外部因子条件对麻黄细胞悬浮培养的影响.PDF
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2006年2月23日
第1页 |
参见附件(125KB,3页)。
外部因子条件对麻黄细胞悬浮培养的影响3
X
高晓原 曹有龙
(宁夏农业生物技术重点实验室 ,750002 ,银川)
摘 要 用中麻黄种子萌发的子叶诱导出愈伤组织 ,并在不同的培养基、不同的激素及不同的
pH值和不同的蔗糖浓度条件下培养 ,探讨麻黄离体细胞生长的适宜条件。实验证明以MS + 2 ,4 -
Dlmg L + NAA2mg L 培养基较好 ,愈伤组织色泽正常 ,生长量高。悬浮培养 pH值在 3 - 9 均能生
长 ,但以pH7 - 8最适 ,其细胞增殖量增加8 - 9倍;其含糖量在30g L 较适宜。
关键词 麻黄 ,愈伤组织;悬浮培养;条件
中图分类号 Q949· 672
麻黄是我国西北地区荒漠草原的一种野生药用
植物 ,其形态与结构特殊 ,茎中含有多种麻黄碱 ,具
有消炎、活血、宣肺平喘之功效。近年来人们进行大
面积人工种植 ,扩大此资源已取得可喜成果 ,但从种
植收获到加工成纯品 ,具有周期长、成本高的缺点。
为此我们试图利用生物技术手段 ,采用麻黄外植体
诱导愈伤组织 ,再用愈伤组织细胞进行液体悬浮培
养 ,从中获得药用次生代谢产物麻黄碱及有效成分 ,达到室内人工生产麻黄碱的目的。现将这一研究初
报如下:
1 材料及方法
1. 1 材料
中麻黄种子 ( Ephedra intermedia Schrenket ex
Mey) ,取自内蒙鄂托克前旗。
1. 2 方法
种子经水多次冲洗后 ,用 75 %酒精表面消毒
1min ,弃去。再用0. 1 %升汞表面消毒 7min ,用无菌
水冲洗3次 ,备用。将 100g细沙装入 100ml 三角瓶
中 ,加水使沙全部湿润 ,封口在 120 ℃条件下灭菌
20min ,冷却后在无菌条件下用小镊将消毒种子放入
瓶中的沙面上 ,每瓶10粒 ,封口。在26 ℃,光照周期
10h d条件下培养。
1. 2. 1 愈伤组织的诱导
种子沙培萌发后 ,子叶长出1 - 2d内 ,在无菌条
件下将子叶剪成 0. 5cm的小段 ,作为诱导愈伤组织
的材料 ,接入附加不同激素的 MS、 N6、 B5、 white 培养
基中 ,在26 ℃光照周期10h d条件下培养 ,约30d后
根据愈伤组织诱导率 ,愈伤组织大小、色泽等 ,确定
较理想的激素组合和培养基。
1. 2. 2 不同蔗糖浓度麻黄细胞悬浮培养
以去除蔗糖和琼脂的 MS + 2. 4 - Dlmg L +
NAA2mgL 为基本培养液 ,供设 5 个处理 ,即每升培
养液中加蔗糖 0、 10、 15、 30、 50g (g L) ,每个处理 5
瓶 ,每瓶80ml 培养液 ,装于 250ml 三角瓶中 ,灭菌。
培养材料选用生长 25d 松脆型愈伤组织 ,每瓶接入
2~3g (干重 0. 1g) ,稍加压碎倒入瓶中。在 26 ℃,转
速为100r min条件下振荡培养。20d 后分别过滤收
集培养物 ,80℃条件下烘干 ,称重。每瓶增加的干重
表示细胞生长量。
1. 2. 3 不同pH条件下细胞悬浮培养
以MS + 2. 4 - Dlmg L + NAA2mg L (不加琼脂)
为培养液。共设 8 个处理 ,即:pH 2、 3. 5、 4. 5、 5. 5、6. 5、 7. 5、 8. 5、 9. 5。每处理 5 瓶。其详细的操作、培
养方法与以上不同含糖量悬浮培养方法相同。
2 结果与分析
2. 1 愈伤组织的诱导
见表1。我们选用这四种常用培养基进行愈伤
组织诱导比较实验 ,结果表明它们具有明显的不同。
第22卷 第3期
2001年 宁 夏 农 学 院 学 报
Journal of Ningxia Agricultural College
Vol . 22 No. 3
