氨茶碱对大鼠气道平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶的影响
Effects of aminophylline on secretion of matrix metalloproteinase by rat airway smooth muscle cells in vitro
ZHANG BingFang，ZHANG CaiLian，FAN FengYun，SU MingQuan，LIU YingGe，QI HaoWen
1Department of Respiratory Medicine,2Department of Radiotherapy,3Department of Clinical Laboratory,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710033,China
【Abstract】AIM： To study the effects of aminophylline on the secretion of matrix metalloproteinases (MMPs) by rat airway smooth muscle cells (ASMC) in vitro and to explore its relation with the inhibition of ASMC proliferation. METHODS: Airway smooth muscle cells were separated and cultivated in DMEM of 100 mL/L fetal calf serum and cells of 4~6 h generation were employed in experiment and were induced to be cultivated with different concentration of aminophylline (0, 50, 100, 200 mL/L ) for 12~72 h. Cell count was used to observe and compare the inhibitory effect of aminophylline at different concentrations on the proliferation of the cultivated cells. The activity and expression of MMP2 and MMP9 were determined by Western blot and gelatin enzymogram method. RESULTS: ① Compared with the control group, aminophylline at the concentration of 100 and 200 mg/L had significant inhibitory effect on the proliferation of ASEM cultured in vitro (P<0.05). ② When the concentration of aminophylline was higher than 50 mg/L, the expression of MMP2 and MP3 determined by Western blot fell significantly (P<0.05) with a dosedependent effect. ③ Gelatin enzymogram also showed that compared with the control group, the activity of gelatin decreased greatly when the concentration of aminophylline was more than 50 mg/L for 48 hours, also with a dosedependent effect. CONCLUSION: By dose dependent effect, aminophylline inhibits rat's ASMC from secreting MMP2 and MMP9, thus preventing the proliferation of ASMC and reconstruction of air passage.
【Keywords】 aminophylline;airway; myocytes, smooth muscle; matrix metalloproteases
【摘要】目的： 探讨氨茶碱对体外培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)分泌基质金属蛋白酶(MMPs)的影响及其与ASMC增殖抑制的关系 .方法： 分离大鼠气道平滑肌细胞，在含有100 mL/L胎牛血清的DMEM中培养，第4～6代细胞用于实验，细胞用不同浓度氨茶碱(0，50，100，200 mg/L)诱导培养12～72 h；采用细胞计数法观察并比较不同浓度氨茶碱对培养细胞的增殖抑制作用； Western blot和明胶酶谱法检测细胞MMP2，MMP9的活性及表达 . 结果： ① 100和200 mg/L浓度氨茶碱对体外培养大鼠ASMC增生较对照组有明显的抑制作用(P <005)；② 当氨茶碱浓度>50 mg/L时，Western blot法检测到MMP2和MMP9表达显著降低(P <005)，且呈剂量依赖效应；③ 明胶酶谱也显示，浓度>50 mg/L的氨茶碱作用48 h后，明胶酶活性较对照组显著降低，也呈剂量依赖效应 .结论： 氨茶碱通过剂量依赖效应抑制大鼠ASMC分泌MMP2和MMP9，从而阻止气道平滑肌细胞增生和气道重塑 .
【关键词】 氨茶碱；气道；肌细胞，平滑肌；金属蛋白酶类
0引言
气道平滑肌增生是气道重塑的重要组织学改变，它可直接使气道壁增厚、加重气道狭窄、产生气道高反应性，而且可以通过分泌多种细胞因子、炎性介质，加重气道炎症[1] .因此，抑制气道平滑肌增生已经成为治疗哮喘的主要措施 .我们先前的研究表明[2]，氨茶碱可以通过抑制原癌基因cfos的表达抑制气道平滑肌增生，但氨茶碱与气道平滑肌细胞(ASMC)分泌MMPs的关系尚不清楚，我们的实验目的在于探讨氨茶碱对体外培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)分泌MMPs的影响及其与ASMC增殖抑制的关系，为氨茶碱治疗哮喘提供新的理论依据 .
