同时提取油茶中DNA和RNA的简便方法.PDF
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2006年2月23日
| 第1页 |
参见附件(171KB，2页)。
第 l 3卷第 3期 ： 2 3
2 0 0 3年 6月
生 物 技 术
BI OTECHNOLOCY
Vo 1 . 1 3。 No. 3： 2 3
J u n. 2 0o 3
霉素 乙酰 转移酶基 因 ， 分子 量约 3 k b， 在 遗传 重组 载体 的分 子
操作中不方便， 而且氯霉素降解困难 ， 易造成环境污染和食品 抗 生 素超 标 ， 所 以在基 因操作 中 C A T已基本不 同。
在低 盐( O. 2 t oo l 1№c 1 ) 培养基 中 ， 9 0 0 ~ g ml G 41 8在第 5 d即
表现出几乎完全的破坏功能 ， 盐藻细胞死亡并消失， 培养液变 成 无 色透明 ， 显 微镜下 只能见到极 少不 活动 的盐 藻细 胞 ， 同时
7 0 0 ~ 、 表现 明显的抑制功能 ， 培养液颜色明 显 变 浅 。第 . . 6 9 0 ~ , g ，
6
m
0 o
l G 41 8
9 d ml 表现几 乎完 全 的抑制 功 能 ， 盐藻 细胞
死亡并消失 ， 5 0 0 ~ , g m l 和 4 0 O p t m l 都表现出明显 的抑制功能，颜 色接 近无 色 透 明 。但 随 着 培 养 时 间 的 延 长 ， 更 低 浓 度 的
G 41 8没有表 现抑制盐 藻生 长 的 功能 ， 相 反 ， 可 能 由于 G 4 1 8被
分解或本身活性下降 ， 在 6 o 0 g ， l l l l 及以上浓度的盐藻培养穴
中逐渐长出了类似单藻落的藻群体。这说明， 利用 G 4 1 8作为
筛选 标记较适 合 的筛选 浓度 是 7 0 0 ~ g m l一9 0 O t i s m l ， 较 适合 的
筛选时间是转化后第 5 d至第 9 d 。目前， G 4 1 8 通常应用于转基 因哺乳动物细 胞或酵母 ， 应 用于盐藻细 胞是首次报 道 。
在未降低盐浓度， 即 1 . 5 t o o l 1 N a C 1 的液体培养基 中培养
盐藻 2 0d ， G 4 1 8和 氯霉 素 都未 表 现 抑 制功 能 。这 说 明高 N a C 1
浓度会 影响 G4 1 8和氯 霉素的活性 ， G 4 1 8或氯霉 素应 用于盐 藻
必须 降低 N a C 1 使用浓度 。
G 4 1 8和氯霉 素的实 验 结果 与 已有 的报 道 不完 全 一致 .
靠造成这 种差异 的原 因可能 有 ： 1 .由于盐 藻 在命 名 中存 在 一
些混乱 ， 盐 藻的实验材料 缺乏标 准 ， 造成 不 同实验 室 使用 的
盐藻 有差异 ， 2. 使 用 的培养 基 组成 有 差异 。在进 行 盐 藻转 基
因工作 时必须 注意。
2. 2 固体平板培 养 盐藻进行 抗 生素筛选结果
作者进行 了盐藻在含抗生素 G 4 1 8和氯霉素 的在固体低
盐平板上的生长实验。在含 1 0 0 ~ g ml 及更高浓度 G 4 1 8的固
体培养基上 ， 盐藻全部死亡， 而在含氯霉素高达 3 0 0 t ~ m l 的培
养基上第 2 5 d仍然生长良好 ， 与对照无异。这说明盐藻细胞在
固体培养基和液体培养基上的生长受抗生 素的影响不同， 液
体培养基中的抗生素筛选条件不能照搬到固体培养基中。造
成这种不同的原因还不清楚， 推测可能有 ： 1 . 盐藻本身在不同
培养 基 中生 长状况不 同 ， 2 .不 同培养 基影响盐 藻 的繁殖 方式 ，3 . 抗生素在固体培养基与液体培养基中作用效果不同。
综 上所述 ， 本实验 摸索 了不 同抗生 素在 固体 、 液 体两 种培
养基 、 两种 N a C I 浓度下 的盐藻适用的抗生素的筛选工作。含
1 . 5 mo l Na C 1的培养基不 适 于进 行抗 生 素筛 选 ； 固体平 板 尚 不
适用于盐藻筛选。在 0 . 2 m o l 1 N a C 1 的液体培养基中。 7 0 0 t t g m l
G 4 1 8 第 5 d可以将野生型盐藻杀死， 说明 C _ , 4 1 8可以作为一种 有效的抗生素筛选标记； 4 0 0 t , g m l 氯霉素在第 1 5 d才能有效杀
死盐 藻细胞 ， 作用时 间较长 。
参考文献 ：
【 1 j A a s e n A J ， E i m h j e l l e nKE， L i a e n—J e n ~n S . A n e x t r e me s c e o f 8一c a r .
o t e n e 【 J J . Ac t . Ch h n. S c a n d. ， 1 9 6 9. 2 3： 2 5 4 4—2 5 4 5.