2001
X 宁夏自然科学基金
收稿日期:2001 - 05 - 29
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.white 均能诱导出愈伤组织 ,但诱导率低 ,愈伤组织
长势弱 ,约 7 天后逐渐变为黄褐色 ,直径在 0. 5~
0. 7cm不再增大 ,三个激素组合基本一致。在 N6 与
B5 中没有任何愈伤组织产生 ,接入的外植体全部变
褐死亡。而在 MS中愈伤组织诱导率高 ,愈伤组织
长势好 ,在 2. 4 - D 浓度不变的情况下 ,适当调整
NAA用量使愈伤组织型态疏松 ,随NAA用量的增加
愈伤组织诱导率明显提高 ,色泽由浅变深。因此以
2. 4 - Dlmg L + NAA2mg L 相组合愈伤组织无论在
生长速度、愈伤组织大小、色泽显然优于其它 2 种 ,结构疏松 ,适合于悬浮培养。
表1 30d后各培养基中愈伤组织诱导率及生长状况
培养基 激素组合(mg L) 诱导率% 愈伤组织生长状况
2. 4 - Dl + NAA 0. 5 60 谈绿色 疏松 生长较慢
MS 2. 4 - Dl + NAA1 65 淡绿色 疏松 生长慢
2. 4 - D1 + NAA2 80 绿色 疏松 生长快
2. 4 - Dl + NAA0. 5 10 淡褐色 松软 生长很慢
White 2. 4 - Dl + NAA1 10 淡褐色 松软 生长很慢
2. 4 - Dl + NAA2 50 初期淡绿色后期变褐 疏松 生长慢
2. 4 - Dl + NAA0. 5 0 无
N6 2. 4 - Dl + NAA1 0 无
2. 4 - Dl + NAA2 0 无
2. 4 - Dl + NAA0. 5 0 无
B5 2. 4 - Dl + NAA1 0 无
2. 4 - Dl + NAA2 0 无
2. 2 不同蔗糖浓度对麻黄细胞悬浮培养的影响
从表2看出不同蔗糖用量对麻黄细胞悬浮培养
的影响:MS培养基对麻黄细胞培养是较适宜的 ......
X
高晓原 曹有龙
(宁夏农业生物技术重点实验室 ,750002 ,银川)
摘 要 用中麻黄种子萌发的子叶诱导出愈伤组织 ,并在不同的培养基、不同的激素及不同的
pH值和不同的蔗糖浓度条件下培养 ,探讨麻黄离体细胞生长的适宜条件。实验证明以MS + 2 ,4 -
Dlmg L + NAA2mg L 培养基较好 ,愈伤组织色泽正常 ,生长量高。悬浮培养 pH值在 3 - 9 均能生
长 ,但以pH7 - 8最适 ,其细胞增殖量增加8 - 9倍;其含糖量在30g L 较适宜。
关键词 麻黄 ,愈伤组织;悬浮培养;条件
中图分类号 Q949· 672
麻黄是我国西北地区荒漠草原的一种野生药用
植物 ,其形态与结构特殊 ,茎中含有多种麻黄碱 ,具
有消炎、活血、宣肺平喘之功效。近年来人们进行大
面积人工种植 ,扩大此资源已取得可喜成果 ,但从种
植收获到加工成纯品 ,具有周期长、成本高的缺点。
为此我们试图利用生物技术手段 ,采用麻黄外植体
诱导愈伤组织 ,再用愈伤组织细胞进行液体悬浮培
养 ,从中获得药用次生代谢产物麻黄碱及有效成分 ,达到室内人工生产麻黄碱的目的。现将这一研究初
报如下:
1 材料及方法
1. 1 材料
中麻黄种子 ( Ephedra intermedia Schrenket ex
Mey) ,取自内蒙鄂托克前旗。
1. 2 方法
种子经水多次冲洗后 ,用 75 %酒精表面消毒
1min ,弃去。再用0. 1 %升汞表面消毒 7min ,用无菌
水冲洗3次 ,备用。将 100g细沙装入 100ml 三角瓶
中 ,加水使沙全部湿润 ,封口在 120 ℃条件下灭菌
20min ,冷却后在无菌条件下用小镊将消毒种子放入
瓶中的沙面上 ,每瓶10粒 ,封口。在26 ℃,光照周期
10h d条件下培养。
1. 2. 1 愈伤组织的诱导