1材料和方法
11材料
健康雄性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供；氨茶碱购自Sigma公司；兔抗大鼠MMP2和MMP9，HRP标记山羊抗兔IgG、蛋白质分子质量Marker购自武汉博士德公司；硝酸纤维素膜购自华美生物公司；Western blot化学发光试剂盒购自Santa Cruz公司 .
12方法
121氨茶碱干预大鼠ASMC25 g/L的胰蛋白酶消化第4～6代大鼠ASMC，含100 mL/LFBS的DMEM培养液配制成单细胞悬液 .将单细胞悬液以2×107/L密度接种于25 mL细胞培养瓶，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养 .24 h后换含5 mL/L FCS的DMEM培养液孵化细胞24 h，使细胞进入生长静止状态 .然后分别加入条件培养液(含0，50，100，200 mg/L氨茶碱的100 mL/L FCS的DMEM)，干预48 h后，提取细胞上清，离心以除去细胞碎屑后分装，保存于-70℃冰箱备用 .每瓶消化细胞进行细胞计数3次.
122明胶酶谱法测定细胞培养上清明胶酶活性配制80 g/L的分离胶和50 g/L的积层胶，将凝胶固定于BioRad电泳装置上， 吸取备用的条件培养上清各10 μL，分别与3×SDS凝胶加样缓冲液5 μL充分混合后，按照预定顺序加样进行，将初始凝胶加电压8 V/cm，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，再将电压提高至10 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约3～4 h)，然后关闭电源 .洗脱、漂洗、孵育， 将凝胶用25 g/L考马斯亮蓝R250染色4 h，脱色1～2 h，直至凝胶出现清晰的负染区带 .用蒸馏水漂洗后观察 .将凝胶在蓝色滤光镜下照相，凝胶扫描后应用凝胶分析软件进行图像分析 .
123Western blot测ASMC培养上清明胶酶蛋白水平将制备的明胶片进行电泳，切下蛋白质Marker所在位置凝胶，进行考马斯亮蓝染色 .剩余部分凝胶进行电转移 .4℃ 30 V电泳8 h .取出硝酸纤维素滤膜,丽春红S染色5～10 min .将硝酸纤维素滤膜放入封闭液中，37℃温育1 h并分别与1∶100稀释的兔抗大鼠MMP2，MMP9在4℃孵育过夜，洗膜液漂洗3次 .再分别与1∶200稀释的HRP标记山羊抗兔二抗在4℃温育1～2 h .洗膜液漂洗后，按照Santa Cruz公司化学发光试剂盒说明书加入化学发光试剂，室温孵育60 s，Kodak相纸曝光60 s .照片扫描后，应用凝胶图像分析系统进行区带分析，计算相对密度 .
统计学处理： 数据用x ±s表示，组间差异比较用方差分析以及Dunnettt检验 .
2结果
21氨茶碱对大鼠ASMC增生的作用细胞计数结果显示，100 mg/L浓度氨茶碱作用后，细胞数为作用前细胞数的(69±16)%，较前降低显著(P<005)；而200 mg/L浓度氨茶碱作用后，则为(60±13)%，较前降低非常显著(P<001)； 50 mg/L氨茶碱对细胞的作用不明显[(89±18)%，P>005].
22氨茶碱对大鼠ASMC明胶酶活性的影响
221氨茶碱对大鼠ASMC MMP2活性的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h, ASMC MMP2降解明胶面积(mm2)为62±05, 较对照组 (66±03)显著降低(P<005).100，200 mg/L氨茶碱作用后，MMP2降解的明胶面积为47±03和40±04,较对照组降低非常显著(P<001)，均呈剂量依赖效应 .
222氨茶碱对大鼠ASMC MMP9活性的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h,ASMC的MMP9降解明胶面积(mm2)为023±002，与对照组 (025±002)比较，降低显著(P<005).100，200 mg/L氨茶碱作用后，MMP9降解的明胶面积(mm2)为017±002和012±002,较对照组降低非常显著 (P<001).也均呈剂量依赖效应 .
