紫草组织培养研究概况.PDF
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2006年2月23日
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参见附件(78KB，4页)。
紫草组织培养研究概况 吉文亮 秦民坚 王峥涛 余国奠
(中国药科大学 南京 210038)
摘要 本文简要综述硬紫草、滇紫草和新疆紫草在利用愈伤组织培养、细胞悬浮培养和固定化培养生产紫草
及其衍生物方面的研究进展。
关键词 硬紫草;滇紫草;新疆紫草;组织培养
紫草为紫草科植物新疆紫草 Arnebia euchroma (Royle)Johnst、紫草 Lithospermum erythrorhizon Sieb.
et Zucc.或内蒙紫草 A. guttata Bunge 的干燥根。为常用中药材 ,新疆紫草又称软紫草 ,主产新疆、西
藏等地;紫草又称硬紫草 ,主产黑龙江、吉林、辽宁、河北、湖南等地;内蒙紫草主产内蒙等地。另外 ,在四川、云南、贵州等地 ,用同科植物滇紫草 Onosma paniculatum Bur. et Fr.的根作紫草使用。其主
要成分紫草宁(shikonin)及其衍生物为萘醌类化合物 ,具抗肿瘤、抗炎和抗菌活性 ,还有抗肝脏氧化
损伤和抗受孕作用[1 ]。紫草又是日化用品原料 ,日本已成功地以其中的色素研制开发出天然色素
口红 ,因其不含人工色素 ,上市之初就深受消费者欢迎[2 ]。由于紫草独特的药用价值 ,同时又是天
然名贵染料的来源 ,而其原植物资源严重缺乏。为解决这一矛盾 ,生物学家们试图通过组织培养法
得到紫草宁及其衍生物。日本学者 Tabata 等[3 ]
最先成功诱导了硬紫草愈伤组织 ,并生产出紫草宁
及其衍生物。随后许多国内外学者为提高紫草宁产量了大量的研究。随着研究的深入 ,用组织培
养法得到的紫草宁及其衍生物产量高、成本低 ,能大量满足市场需要。
我国学者于二十世纪八十年代后期着手进行紫草组织培养 ,樊红霞等[4 ]
成功地诱导了滇紫草
愈伤组织。之后国内关于紫草培养的研究报道越来越多 ,当前有关紫草的组织培养研究主要集中
在硬紫草、新疆紫草及滇紫草方面。现将国内有关紫草组织培养方面的报道作一简要综述。
1 硬紫草的组织培养
1974年 Tabata 等[3 ]
首先成功诱导了硬紫草愈伤组织 ,并得到紫草宁及其衍生物 ,其产生受生
长素及光控制。光 ,尤其是蓝光抑制紫草宁及其衍生物的合成。在培养过程中 ,当用 2 ,4 - 二氯苯
氧乙酸(2 ,4 - D)代替吲哚乙酸( IAA) ,色素含量显著减少。罗雪梅等[5 ]
比较了细胞培养获得的紫
草宁衍生物与从紫草根中提取得到的紫草宁衍生物 ,经 TLC和 RPHPLC鉴别 ,两者基本相似 ,且在
耐热和抗氧化方面无差别 ,色素颜色也不随pH值变化而改变。但从细胞培养中形成的色素颜色
在Na2SO3 存在下较从根中提取得到的色素不稳定。
宁文等[6 ]
采用二阶段培养法(two - stage culture) 。第一阶段为愈伤组织继代培养 ,在B5 基本培
养基中添加 IAA 0. 025mg L ,6 - 苄基氨基嘌呤(6 - BAP) 1. 0mg L ,光培养 ,光照时间 6～8 天。第二
阶段为细胞悬浮培养形成紫草宁及其衍生物 ,M9 基本培养基改加 IAA 0. 1mg L ,6 - BAP 1. 0mg L ,Ca (NO3) 2· 4H2O 347mg L ,CuCl2· H2O 6. 0mg L ,悬浮细胞置于暗室培养。发现紫草宁及其衍生物的
形成与细胞生长呈负相关 ,细胞生长缓慢则有利于紫草宁及其衍生物的形成 ,20 天后紫草宁及其
9 紫草组织培养研究概况
