用 RAPD技术对人参栽培群体的遗传分析

    邵爱娟1

    , 李 欣1

    , 黄璐琦1 3

    , 魏建和2

    , 林淑芳1

    (11中国中医研究院 中药研究所 ,北京 100700 ;

    21中国医学科学院 协和医科大学 药用植物研究所 ,北京 100094)

    [摘要] 目的:通过对栽培人参不同品系之间的遗传多样性进行研究 ,为人参品种选育提供参考。方法:采用

    SPSS 1010软件计算Dice遗传相似性系数 ,Between 2groups linkage方法聚类 ,构建亲缘关系系统图。结果:共筛选出

    18个10 碱基随机引物用于 PCR扩增 ,17个供试样品共获得145条扩增片段 ,其中有53条是多态的 ,占 3615 %。聚

    类分析结果表明:大马牙类型内各品系间的亲缘关系近于与二马牙类型各品系样品间的亲缘关系 ,从分子水平证

    明了根据表征性状对栽培类群进行划分是可行的。结论:RAPD对人参新品种培育进行辅助选择是一种良好的分

    子标记。

    [关键词] RAPD;人参;选育

    [中图分类号] S 567 [文献标识码] A [文章编号] 100125302 (2004) 1121033204

    [收稿日期] 2004202210

    [基金项目] 国家自然科学基金重点项目(39930220) ;国经贸

    厅行业[2003 ]22号

    [通讯作者] 3

    黄璐琦, Tel : ( 010) 6401441122955 , Fax : ( 010)

    84044340 ,E 2mail :huangluqi @2631net

    人参 Panax ginseng C1A1Mey1 是我国常用的珍

    贵药材 ,主产于中国的长白山、大小兴安岭、完达山

    脉 ,此外 ,俄罗斯、朝鲜和日本也有少量出产。人参

    在我国栽培历史悠久 ,早在清代就进行了大规模种

    植[1 ]

    ,经过千百年来的自然变异和人工选择 ,人参栽

    培群体内已形成一些变异类型 ,如大马牙、二马牙、长脖和圆膀圆芦等 ,由于各种变异类型在栽培区内

    都是混杂分布的 ,而使其育种工作进展缓慢。因此 ,越来越多的学者开展了人参种质资源亲缘关系和鉴

    定等方面的研究工作 ,马小军等应用RAPD ,AFLP方

    法对野山参与栽培参 ,栽培参不同栽培群体、不同农

    家类型间的遗传关系作了系统的研究[226 ]

    ,丁建弥等

    用 RAPD方法找出了野山参的特异条带等[7 ]。然而

    这些研究仅局限于野生人参、栽培人参不同农家类

    型材料 ,对于人参育种的基础材料 ———品系间的遗

    传多样性研究较少。大马牙和二马牙是人参培育新

    品种较主要的农家类型 ,由其所培育出的人参品质

    好、产量高、抗病性强 ,在生产上越来越被人们广泛

    采用。因此 ,本研究主要选用这 2 个农家类型的材

    料 ,试图利用 RAPD 技术对不同品系的人参种质资

    源进行研究 ,从分子水平分析其遗传特异性和亲缘

    关系 ,以期为人参的标记辅助选择(MAS)和分子标

    记辅助育种(MAB)提供一定的参考。

    1 仪器与试剂

    111 仪器

    DYY- Ш 5型电泳仪(北京市六一仪器厂) ;Micro

    - MB 3616型高速离心机(iec 公司,美国) ;PTC - 100

    Programmablethermalcontroller (MJresearch , Inc1 ,美国) ;

    冷冻离心机(Eppendoff ,德国) ;SYNGENE - GeneGenius

    凝胶紫外成像系统;微量移液枪( Eppendorf :1～20 ,10～100 ,100～1 000 ,1 000～5 000μ L ,英国) ; Gene

    Quant ПRNA DNACalculator (Pharmacia Bioteeh ,英国) ;

    高压灭菌锅 (TOMY KOGYO CO1LTD1 , 日本) ; 枪头

    (1 000 ,100 ,10μ L 购置华美生物工程公司) ;Eppendoff

    管(1 500 ,500 ,200μ L 购自华美生物工程公司) 。

    112 试剂

    Taq 酶(华美公司) ;CTAB (Sigma 公司) ;琼脂糖

    (华美公司) ;溴化乙锭(Fluka 公司) ; dNTPs (华美公

    司) ;s系列 10mer 随机引物(Sangon 公司) ;其余试剂

    为北京化工厂生产的分析纯。

    2 材料与方法

    211 材料

    人参样品是经过5代系统选育出的优良品系,于

    2002年9月采自吉林省集安市国营一参场,由中国医

    学科学院协和医科大学药用植物研究所魏建和博士

    鉴定为人参 P1 ginseng 的新鲜叶片,清净后硅胶迅速

    · 3301 ·

    第29卷第11期

    2004年11月 中 国 中 药 杂 志

    China Journal of Chinese Materia Medica

    Vol129 ,Issue 11

    November ,2004

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.干燥,具体情况见表1。

    表1 供试样品情况

    编号 品系号 农家类型 生长年限年

    1 29 二马牙 5

    2 33 二马牙 5

    3 69 二马牙 5

    4 104 二马牙 5

    5 121 二马牙 5

    6 196 二马牙 5

    7 357 二马牙 5

    8 413 二马牙 5

    9 117 二马牙 5

    10 100 二马牙 5

    11 82 大马牙 5

    12 108 大马牙 5

    13 74 大马牙 5

    14 59 二马牙 5

    15 119 二马牙 5

    16 31 二马牙 7

    17 HG 二马牙 7

    212 方法

    21211 DNA 的提取 取硅胶干燥后的叶片少许,置

    115 mLEp 管中,用CTAB 法[8]

    提取DNA ,加适量 TE溶

    解后,用含015μg· mL - 1

    溴化乙锭的018 %琼脂糖凝胶

    电泳检测,与Lambda DNA marker对照估测DNA片段

    的浓度。

    21212 PCR反应 采用180个10碱基随机引物对材

    料进行扩增筛选,从中筛选出条带信号强、重现性和

    特征性好的引物用于实验和统计分析。反应总体积

    为25μ L ,其中模板015μ L (20～50 ng) ,引物015μ L (10

    μmol· L - 1) ,Taq 酶015μ L (3U) ,dNTPs115μ L (每种215

    mmol· L - 1) ,MgCl2 115μ L (25 mmol· L - 1) ,10 ×Reaction

    Buffer 215μ L (500 mmol· L - 1

    KCl ,100 mmol· L - 1

    Tris2

    HCl pH 910 ,110 Triton X 2100) ,高纯水18μ L。每个引

    物均设一个空白对照,以排除系统误差。扩增前在96

    ℃预变性5 min ,每循环在94 ℃变性45 s ,34 ℃退火1

    min ,72 ℃延伸 115 min ,共40 个循环,后 72 ℃延伸 5

    min ......