23氨茶碱对大鼠ASMC明胶酶蛋白水平的影响
231氨茶碱对大鼠ASMC MMP2蛋白水平的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h后，MMP2蛋白水平为370±028，较对照组(383±030)降低显著(P<005).100、200 mg/L氨茶碱作用后，MMP2蛋白水平(相对值)为358±027和337±025，较对照组降低非常显著(P<001)，均呈剂量依赖效应(Fig 1) .
232氨茶碱对大鼠ASMC MMP9蛋白水平的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h后，MMP9蛋白水平为019±004，较对照组(021±006)有显著差异(P<005). 100，200 mg/L氨茶碱作用后MMP9蛋白水平(相对值)为016±002和013±002，较对照组差异非常显著(P<001)，也同样呈剂量依赖效应(Fig 1) .
3讨论
MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶，由正常组织细胞、炎症细胞和肿瘤细胞以酶原形式分泌，激活后通过介导细胞外基质降解而参与组织发育、组织重建、修复、细胞迁移、血管生成、炎症反应、伤口愈合、肿瘤侵袭和转移等过程[3，4] .近年来，MMPs与哮喘的关系引起了人们很大的关注[5，6] .研究较多的是MMP2和MMP9 .临床实验表明,正常黏膜上皮组织不表达MMP9，而所有支气管哮喘患者气道粘膜上皮组织均有不同程度的MMP9表达，且哮喘患者气道粘膜MMP9的表达量与气道嗜酸粒细胞计数及通气受限的程度呈显著正相关 .离体实验表明，自分泌MMP2是ASMC的细胞增生所必需，抑制MMP2可抑制培养的ASMC增生，提示MMP2也可能参与哮喘气道重塑[7] .因此，抑制MMPs的分泌及活性为预防哮喘的气道平滑肌增生和气道重建提供一个新的靶标 .
已有研究发现非选择性环氧化酶抑制剂、蛋白合成抑制剂和地塞米松能够抑制缓激肽刺激的豚鼠TSMC分泌MMP2[8]，抑制气道平滑肌增生，从而有助于气道重建和哮喘的治疗 .我们用细胞计数法、明胶酶谱和Western blot法观察氨茶碱对大鼠ASMC增生抑制和分泌MMP2，MMP9的影响，结果显示： 氨茶碱以剂量依赖效应抑制大鼠ASMC增生和MMP2，MMP9活性及表达，且呈剂量依赖效应 .表明氨茶碱可以剂量依赖效应抑制大鼠ASMC分泌MMP2，MMP9，其具体机制尚不明确，是否与原癌基因如cfos和cjun的表达减少有关需进一步研究 .因为在多种MMPs基因的调节序列中，含有TATA盒，在TATA盒前，存在多种转录调节结合位点，多种原癌基因如cfos和cjun的表达产物，能与这些位点结合，刺激MMPs的转录 .当cfos等原癌基因表达降低，其蛋白产物减少，刺激MMPs的转录的信号减弱，MMPs的产生即减少 .
本实验结果表明氨茶碱可以通过抑制ASMC中MMPs的表达和活性，进而抑制气道平滑肌增生，阻止气道重塑的发生发展，参与哮喘的治疗，为氨茶碱治疗哮喘增添了新的理论依据 .同时我们以往的实验还证实氨茶碱可以促使气道平滑肌细胞凋亡[9]，在细胞水平消灭炎性介质来源，间接参与哮喘治疗 .从而提示氨茶碱可以通过各种途径参与哮喘的治疗，因此，有必要对茶碱类药物在治疗哮喘中的作用予以重新评价 .
【参考文献】
[1] Holgate ST. Airway inflammation and remodeling in asthma: current concepts[R]. Mol Biotechnol, 2002;22:179-189.
[2] 张彩莲，张丙芳，苏明全，等. 氨茶碱对大鼠气道平滑肌细胞增殖抑制及促细胞凋亡样改变[J].第四军医大学学报，2003；24(18):1653-1656.
