项韧带钙化与颈椎病黄韧带退变的相关性研究
(武警江苏总队医院骨科，扬州市225003；上海市长征医院骨科，200003)
摘要：[目的]探讨不同节段项韧带钙化与脊髓型颈椎病黄韧带退变的相关性。[方法]取脊髓型颈椎病患者黄韧带192块(项韧带钙化28个节段，相应黄韧带标本56块)和青壮年颈椎创伤(非颈椎病)的黄韧带标本38块。对切除的黄韧带标本进行测量及组织学检查；用Woessner法测定其胶原含量；用盐析法对黄韧带中的Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比进行测定；对黄韧带厚度与羟脯氨酸、胶原干粉含量及Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比进行相关性研究。[结论]颈椎病组中项韧带钙化相应节段的黄韧带弹力纤维含量下降，胶原纤维含量增加，弹力纤维发生排列紊乱。实验组中C4、5、C5、6项韧带钙化相应的节段黄韧带厚度、羟脯氨酸含量、Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比较阴性对照组有显著差异(P<005)；而C3、4、C6、7项韧带钙化相应节段的黄韧带上述指标则无显著差异(P>005)。[结论]C4、5、C5、6节段的项韧带钙化与颈椎病黄韧带的退变有相关性；上述节段的项韧带钙化提示存在应力异常分布，可能会加剧黄韧带退变，进而影响脊髓型颈椎病的发病进程。
关键词：项韧带；钙化；黄韧带；退变；相关性
Study on correlation between calsification of ligamentum nuchae and degeneration of ligamentum flavon∥
WANG Changfeng,JIA Lianshun,WEI Haifeng,et al
Department of Orthopedics,Jiangsu Corps Hospital of Police Army,Yangzhou 225003
Abstract：[Objective]To study the relationship between ossification of ligamentum nuchae (LN) and degeneration of ligamentum flavon (LF) of cervical spondylotic myelopathy (CSM)[Method]Fiftysix cervical LF samples from CSM patient of C3~7 in relation to the stage of ossification of LN samples (experimental group,EG) and 38 samples of corresponding ligament from patient with cervical vertebral trauma (CVT ) (control group,CG ) were obtained Thickness of LF was measured,their pathological change was examined by microscopy,content of collagen and kydrolyproline and the ratio of type Ⅰ/ type Ⅱ collagen were determined by Woessners method and setting Salting out method The correlation among the thickness of degenerative LF,the ratio of type Ⅰ/ type Ⅱ collagen,the content of collagen and hydrokyproline,and arrangement disorder of LF in relation to the ossification stage of LN were analyzed[Result]In EG,as compared with in CG,there showed a decrease of elastic fibre,decrease of ratio type Ⅰ/ type Ⅱ collagen due to significant increase of type Ⅱ collagen,increase collagen content and disorder arrangement of LF In relation to the ossification of LN,above changes were more marked in LF of C4、5,C5、6,than that of C3、4,C6、7 (P<005)[Conclusion]The degeneration of LF is correlated with ossification stage of C4、5,C5、6LN,The ossification of LN,that resulted in abnormal distribute of stress in LF,may be a main etiologic factor to CSM
Key words：Ligamentum flavon;Ligamentum nuchae;Degeneration;Ossification;Cervical spondylotic myelopathy
随着对脊髓型颈椎病发病机理的深入研究，学者们认为颈椎病的发病除与三关节复合体的退变有关外，还与颈椎韧带及肌肉系统的动力失衡有关〔1〕。项韧带钙化在脊髓型颈椎病发展进程中的意义目前缺乏较深入的研究。不同节段项韧带钙化与脊髓型颈椎病黄韧带退变的关系值得探讨。
