制何首乌高效液相指纹图谱分析

    刘振丽1

    , 宋志前1

    , 乔淑贞2

    , 吕爱平1

    (1 . 中国中医研究院基础理论研究所 , 北京 100700; 2 . 北京中医药大学 , 北京 10029)

    收稿日期: 20042 022 15

    基金项目:国家自然科学基金资助 (项目批准号: 30472191)。

    作者简介:刘振丽 (1965～) ,女,山东荣成人,副研究员,主要从事中药有效成分分离、 中药质量评价及新药研制,电话: 0102 640144112 2592。

    关键词:制何首乌; HPLC; 指纹特征; 二苯乙烯苷

    摘要:目的:采用 HPLCUV建立制何首乌指纹图谱 ,探讨主成分含量与指纹图谱的关系。方法:指纹图谱分析应用 Dia2

    mond C18 (4 . 6 mm × 250 mm, 5μm)色谱柱 ,甲醇和水梯度洗脱 ,流速 1 . 2 mL·min

    - 1

    ,柱温40 ° C,检测波长 280 nm。2, 3,5, 4’ 2 四羟基二苯乙烯 2 22 02 β2 D2 葡萄糖苷 (简称二苯乙烯苷 )含量测定采用 Waters Novapak C18 (3 . 9 mm × 150 mm, 5 μm)

    色谱柱 ,乙腈 2 水 (13∶ 87)为流动相 ,流速 1 . 0 mL·min

    - 1

    ,检测波长 320 nm,柱温40 ° C。结果:样品间指纹谱的相似性与

    二苯乙烯苷含量之间呈正相关。结论:为制何首乌的鉴定和质量评价提供了依据。

    中图分类号: R284 . 1 文献标识码:A 文章编号: 10012 1528 (2005) 042 03782 03

    制何首乌为蓼科植物何首乌 Polygonum m ultif lorum

    Thunb .干燥块根的炮制品 ,具有补肝肾 ,益精血 ,乌须发等功

    效[ 1 ]。所含二苯乙烯苷类成分具有保肝作用[ 2 ]

    ,在何首乌

    中的含量较高。本文对收集的 16个制何首乌饮片的 HPLC

    UV指纹图谱分析方法进行了研究 ,获得了其指纹特征 ,并探

    讨了样品间指纹谱的相似性与二苯乙烯苷含量的关系。

    1 仪器、 材料与试剂

    1 . 1 仪器 高效液相色谱仪: HP1100, G1322A脱气机,G1311A四元泵, G1313A自动进样器, G1316A恒温箱, G1315A

    DAD检测器, G1314A VWD检测器,HP化学工作站。

    1 . 2 材料 制何首乌样品来源见表 1。经中国中医研究院

    中药研究所谢宗万研究员鉴定均为蓼科植物制何首乌 Po2

    lygonum nultif lorum Thunb .干燥块根的炮制品;对照品: 2, 3,5, 4’ 2 四羟基二苯乙烯 2 22 02 β2 D2 葡萄糖苷 (简称二苯乙烯苷 ,08442 200003)、 大黄素 ( 07562 200110 )、 大黄素甲醚 ( 7582

    20000S) ,购自中国药品生物制品检定所。

    1 . 3 试剂 乙腈、 甲醇为色谱纯 (美国 Fisher公司 ) ,水为超

    纯水。

    表 1 制何首乌样品来源

    样品号 产地、 采购地 样品号 产地、 采购地

    1 湖南湘潭 9 四川重庆

    2 浙江宁波 10 山东潍坊

    3 江苏南京 11 浙江杭州

    4 广西柳州 12 黑龙江哈尔滨

    5 陕西宝鸡 13 河南郑州

    6 四川成都 14 海南海口

    7 贵州贵阳 15 广东德庆

    8 辽宁大连 16 山西太原

    2 制何首乌样品 HPLC指纹特征的建立

    2 . 1 色谱条件 Diamond C18色谱柱 ( 4 . 6 mm ×250 mm, 5

    μm) ,甲醇 2 水线性梯度 ( 0 min: 18∶ 82; 45 min: 100∶ 0)洗脱 ,流速 1 . 2 mL·min

    - 1

    ,检测波长 280 nm,柱温: 40 ° C。记录

    55 min。

    2 . 2 对照品溶液的制备 精密称取大黄素、 大黄素甲醚、 二

    苯乙烯苷对照品适量 ,加甲醇溶解制成每 1 mL各含 40μg、20μg和 60μg的溶液 ,作为对照品溶液。

    2 . 3 供试品溶液的制备 精密称取制何首乌样品粉末 (过

    4号筛 ) 0 . 2 g,精密加入甲醇 10 mL,称定重量 ,回流提取 30

    min,放冷 ,再称定重量 ,用甲醇补足减失的重量 ,过 0 . 45μm

    微孔滤膜 ,取续滤液作为供试品溶液。

    2 . 4 样品指纹图谱测定

    2 . 4 . 1 色谱峰的归属 精密吸取各对照品溶液及制何首乌

    样品 1溶液各 20μL注入液相色谱仪 ,以 DAD检测器确认

    样品图谱中各对照品的峰归属。

    2 . 4 . 2 样品分析 称取 16个不同产地、 采购地的制何首乌

    样品粉末 ,按供试品溶液制备方法操作 ,取 20μL进样测定 ,得到各样品 HPLC指纹谱。

    2 . 5 色谱相对保留指纹谱的建立

    2 . 5 . 1 相对保留时间值 α的计算和设定 参考文献方

    法[ 3, 4 ]。以制何首乌样品 HPLC图谱中二苯乙烯苷峰为参照

    物 (α= 1) ,求出样品中均存在的色谱峰的相对保留时间值:

    α= t Ri

    t R α, t Ri

    为各峰的保留时间 , t R α为参照物二苯乙烯苷的

    保留时间。由于保留时间受实验因素的影响 ,对每个峰位的

    α值根据统计学的处理设定窗口 ≤5 ,即α值取可信限在

    ± 5 的范围内。

    2 . 5 . 2 指纹谱的建立 以二苯乙烯苷峰为参照物 (RA =

    100) ,求出样品中均存在的其它色谱峰的相对峰面积 RA。按

    α值的大小次序排列,在每个α值项下列出该峰的相对峰面

    积值。16个制何首乌样品指纹图谱分析 (具有代表性样品指

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    2005年 4月

    第 27卷 第 4期

    中 成 药

    Chinese Traditi onal PatentMedicine

    Ap ril 2005

    Vol . 27 No . 4

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.纹图谱见图 1) ,可显示的指纹谱峰数为 18个,各峰相对保留

    时间α和 RA构成了其 HPLC指纹特征,结果见表 2 ......