Zhang CL, Zhang BF, Su MQ, et al. Efficacy of aminophylline on the proliferation and apoptosis of rat airway smooth muscle cell in vitro[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24(18):1653-1656.
[3] Mautino G, Capony F, Bousquet J,et al. Balance in asthma between matrix metalloproteinases and their inhibitors[J].J Allergy Clin Immunol, 1999;104:530-533.
[4] Chiappara G, Gagliardo R, Siena A, et al. Airway remodelling in the pathogenesis of asthma[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2001；1(1):85-93.
[5] Rajah R, Nachajon RV, Collins MH. Elevated levels of the IGF binding protein protease MMP1 in asthmatic airway smooth muscle[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1999;20:199-208.
[6] Bosse M, Chakir J, Rouabhia M, et al. Serum matrix metalloproteinase9: Tissue inhibitor of metalloproteinase1 ratio correlates with steroid responsiveness in moderate to severe asthma[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1999;159:596-602.
[7] Johnson S, Knox A. Autocrine production of matrix metalloproteinase2 is required for human airway smooth muscle proliferation[J]. Am J Physiol, 1999;277:L1109-L1117.
[8] Ewa Z, Bichoy HG, Pierre S. Bradykinin stimulates MMP2 production in guinea pig tracheal smooth muscle cells[J]. Inflammation, 2003; 27(5):307-315.
[9] 张彩莲,屈栓民,苏明权,等. 氨茶碱对大鼠气道平滑肌细胞增殖抑制及其对cfos表达的影响[J].第四军医大学学报，2004；25(7):656-659.
Zhang CL, Qu SM, Su MQ, et al. Inhibitory effects of aminophylline on proliferation of rat airway smooth muscle cells and expression of cfos in vitro[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2004; 25(7):656-659.
作者简介：张丙芳(1958)，男(汉族)，河北省平乡县人.博士，教授.Tel.(029)83375637Email. Binfz@sina.com
(第四军医大学西京医院：1呼吸内科 ，2放疗科，3检验科，陕西 西安 710033)
编辑王睿, http://www.100md.com(张丙芳，张彩莲，范风云，苏明权，刘颖格，戚好文)
ZHANG BingFang，ZHANG CaiLian，FAN FengYun，SU MingQuan，LIU YingGe，QI HaoWen
1Department of Respiratory Medicine,2Department of Radiotherapy,3Department of Clinical Laboratory,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710033,China
【Abstract】AIM： To study the effects of aminophylline on the secretion of matrix metalloproteinases (MMPs) by rat airway smooth muscle cells (ASMC) in vitro and to explore its relation with the inhibition of ASMC proliferation. METHODS: Airway smooth muscle cells were separated and cultivated in DMEM of 100 mL/L fetal calf serum and cells of 4~6 h generation were employed in experiment and were induced to be cultivated with different concentration of aminophylline (0, 50, 100, 200 mL/L ) for 12~72 h. Cell count was used to observe and compare the inhibitory effect of aminophylline at different concentrations on the proliferation of the cultivated cells. The activity and expression of MMP2 and MMP9 were determined by Western blot and gelatin enzymogram method. RESULTS: ① Compared with the control group, aminophylline at the concentration of 100 and 200 mg/L had significant inhibitory effect on the proliferation of ASEM cultured in vitro (P<0.05). ② When the concentration of aminophylline was higher than 50 mg/L, the expression of MMP2 and MP3 determined by Western blot fell significantly (P<0.05) with a dosedependent effect. ③ Gelatin enzymogram also showed that compared with the control group, the activity of gelatin decreased greatly when the concentration of aminophylline was more than 50 mg/L for 48 hours, also with a dosedependent effect. CONCLUSION: By dose dependent effect, aminophylline inhibits rat's ASMC from secreting MMP2 and MMP9, thus preventing the proliferation of ASMC and reconstruction of air passage.
