用农杆菌 Ri诱导蒙古黄芪发根培养的研究X

    李雅丽1

    , 张 凯2

    (1 内蒙古科技大学生命科学学院, 内蒙古 包头 014010 ; 2 内蒙古科技大学能源

    与环境学院, 内蒙古 包头 014010)

    摘要: 用蒙古黄芪 ( Astragalus membranaceus Bunge var1mongolicus (Bunge) Hsiao) 无菌籽苗的

    不同部位作为外植体 , 用发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) R1601进行感染 , 该品系对不

    同外植体诱导毛状根的能力是不同的。由下胚轴成功的诱导出毛状根。在附加 100μmol L 乙

    酰丁香酮 (acetosyringone) 、013 mg L IBA的条件下 , 诱导率达 4212 %。用硅胶薄层层析法检

    测到毛状根中含有冠瘿碱 , 用硅胶薄层扫描法 (TLCS) 测定了蒙古黄芪野生根、栽培根及毛

    状根中的黄芪甲甙 ( astragaloside IV) 含量 , (用黄芪甲甙标准品作对照) , 它们分别为

    012654 % (DW) , 012071 % (DW) 和012535 % (DW) 。

    关键词: 蒙古黄芪; 发根农杆菌; Ri 质粒; 毛状根

    中图分类号: Q 945 文献标识码: A 文章编号: 0253 - 2700(2005) 02 - 0204 - 07

    Studies on the Hairy Root of Astragalus membranaceus

    var1mongolicus Induced by Agrobacterium

    rhizogenes R1601

    LI Ya2 Li

    1

    , ZHANG Kai

    2

    (1 Institute of Life Science , Inner Mongolia University of Science and Technology , Baotou 014010 , China ;

    2 Institute of Energy and Environment , Inner Mongolia University of Science and Technology , Baotou 014010 ; China)

    Abstract : The pieces of sterile seeding of Astragalus membranaceus Bunge var1mongolicus (Bunge) Hsiao

    were infected with Agrobacterium rhizogenes strains R1601. This strain showed different abilities to induce

    hairy roots on the different explants. The hypocotyls were succeeded in inducing the hairy roots. At

    adding acetosyringone (100μg L) and IBA (013 mg L) , The rate of inducing hairy roots was 42 , 2

    percent . The transformed root cultures were assayed for opines by TLC , and were positive for opines. The

    content of . Astragaloside IV in the root of wild plant , cultivated plant and hairy root were examined by

    TCLS controlled with standard. Astragaloside IV. their content were 0 12654 % (DW) , 012071 %

    (DW) and 012535 % (DW) respectively.

    Key words : Astragalus membranaceus var1mongolicus ; Agrobacterium rhizogenes ; Ri plasmid ; Hairy root

    发根农杆菌 ( Agrobacterium rhizogenes) 对植物的侵染是自然界中天然的遗传转化模式。

    云 南 植 物 研 究 2005 , 27 (2) : 204～210

    Acta Botanica Yunnanica

    X 收稿日期: 2004 - 06 - 04 , 2005 - 01 - 24接受发表

    作者简介: 李雅丽 (1976 - ) 女, 硕士, 讲师, 主要从事植物生理与分子生物学研究。

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.它通过所含有的致根质粒 (Ri) 的一部分 (T 2DNA) 在植物基因组中的整合和表达 , 导致

    毛状根的产生。近30年来 , 随着对 Ri 质粒分子生物学研究的不断深入 , 农杆菌质粒的应

    用研究也成为世界范围内的热点研究 , 显示出极大的应用潜力和广泛的发展前景 (周延清

    等 , 1996) 。

    黄芪是豆科多年生草本植物 , 其根为重要的中药材。目前我国可供药用的黄芪品种很

    多 , 但主要以膜荚黄芪和蒙古黄芪为主。药理研究证明黄芪有多方面的药理作用。我国黄

    芪野生资源的蕴藏量为416 × 107

    kg而每年的需求量为 6 ×106

    kg。像其它一些珍惜濒危药

    用植物一样 , 黄芪的野生资源逐年减少 , 用发根农杆菌 Ri 质粒诱导蒙古黄芪建立发根培

    养的无性繁殖体系 , 可以为资源的开发利用研究提供一条可行的新途径。

    本实验通过用发根农杆菌 R1601侵染蒙古黄芪子叶、叶片、下胚轴、根段等外植体进

    行了诱导 , 结果由下胚轴成功的诱导出了毛状根 , 除菌后进行离体培养建立了发根培养

    系。鉴定发根农杆菌 Ri 质粒的 T 2DNA是否整合到宿主植物细胞基因组DNA中并稳定表达

    采用硅胶薄层层析法 (刘树楠等 , 1993 ; Tanaka , 1985) 同时提取离体培养的毛状根中黄

    芪甲甙 (王关林和方宏筠 , 2002) , 用薄层扫描法比较其与野生蒙古黄芪根 , 栽培黄芪根

    中黄芪甲甙的含量。

    1 材料与方法

    111 材料

    11111 供试植物材料

    种子为1993年采的栽培蒙古黄芪 (Astragalus membranaceus Bunge var1mongolicus (Bunge) Hsiao) 种子 ,由内蒙古农科院提供 , 野生蒙古黄芪根由内蒙古大学生物系吴庆茹教授提供。

    11112 供试菌种

    发根农杆菌 ( Agrobacterium rhizogenes) R1601由北京大学生命科学学院林忠平教授赠送。

    11113 试剂与仪器

    乙酰丁香酮 (AS) 、头孢噻肟钠 (Cef) 、卡那霉素均购自北京鼎国生物工程公司 , 植物组织培养试剂

    均为国产分析纯试剂。薄层扫描仪器采用岛津 CS 2930双波长型扫描仪 , SPU21型自动喷雾器 (日本) , 黄

    芪甲甙标准品由内蒙古药品检验所提供。

    112 方法

    11211 无菌苗的获得

    蒙古黄芪的种子在70 %乙醇中浸泡 1 min , 用无菌水冲洗 2 次 , 然后用 011 %升汞进行表面消毒 10

    min后 , 用无菌水浸洗5次 , 每次5 min ......