[ 2 ] B o r o w i t x z k a L J ， B r w i t z k aM A， M o t d t o n T . Ma s s c u l t u r e o f D u n a d a： f r o m
l a b o r a t o r y t o p i l o t p l a n t [ J ] . Hy d r o b i o I o g i a ， 1 9 8 4 ， 1 1 6 1 1 7 ： 1 1 5—1 2 1 . 【 3 ] 陈峰 ， 姜悦 . 微 藻生物技术 . 第 5章 ： 李建宏 ， 曾昭琪 . 杜 氏盐藻生
物技术[ M] . 第 1版 .中国轻工业 出版社 . 1 9 9 9 . 1 4 4—1 5 0 .
【 4] Wi l b u r H C a mp b e l ， G Go w r i . Co d o n u s a g e i l I l I i g h e r p l a n t s ， e e n a l g a e ， a n d
c 【 J J. 。 ， ：一 . _
ya n oba c t er i a Pl ant Phys i o l 1 9 90 92 1 11
【 5 ] 耿德 贵 ， 王义 琴 ， 李 文彬 ， 等 . 在盐藻 中瞬时 表达 G U S基 因 [ J ] . 生
物技 术通讯 。 2 0 0 2。 2： 3 5—3 9 .
[ 6 ] 耿德 贵， 王义琴 ， 李 文彬 ， 等 .杜 氏盐 藻基 因工程 选择 标记 的研 究
【 J 】 . 生物技术 ， 2 0 0 1 ， 1 1 ( 5 ) ： 1 —3 .
同时提取油茶中 D N A和 R N A的简便方法 张智俊。 ， 谭晓风 . 陈永忠
. 。 1 1 . 宁彦林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室， 湖南 长沙4 1 2 0 0 6 ； 2 . 湖南省林科院， 湖南 长沙4 1 2 0 0 1 ) 摘要： 介绍了一种以 C T A B提取方法为基础， 结合其它 D N A和 R N A提取方法， 经反复实验建立的一种同时 取油茶 D N A和
墼筒便 莹?该方造熊有效地去除担物组织中酚类和多糖等次生物质的影响， 所得到的D N A和R N A纯度高， 完整性好， 可 以用于进一
步的如D N A分析、 m R N A的分离、 R T — P C R 、 构建c D N A文库和基因表达分析等实验。 。 。 。 。
的 C T A B法分离 D N A， 异硫氰 酸胍 一酚 一氯 仿法提 取 R N A E D T A ......
2 0 0 3年 6月
生 物 技 术
BI OTECHNOLOCY
Vo 1 . 1 3。 No. 3： 2 3
J u n. 2 0o 3
霉素 乙酰 转移酶基 因 ， 分子 量约 3 k b， 在 遗传 重组 载体 的分 子
操作中不方便， 而且氯霉素降解困难 ， 易造成环境污染和食品 抗 生 素超 标 ， 所 以在基 因操作 中 C A T已基本不 同。
在低 盐( O. 2 t oo l 1№c 1 ) 培养基 中 ， 9 0 0 ~ g ml G 41 8在第 5 d即
表现出几乎完全的破坏功能 ， 盐藻细胞死亡并消失， 培养液变 成 无 色透明 ， 显 微镜下 只能见到极 少不 活动 的盐 藻细 胞 ， 同时
7 0 0 ~ 、 表现 明显的抑制功能 ， 培养液颜色明 显 变 浅 。第 . . 6 9 0 ~ , g ，
6
m
0 o
l G 41 8
9 d ml 表现几 乎完 全 的抑制 功 能 ， 盐藻 细胞
死亡并消失 ， 5 0 0 ~ , g m l 和 4 0 O p t m l 都表现出明显 的抑制功能，颜 色接 近无 色 透 明 。但 随 着 培 养 时 间 的 延 长 ， 更 低 浓 度 的
G 41 8没有表 现抑制盐 藻生 长 的 功能 ， 相 反 ， 可 能 由于 G 4 1 8被
分解或本身活性下降 ， 在 6 o 0 g ， l l l l 及以上浓度的盐藻培养穴
中逐渐长出了类似单藻落的藻群体。这说明， 利用 G 4 1 8作为
筛选 标记较适 合 的筛选 浓度 是 7 0 0 ~ g m l一9 0 O t i s m l ， 较 适合 的
筛选时间是转化后第 5 d至第 9 d 。目前， G 4 1 8 通常应用于转基 因哺乳动物细 胞或酵母 ， 应 用于盐藻细 胞是首次报 道 。
在未降低盐浓度， 即 1 . 5 t o o l 1 N a C 1 的液体培养基 中培养
盐藻 2 0d ， G 4 1 8和 氯霉 素 都未 表 现 抑 制功 能 。这 说 明高 N a C 1
浓度会 影响 G4 1 8和氯 霉素的活性 ， G 4 1 8或氯霉 素应 用于盐 藻
必须 降低 N a C 1 使用浓度 。
G 4 1 8和氯霉 素的实 验 结果 与 已有 的报 道 不完 全 一致 .