【Keywords】 aminophylline;airway; myocytes, smooth muscle; matrix metalloproteases
【摘要】目的： 探讨氨茶碱对体外培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)分泌基质金属蛋白酶(MMPs)的影响及其与ASMC增殖抑制的关系 .方法： 分离大鼠气道平滑肌细胞，在含有100 mL/L胎牛血清的DMEM中培养，第4～6代细胞用于实验，细胞用不同浓度氨茶碱(0，50，100，200 mg/L)诱导培养12～72 h；采用细胞计数法观察并比较不同浓度氨茶碱对培养细胞的增殖抑制作用； Western blot和明胶酶谱法检测细胞MMP2，MMP9的活性及表达 . 结果： ① 100和200 mg/L浓度氨茶碱对体外培养大鼠ASMC增生较对照组有明显的抑制作用(P <005)；② 当氨茶碱浓度>50 mg/L时，Western blot法检测到MMP2和MMP9表达显著降低(P <005)，且呈剂量依赖效应；③ 明胶酶谱也显示，浓度>50 mg/L的氨茶碱作用48 h后，明胶酶活性较对照组显著降低，也呈剂量依赖效应 .结论： 氨茶碱通过剂量依赖效应抑制大鼠ASMC分泌MMP2和MMP9，从而阻止气道平滑肌细胞增生和气道重塑 .
【关键词】 氨茶碱；气道；肌细胞，平滑肌；金属蛋白酶类
0引言
气道平滑肌增生是气道重塑的重要组织学改变，它可直接使气道壁增厚、加重气道狭窄、产生气道高反应性，而且可以通过分泌多种细胞因子、炎性介质，加重气道炎症[1] .因此，抑制气道平滑肌增生已经成为治疗哮喘的主要措施 .我们先前的研究表明[2]，氨茶碱可以通过抑制原癌基因cfos的表达抑制气道平滑肌增生，但氨茶碱与气道平滑肌细胞(ASMC)分泌MMPs的关系尚不清楚，我们的实验目的在于探讨氨茶碱对体外培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)分泌MMPs的影响及其与ASMC增殖抑制的关系，为氨茶碱治疗哮喘提供新的理论依据 .
1材料和方法
11材料
健康雄性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供；氨茶碱购自Sigma公司；兔抗大鼠MMP2和MMP9，HRP标记山羊抗兔IgG、蛋白质分子质量Marker购自武汉博士德公司；硝酸纤维素膜购自华美生物公司；Western blot化学发光试剂盒购自Santa Cruz公司 .
12方法
121氨茶碱干预大鼠ASMC25 g/L的胰蛋白酶消化第4～6代大鼠ASMC，含100 mL/LFBS的DMEM培养液配制成单细胞悬液 .将单细胞悬液以2×107/L密度接种于25 mL细胞培养瓶，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养 .24 h后换含5 mL/L FCS的DMEM培养液孵化细胞24 h，使细胞进入生长静止状态 .然后分别加入条件培养液(含0，50，100，200 mg/L氨茶碱的100 mL/L FCS的DMEM)，干预48 h后，提取细胞上清，离心以除去细胞碎屑后分装，保存于-70℃冰箱备用 .每瓶消化细胞进行细胞计数3次.
122明胶酶谱法测定细胞培养上清明胶酶活性配制80 g/L的分离胶和50 g/L的积层胶，将凝胶固定于BioRad电泳装置上， 吸取备用的条件培养上清各10 μL，分别与3×SDS凝胶加样缓冲液5 μL充分混合后，按照预定顺序加样进行，将初始凝胶加电压8 V/cm，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，再将电压提高至10 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约3～4 h)，然后关闭电源 .洗脱、漂洗、孵育， 将凝胶用25 g/L考马斯亮蓝R250染色4 h，脱色1～2 h，直至凝胶出现清晰的负染区带 .用蒸馏水漂洗后观察 .将凝胶在蓝色滤光镜下照相，凝胶扫描后应用凝胶分析软件进行图像分析 .
