关键词: 肝炎病毒，乙型;聚合酶链反应;基因组

    摘 要:目的 为从全基因水平研究乙型肝炎病毒变异与致病性的关系，建立从血清及质粒标本经聚合酶链反应(PCR)扩增HBV全长基因的新方法，并初步进行克隆分析. 方法 设计了含SalⅠ，SapⅠ酶切位点的引物，扩增3200kb HBV全长DNA，经酶切及连接后克隆入载体. 结果 用新建立的方法直接从少量血清中获得了全长HBV基因以及HBV全基因克隆. 结论 该法可用于对HBV毒株的基因结构和功能的研究.

     0 引言

    自PCR技术问世以来，对HBV基因组主要功能区的扩增均已成功，并应用于临床诊断和基础研究.但多数研究仅能限于对某一基因片段的研究，通过PCR扩增个体内HBV基因群中的某些亚基因片段，然后直接测序.由于HBV基因突变的复杂性，仅亚基因片段的研究是无法使出现在单个基因分子上的点突变与致病和传播的关系得到精确和全面的分析的[1] .我们根据Gunther等[2] 的报道，并加以改进后，建立了一种HBV全长聚合酶链反应(Full-length PCR)，可以直接从少量血清中一次克隆HBV全基因，为研究HBV毒株的基因结构与功能提供了新的方法.

    1 材料和方法

    1.1 材料 标本收集 10份乙型肝炎患者血清收集自西京医院检验科2000-01/2000-06的临床标本，HBV检测阳性.主要试剂和设备Expand High Fidelity assay购自德国BMI公司、DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均为美国Promega公司产品.SalⅠ，BglⅡ，HincⅡ限制性内切酶和T4连接酶购自华美公司.蛋白酶K购自Merck公司.HBV DNA检测试剂盒为华美公司产品，其引物针对S基因区，扩增片段长度为580bp.PCP10HBV DNA全基因质粒由解放军302医院惠赠.PE-480扩增仪购自美国PE公司.

    1.2 方法

    1.2.1 血清HBV DNA提取 200μL血清与蛋白酶K裂解液1∶1混合(终浓度为20mmol·L-1 Tris-HCl ......