靠造成这 种差异 的原 因可能 有 ： 1 .由于盐 藻 在命 名 中存 在 一
些混乱 ， 盐 藻的实验材料 缺乏标 准 ， 造成 不 同实验 室 使用 的
盐藻 有差异 ， 2. 使 用 的培养 基 组成 有 差异 。在进 行 盐 藻转 基
因工作 时必须 注意。
2. 2 固体平板培 养 盐藻进行 抗 生素筛选结果
作者进行 了盐藻在含抗生素 G 4 1 8和氯霉素 的在固体低
盐平板上的生长实验。在含 1 0 0 ~ g ml 及更高浓度 G 4 1 8的固
体培养基上 ， 盐藻全部死亡， 而在含氯霉素高达 3 0 0 t ~ m l 的培
养基上第 2 5 d仍然生长良好 ， 与对照无异。这说明盐藻细胞在
固体培养基和液体培养基上的生长受抗生 素的影响不同， 液
体培养基中的抗生素筛选条件不能照搬到固体培养基中。造
成这种不同的原因还不清楚， 推测可能有 ： 1 . 盐藻本身在不同
培养 基 中生 长状况不 同 ， 2 .不 同培养 基影响盐 藻 的繁殖 方式 ，3 . 抗生素在固体培养基与液体培养基中作用效果不同。
综 上所述 ， 本实验 摸索 了不 同抗生 素在 固体 、 液 体两 种培
养基 、 两种 N a C I 浓度下 的盐藻适用的抗生素的筛选工作。含
1 . 5 mo l Na C 1的培养基不 适 于进 行抗 生 素筛 选 ； 固体平 板 尚 不
适用于盐藻筛选。在 0 . 2 m o l 1 N a C 1 的液体培养基中。 7 0 0 t t g m l
G 4 1 8 第 5 d可以将野生型盐藻杀死， 说明 C _ , 4 1 8可以作为一种 有效的抗生素筛选标记； 4 0 0 t , g m l 氯霉素在第 1 5 d才能有效杀
死盐 藻细胞 ， 作用时 间较长 。
参考文献 ：
【 1 j A a s e n A J ， E i m h j e l l e nKE， L i a e n—J e n ~n S . A n e x t r e me s c e o f 8一c a r .
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[ 2 ] B o r o w i t x z k a L J ， B r w i t z k aM A， M o t d t o n T . Ma s s c u l t u r e o f D u n a d a： f r o m
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物技术[ M] . 第 1版 .中国轻工业 出版社 . 1 9 9 9 . 1 4 4—1 5 0 .
【 4] Wi l b u r H C a mp b e l ， G Go w r i . Co d o n u s a g e i l I l I i g h e r p l a n t s ， e e n a l g a e ， a n d
c 【 J J. 。 ， ：一 . _
ya n oba c t er i a Pl ant Phys i o l 1 9 90 92 1 11
【 5 ] 耿德 贵 ， 王义 琴 ， 李 文彬 ， 等 . 在盐藻 中瞬时 表达 G U S基 因 [ J ] . 生
物技 术通讯 。 2 0 0 2。 2： 3 5—3 9 .
[ 6 ] 耿德 贵， 王义琴 ， 李 文彬 ， 等 .杜 氏盐 藻基 因工程 选择 标记 的研 究
【 J 】 . 生物技术 ， 2 0 0 1 ， 1 1 ( 5 ) ： 1 —3 .
同时提取油茶中 D N A和 R N A的简便方法 张智俊。 ， 谭晓风 . 陈永忠
. 。 1 1 . 宁彦林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室， 湖南 长沙4 1 2 0 0 6 ； 2 . 湖南省林科院， 湖南 长沙4 1 2 0 0 1 ) 摘要： 介绍了一种以 C T A B提取方法为基础， 结合其它 D N A和 R N A提取方法， 经反复实验建立的一种同时 取油茶 D N A和
墼筒便 莹?该方造熊有效地去除担物组织中酚类和多糖等次生物质的影响， 所得到的D N A和R N A纯度高， 完整性好， 可 以用于进一
步的如D N A分析、 m R N A的分离、 R T — P C R 、 构建c D N A文库和基因表达分析等实验。 。 。 。 。
的 C T A B法分离 D N A， 异硫氰 酸胍 一酚 一氯 仿法提 取 R N A E D T A ......
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