123Western blot测ASMC培养上清明胶酶蛋白水平将制备的明胶片进行电泳，切下蛋白质Marker所在位置凝胶，进行考马斯亮蓝染色 .剩余部分凝胶进行电转移 .4℃ 30 V电泳8 h .取出硝酸纤维素滤膜,丽春红S染色5～10 min .将硝酸纤维素滤膜放入封闭液中，37℃温育1 h并分别与1∶100稀释的兔抗大鼠MMP2，MMP9在4℃孵育过夜，洗膜液漂洗3次 .再分别与1∶200稀释的HRP标记山羊抗兔二抗在4℃温育1～2 h .洗膜液漂洗后，按照Santa Cruz公司化学发光试剂盒说明书加入化学发光试剂，室温孵育60 s，Kodak相纸曝光60 s .照片扫描后，应用凝胶图像分析系统进行区带分析，计算相对密度 .
统计学处理： 数据用x ±s表示，组间差异比较用方差分析以及Dunnettt检验 .
2结果
21氨茶碱对大鼠ASMC增生的作用细胞计数结果显示，100 mg/L浓度氨茶碱作用后，细胞数为作用前细胞数的(69±16)%，较前降低显著(P<005)；而200 mg/L浓度氨茶碱作用后，则为(60±13)%，较前降低非常显著(P<001)； 50 mg/L氨茶碱对细胞的作用不明显[(89±18)%，P>005].
22氨茶碱对大鼠ASMC明胶酶活性的影响
221氨茶碱对大鼠ASMC MMP2活性的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h, ASMC MMP2降解明胶面积(mm2)为62±05, 较对照组 (66±03)显著降低(P<005).100，200 mg/L氨茶碱作用后，MMP2降解的明胶面积为47±03和40±04,较对照组降低非常显著(P<001)，均呈剂量依赖效应 .
222氨茶碱对大鼠ASMC MMP9活性的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h,ASMC的MMP9降解明胶面积(mm2)为023±002，与对照组 (025±002)比较，降低显著(P<005).100，200 mg/L氨茶碱作用后，MMP9降解的明胶面积(mm2)为017±002和012±002,较对照组降低非常显著 (P<001).也均呈剂量依赖效应 .
23氨茶碱对大鼠ASMC明胶酶蛋白水平的影响
231氨茶碱对大鼠ASMC MMP2蛋白水平的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h后，MMP2蛋白水平为370±028，较对照组(383±030)降低显著(P<005).100、200 mg/L氨茶碱作用后，MMP2蛋白水平(相对值)为358±027和337±025，较对照组降低非常显著(P<001)，均呈剂量依赖效应(Fig 1) .
232氨茶碱对大鼠ASMC MMP9蛋白水平的影响50 mg/L氨茶碱作用48 h后，MMP9蛋白水平为019±004，较对照组(021±006)有显著差异(P<005). 100，200 mg/L氨茶碱作用后MMP9蛋白水平(相对值)为016±002和013±002，较对照组差异非常显著(P<001)，也同样呈剂量依赖效应(Fig 1) .
3讨论
MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶，由正常组织细胞、炎症细胞和肿瘤细胞以酶原形式分泌，激活后通过介导细胞外基质降解而参与组织发育、组织重建、修复、细胞迁移、血管生成、炎症反应、伤口愈合、肿瘤侵袭和转移等过程[3，4] .近年来，MMPs与哮喘的关系引起了人们很大的关注[5，6] .研究较多的是MMP2和MMP9 .临床实验表明,正常黏膜上皮组织不表达MMP9，而所有支气管哮喘患者气道粘膜上皮组织均有不同程度的MMP9表达，且哮喘患者气道粘膜MMP9的表达量与气道嗜酸粒细胞计数及通气受限的程度呈显著正相关 .离体实验表明，自分泌MMP2是ASMC的细胞增生所必需，抑制MMP2可抑制培养的ASMC增生，提示MMP2也可能参与哮喘气道重塑[7] .因此，抑制MMPs的分泌及活性为预防哮喘的气道平滑肌增生和气道重建提供一个新的靶标 .