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.衍生物含量达到最高水平。pH值最适范围在 5. 0～7. 0 之间 ,还比较了悬浮培养细胞在不同时期
对可溶性糖、溶氧和无机元素需求变化。罗雪梅等[5 ]
认为在悬浮培养细胞中 ,加入 R - A树脂可提
高色素提取率。
刘培等[7 ]
对硬紫草细胞系AR126继代培养6年 ,并用小细胞团块法反复筛选 ,如不进行筛选 ,则紫草宁及其衍生物含量迅速降低。细胞系 AR126 酶解分离得到原生质体。只有用葡萄糖作渗
透剂经琼脂糖 - 液体双层培养才能获得可见的原生质体克隆 ,形成愈伤组织。而琼脂岛和琼脂糖
平板法则不能形成愈伤组织。从克隆体中选择 34 个克隆 ,用两阶段培养法生产紫草宁及其衍生
物。发现其中最好的原生质体克隆色素产量是起始悬浮培养的2. 54倍 ,经培养40天达到0. 6mg g
鲜重(FW) ,而且其产量在80天内无明显下降。
紫草细胞合成的色素主要存在于细胞内 ,同时有部分外泌到细胞外 ,约占总量的 30 % ,只有外
泌的色素可以收集利用。为增加紫草色素外泌量 ,吕华等[8 ]
采用固定化培养法 ,以B5 培养基为基
本培养基 ,固定化培养的细胞生长缓慢 ,第30天时的相对生长量为70 % ,仅为琼脂培养基上生长的
愈伤组织的1 6 ,但细胞能保持分裂达50天。色素产量达到4. 2mg g FW,相对色素外泌量达70 % ,而悬浮培养细胞仅有30 %。可见固定化细胞具有较强外泌能力。随着细胞内色素积累产生反馈
抑制作用 ,不利于固定化培养的连续进行。因此有必要采用促进产物释放的技术 ,研究表明:以正
十六烷处理固定化细胞 ,可促进产物释放 ,连续培养的固定细胞保持其色素形成能力达 80 天之久 ,色素总产量达20mg g FW,高于悬浮细胞。这与国外报道一致。国内也有学者[9 ]
报道在固定化或
半连续培养中加入丙二醇也可增加紫草宁及其衍生物释放到培养基中 ,但紫草悬浮培养细胞中直
接加入聚氨基甲酸乙酯泡沫能增加紫草宁及其衍生物得率 ,可达到95 %以上 ......
(中国药科大学 南京 210038)
摘要 本文简要综述硬紫草、滇紫草和新疆紫草在利用愈伤组织培养、细胞悬浮培养和固定化培养生产紫草
及其衍生物方面的研究进展。
关键词 硬紫草;滇紫草;新疆紫草;组织培养
紫草为紫草科植物新疆紫草 Arnebia euchroma (Royle)Johnst、紫草 Lithospermum erythrorhizon Sieb.
et Zucc.或内蒙紫草 A. guttata Bunge 的干燥根。为常用中药材 ,新疆紫草又称软紫草 ,主产新疆、西
藏等地;紫草又称硬紫草 ,主产黑龙江、吉林、辽宁、河北、湖南等地;内蒙紫草主产内蒙等地。另外 ,在四川、云南、贵州等地 ,用同科植物滇紫草 Onosma paniculatum Bur. et Fr.的根作紫草使用。其主
要成分紫草宁(shikonin)及其衍生物为萘醌类化合物 ,具抗肿瘤、抗炎和抗菌活性 ,还有抗肝脏氧化
损伤和抗受孕作用[1 ]。紫草又是日化用品原料 ,日本已成功地以其中的色素研制开发出天然色素
口红 ,因其不含人工色素 ,上市之初就深受消费者欢迎[2 ]。由于紫草独特的药用价值 ,同时又是天
然名贵染料的来源 ,而其原植物资源严重缺乏。为解决这一矛盾 ,生物学家们试图通过组织培养法
得到紫草宁及其衍生物。日本学者 Tabata 等[3 ]
最先成功诱导了硬紫草愈伤组织 ,并生产出紫草宁
及其衍生物。随后许多国内外学者为提高紫草宁产量了大量的研究。随着研究的深入 ,用组织培
养法得到的紫草宁及其衍生物产量高、成本低 ,能大量满足市场需要。
我国学者于二十世纪八十年代后期着手进行紫草组织培养 ,樊红霞等[4 ]
成功地诱导了滇紫草
愈伤组织。之后国内关于紫草培养的研究报道越来越多 ,当前有关紫草的组织培养研究主要集中
