %

    M1 4 7 80 9 13 62 5 7 74

    M2 4 5 100 9 12 64 5 6 97

    M3 5 7 75 10 13 60 6 7 70

    M4 6 8 63 11 15 51 6 8 56

    M5 3 5 82 5 8 60 4 7 79

    M6 4 7 73 7 10 54 5 8 58

    S1 3 5 100 8 11 74 3 5 96

    S2 2 4 100 7 10 79 3 4 100

    S3 3 6 100 8 11 72 4 6 93

    S4 4 6 70 9 14 59 5 6 67

    成分 ......