已有研究发现非选择性环氧化酶抑制剂、蛋白合成抑制剂和地塞米松能够抑制缓激肽刺激的豚鼠TSMC分泌MMP2[8]，抑制气道平滑肌增生，从而有助于气道重建和哮喘的治疗 .我们用细胞计数法、明胶酶谱和Western blot法观察氨茶碱对大鼠ASMC增生抑制和分泌MMP2，MMP9的影响，结果显示： 氨茶碱以剂量依赖效应抑制大鼠ASMC增生和MMP2，MMP9活性及表达，且呈剂量依赖效应 .表明氨茶碱可以剂量依赖效应抑制大鼠ASMC分泌MMP2，MMP9，其具体机制尚不明确，是否与原癌基因如cfos和cjun的表达减少有关需进一步研究 .因为在多种MMPs基因的调节序列中，含有TATA盒，在TATA盒前，存在多种转录调节结合位点，多种原癌基因如cfos和cjun的表达产物，能与这些位点结合，刺激MMPs的转录 .当cfos等原癌基因表达降低，其蛋白产物减少，刺激MMPs的转录的信号减弱，MMPs的产生即减少 .
本实验结果表明氨茶碱可以通过抑制ASMC中MMPs的表达和活性，进而抑制气道平滑肌增生，阻止气道重塑的发生发展，参与哮喘的治疗，为氨茶碱治疗哮喘增添了新的理论依据 .同时我们以往的实验还证实氨茶碱可以促使气道平滑肌细胞凋亡[9]，在细胞水平消灭炎性介质来源，间接参与哮喘治疗 .从而提示氨茶碱可以通过各种途径参与哮喘的治疗，因此，有必要对茶碱类药物在治疗哮喘中的作用予以重新评价 .
【参考文献】
[1] Holgate ST. Airway inflammation and remodeling in asthma: current concepts[R]. Mol Biotechnol, 2002;22:179-189.
[2] 张彩莲，张丙芳，苏明全，等. 氨茶碱对大鼠气道平滑肌细胞增殖抑制及促细胞凋亡样改变[J].第四军医大学学报，2003；24(18):1653-1656.
Zhang CL, Zhang BF, Su MQ, et al. Efficacy of aminophylline on the proliferation and apoptosis of rat airway smooth muscle cell in vitro[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24(18):1653-1656.
[3] Mautino G, Capony F, Bousquet J,et al. Balance in asthma between matrix metalloproteinases and their inhibitors[J].J Allergy Clin Immunol, 1999;104:530-533.
[4] Chiappara G, Gagliardo R, Siena A, et al. Airway remodelling in the pathogenesis of asthma[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2001；1(1):85-93.
[5] Rajah R, Nachajon RV, Collins MH. Elevated levels of the IGF binding protein protease MMP1 in asthmatic airway smooth muscle[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1999;20:199-208.
[6] Bosse M, Chakir J, Rouabhia M, et al. Serum matrix metalloproteinase9: Tissue inhibitor of metalloproteinase1 ratio correlates with steroid responsiveness in moderate to severe asthma[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1999;159:596-602.
[7] Johnson S, Knox A. Autocrine production of matrix metalloproteinase2 is required for human airway smooth muscle proliferation[J]. Am J Physiol, 1999;277:L1109-L1117.
[8] Ewa Z, Bichoy HG, Pierre S. Bradykinin stimulates MMP2 production in guinea pig tracheal smooth muscle cells[J]. Inflammation, 2003; 27(5):307-315.
[9] 张彩莲,屈栓民,苏明权,等. 氨茶碱对大鼠气道平滑肌细胞增殖抑制及其对cfos表达的影响[J].第四军医大学学报，2004；25(7):656-659.
Zhang CL, Qu SM, Su MQ, et al. Inhibitory effects of aminophylline on proliferation of rat airway smooth muscle cells and expression of cfos in vitro[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2004; 25(7):656-659.
作者简介：张丙芳(1958)，男(汉族)，河北省平乡县人.博士，教授.Tel.(029)83375637Email. Binfz@sina.com
(第四军医大学西京医院：1呼吸内科 ，2放疗科，3检验科，陕西 西安 710033)
编辑王睿, http://www.100md.com(张丙芳，张彩莲，范风云，苏明权，刘颖格，戚好文)