在硬紫草、新疆紫草及滇紫草方面。现将国内有关紫草组织培养方面的报道作一简要综述。
1 硬紫草的组织培养
1974年 Tabata 等[3 ]
首先成功诱导了硬紫草愈伤组织 ,并得到紫草宁及其衍生物 ,其产生受生
长素及光控制。光 ,尤其是蓝光抑制紫草宁及其衍生物的合成。在培养过程中 ,当用 2 ,4 - 二氯苯
氧乙酸(2 ,4 - D)代替吲哚乙酸( IAA) ,色素含量显著减少。罗雪梅等[5 ]
比较了细胞培养获得的紫
草宁衍生物与从紫草根中提取得到的紫草宁衍生物 ,经 TLC和 RPHPLC鉴别 ,两者基本相似 ,且在
耐热和抗氧化方面无差别 ,色素颜色也不随pH值变化而改变。但从细胞培养中形成的色素颜色
在Na2SO3 存在下较从根中提取得到的色素不稳定。
宁文等[6 ]
采用二阶段培养法(two - stage culture) 。第一阶段为愈伤组织继代培养 ,在B5 基本培
养基中添加 IAA 0. 025mg L ,6 - 苄基氨基嘌呤(6 - BAP) 1. 0mg L ,光培养 ,光照时间 6～8 天。第二
阶段为细胞悬浮培养形成紫草宁及其衍生物 ,M9 基本培养基改加 IAA 0. 1mg L ,6 - BAP 1. 0mg L ,Ca (NO3) 2· 4H2O 347mg L ,CuCl2· H2O 6. 0mg L ,悬浮细胞置于暗室培养。发现紫草宁及其衍生物的
形成与细胞生长呈负相关 ,细胞生长缓慢则有利于紫草宁及其衍生物的形成 ,20 天后紫草宁及其
9 紫草组织培养研究概况
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.衍生物含量达到最高水平。pH值最适范围在 5. 0～7. 0 之间 ,还比较了悬浮培养细胞在不同时期
对可溶性糖、溶氧和无机元素需求变化。罗雪梅等[5 ]
认为在悬浮培养细胞中 ,加入 R - A树脂可提
高色素提取率。
刘培等[7 ]
对硬紫草细胞系AR126继代培养6年 ,并用小细胞团块法反复筛选 ,如不进行筛选 ,则紫草宁及其衍生物含量迅速降低。细胞系 AR126 酶解分离得到原生质体。只有用葡萄糖作渗
透剂经琼脂糖 - 液体双层培养才能获得可见的原生质体克隆 ,形成愈伤组织。而琼脂岛和琼脂糖
平板法则不能形成愈伤组织。从克隆体中选择 34 个克隆 ,用两阶段培养法生产紫草宁及其衍生
物。发现其中最好的原生质体克隆色素产量是起始悬浮培养的2. 54倍 ,经培养40天达到0. 6mg g
鲜重(FW) ,而且其产量在80天内无明显下降。
紫草细胞合成的色素主要存在于细胞内 ,同时有部分外泌到细胞外 ,约占总量的 30 % ,只有外
泌的色素可以收集利用。为增加紫草色素外泌量 ,吕华等[8 ]
采用固定化培养法 ,以B5 培养基为基
本培养基 ,固定化培养的细胞生长缓慢 ,第30天时的相对生长量为70 % ,仅为琼脂培养基上生长的
愈伤组织的1 6 ,但细胞能保持分裂达50天。色素产量达到4. 2mg g FW,相对色素外泌量达70 % ,而悬浮培养细胞仅有30 %。可见固定化细胞具有较强外泌能力。随着细胞内色素积累产生反馈
抑制作用 ,不利于固定化培养的连续进行。因此有必要采用促进产物释放的技术 ,研究表明:以正
十六烷处理固定化细胞 ,可促进产物释放 ,连续培养的固定细胞保持其色素形成能力达 80 天之久 ,色素总产量达20mg g FW,高于悬浮细胞。这与国外报道一致。国内也有学者[9 ]
报道在固定化或
半连续培养中加入丙二醇也可增加紫草宁及其衍生物释放到培养基中 ,但紫草悬浮培养细胞中直
接加入聚氨基甲酸乙酯泡沫能增加紫草宁及其衍生物得率 ,可达到95 %以上 ......
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