种子沙培萌发后 ,子叶长出1 - 2d内 ,在无菌条
件下将子叶剪成 0. 5cm的小段 ,作为诱导愈伤组织
的材料 ,接入附加不同激素的 MS、 N6、 B5、 white 培养
基中 ,在26 ℃光照周期10h d条件下培养 ,约30d后
根据愈伤组织诱导率 ,愈伤组织大小、色泽等 ,确定
较理想的激素组合和培养基。
1. 2. 2 不同蔗糖浓度麻黄细胞悬浮培养
以去除蔗糖和琼脂的 MS + 2. 4 - Dlmg L +
NAA2mgL 为基本培养液 ,供设 5 个处理 ,即每升培
养液中加蔗糖 0、 10、 15、 30、 50g (g L) ,每个处理 5
瓶 ,每瓶80ml 培养液 ,装于 250ml 三角瓶中 ,灭菌。
培养材料选用生长 25d 松脆型愈伤组织 ,每瓶接入
2~3g (干重 0. 1g) ,稍加压碎倒入瓶中。在 26 ℃,转
速为100r min条件下振荡培养。20d 后分别过滤收
集培养物 ,80℃条件下烘干 ,称重。每瓶增加的干重
表示细胞生长量。
1. 2. 3 不同pH条件下细胞悬浮培养
以MS + 2. 4 - Dlmg L + NAA2mg L (不加琼脂)
为培养液。共设 8 个处理 ,即:pH 2、 3. 5、 4. 5、 5. 5、6. 5、 7. 5、 8. 5、 9. 5。每处理 5 瓶。其详细的操作、培
养方法与以上不同含糖量悬浮培养方法相同。
2 结果与分析
2. 1 愈伤组织的诱导
见表1。我们选用这四种常用培养基进行愈伤
组织诱导比较实验 ,结果表明它们具有明显的不同。
第22卷 第3期
2001年 宁 夏 农 学 院 学 报
Journal of Ningxia Agricultural College
Vol . 22 No. 3
2001
X 宁夏自然科学基金
收稿日期:2001 - 05 - 29
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.white 均能诱导出愈伤组织 ,但诱导率低 ,愈伤组织
长势弱 ,约 7 天后逐渐变为黄褐色 ,直径在 0. 5~
0. 7cm不再增大 ,三个激素组合基本一致。在 N6 与
B5 中没有任何愈伤组织产生 ,接入的外植体全部变
褐死亡。而在 MS中愈伤组织诱导率高 ,愈伤组织
长势好 ,在 2. 4 - D 浓度不变的情况下 ,适当调整
NAA用量使愈伤组织型态疏松 ,随NAA用量的增加
愈伤组织诱导率明显提高 ,色泽由浅变深。因此以
2. 4 - Dlmg L + NAA2mg L 相组合愈伤组织无论在
生长速度、愈伤组织大小、色泽显然优于其它 2 种 ,结构疏松 ,适合于悬浮培养。
表1 30d后各培养基中愈伤组织诱导率及生长状况
培养基 激素组合(mg L) 诱导率% 愈伤组织生长状况
2. 4 - Dl + NAA 0. 5 60 谈绿色 疏松 生长较慢
MS 2. 4 - Dl + NAA1 65 淡绿色 疏松 生长慢
2. 4 - D1 + NAA2 80 绿色 疏松 生长快
2. 4 - Dl + NAA0. 5 10 淡褐色 松软 生长很慢
White 2. 4 - Dl + NAA1 10 淡褐色 松软 生长很慢
2. 4 - Dl + NAA2 50 初期淡绿色后期变褐 疏松 生长慢
2. 4 - Dl + NAA0. 5 0 无
N6 2. 4 - Dl + NAA1 0 无
2. 4 - Dl + NAA2 0 无
2. 4 - Dl + NAA0. 5 0 无
B5 2. 4 - Dl + NAA1 0 无
2. 4 - Dl + NAA2 0 无
2. 2 不同蔗糖浓度对麻黄细胞悬浮培养的影响
从表2看出不同蔗糖用量对麻黄细胞悬浮培养
的影响:MS培养基对麻黄细胞培养是较适宜的 ......
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