1资料和方法
11一般资料
自2004年1月～2004年9月，收集19例青壮年颈椎创伤及24例多节段脊髓型颈椎病的黄韧带标本。颈椎病患者中：男14人，女10人；年龄52～76岁，平均657岁；病史30～164 a，平均81 a；术前JOA评分为10～13分，平均123分。本组中项韧带钙化共28个节段，其中发生在C3、4水平3例次，占107%；发生在C4、5水平5例次，占179%；发生在C5、6水平7例，占25%；发生在C6、7水平13例次，占463%。密度均匀24节段；密度欠均匀4节段。最长者45 cm，最短者5 mm，宽约5~8 mm。X线片上：长条状钙化11例，占55%。节段条状钙化3例，占15%。圆球形钙化3例，占15%。串珠状钙化2例，占10%，条状并圆球形钙化1例，占5%。手术中获取项韧带钙化节段相应的黄韧带标本56块。颈椎创伤组作为对照，其中男13例，女6例；年龄26～41岁，平均348岁。收集C3、4、C4、5、C5、6、C6、7的黄韧带分别为8、10、12、8块，共计38块。
12方法
121黄韧带厚度测定及组织切片
取材后即刻用游标卡尺测量黄韧带椎板间的厚度。部分黄韧带用40 g/L甲醛固定、脱钙、石蜡包埋，作苏木精伊红(HE)染色。
122羟脯氨酸和胶原含量测定
部分黄韧带烘干后研磨成粉、称重，丙酮脱脂，自然干燥。用Woessner法测定黄韧带干粉中羟脯氨酸及胶原干粉含量；部分黄韧带标本称重后，用盐析法对黄韧带中的Ⅰ型和Ⅱ型胶原含量的比值进行测定。
2结果
21大体病理观察及测量结果
对照组黄韧带无增生、钙化或骨化；脊髓型颈椎病组黄韧带普遍增生肥厚，项韧带钙化组的黄韧带增厚更明显。
22组织病理学观察
221对照组
黄韧带主体由沿长轴排列的弹力纤维构成，弹力纤维彼此有分枝相互联结成网，其间是少量胶原纤维(图1)。
222脊髓型颈椎病组
黄韧带中弹力纤维大部分发生断裂，排列不规整，弹力纤维数量下降而胶原成分增加显著，项韧带钙化组表现更甚(图2)。项韧带钙化标本中可见钙化团块和骨细胞化生(图3、4)。
图1对照组黄韧带纤维排列整齐，纤维无明显中断(HE×200)(略)
图2项韧带钙化节段对应的黄韧带退变明显，纤维排列紊乱(HE×400)(略)
图3项韧带弹力纤维排列紊乱，部分发生钙化(HE×100)(略)
图4项韧带纤维出现骨细胞化生(HE×100)(略)
23羟脯氨酸含量的测定和胶原的比例
经聚丙烯胺凝胶(SDSPAGE)电泳，有α2(Ⅰ)、α1(Ⅰ)、β和γ 4条区带的为Ⅰ型胶原，有α1(Ⅱ)、β和γ 3条区带为Ⅱ型胶原。Ⅰ型胶原/Ⅱ型胶原在颈椎病组中比例下降，Ⅱ型胶原含量增加。与对照组(颈椎创伤组)相比，项韧带钙化节段相应的黄韧带胶原含量显著增加，其中，C3、4、C6、7胶原增加明显(P<005)：C4、5、C5、6增加更显著(P<001)。与阴性对照组相比，C4、5、C5、6项韧带钙化者，黄韧带中羟脯氨酸含量和胶原干粉含量显著增加(表1～2)。
3讨论
31项韧带骨化的意义
颈段的棘上韧带宽而厚，附着于各棘突的尖端，前方与棘间韧带融合；后方附着于枕骨和颈椎棘突尖端的部分向后延伸，形成的三角形薄板样结构称项韧带。项韧带的主要作用为限制脊柱的前屈。正常项韧带的组成以网状排列的胶原纤维为主，间以少量的弹力纤维。这样的结构与其功能相适应，Chazal〔2〕将其描述为弹力纤维捆扎在一起的Z字结构。当项韧带受到拉伸负荷时，Z字结构被拉直，韧带变长；当拉伸解除后，胶原纤维在其周围弹力纤维的牵拉下，恢复其原有的弯曲结构。
Takeshita K〔3〕认为颈椎项韧带退变后可能增加颈椎的不稳定和序列紊乱，进一步加剧颈椎骨骼-肌肉系统的退变。当项韧带受到超负荷的牵拉时，弹力纤维及胶原纤维部分撕裂，从而使胶原纤维增生、变性，大量的软骨细胞增生、甲苯胺蓝染色示胶原纤维及软骨细胞呈现阳性，是韧带骨化形成的前期的特征。此外，软骨细胞具有合成碱性磷酸酶的能力，这也是基质钙化所必须的。多数学者认为：项韧带钙化可理解为项韧带超负荷的一种表现。
表1盐析法测定Ⅰ/Ⅱ型胶原含量比例的变化(略)
注：阴性对照组指脊髓型颈椎病组所有节段除去颈椎不稳和项韧带骨化节段与正常组相比，*P<001,**P<005
表2项韧带钙化对应节段与阴性对照组的黄韧带厚度及胶原干粉含量(略)
注：阴性对照组指脊髓型颈椎病组所有节段除去颈椎不稳和项韧带骨化节段项韧带钙化组与阴性对照组相比，*P<005,**P>005
32黄韧带中羟脯氨酸含量及Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比值的意义
胶原蛋白分子由3条α多肽链组成的螺旋样结构。羟脯氨酸对维持胶原的分子三螺旋结构起重要作用，每条α链都含有固定比例的羟脯氨酸。羟脯氨酸可作为半定量胶原纤维的指标。随着黄韧带的退变，Ⅰ型胶原的比例下降，而Ⅱ型胶原含量上升。黄韧带中Ⅰ型胶原较Ⅱ型胶原有更好的抗张力性能及刚度。Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比的变化，可以反映黄韧带的退变程度。
33黄韧带退变的形态学改变
资料显示黄韧带以弹力纤维为主要成分，其排列与黄韧带长轴平行，为胶原纤维基质分隔，染色测定发现黄韧带中弹力纤维占80%、胶原纤维占20%。当颈椎退变时，黄韧带则变性，弹力纤维分布紊乱，胶原纤维失去正常的结构。笔者〔4〕已证实黄韧带的退变和脊髓型颈椎病的病程密切相关。陈锋〔5〕等的研究进一步说明随着脊髓受压程度的加重，脊髓的微循环障碍加剧，导致脊髓功能的进一步缺失。
脊髓型颈椎病并发项韧带骨化时，相应节段的黄韧带中羟脯氨酸含量增加、Ⅰ型/Ⅱ型胶原的比值下降显著，使相应节段黄韧带的退变进一步加剧。脊髓型颈椎病时黄韧带的退变与项韧带钙化有一定的相关性。非颈椎病患者的项韧带钙化主要集中在C6、7节段。在脊髓型颈椎病患者中C4、5、C5、6项韧带钙化和相应节段的黄韧带退变密切相关。
参考文献：
〔1〕陈雄生，贾连顺，袁文，等.脊髓型颈椎病自然史规律研究[J].中国矫形外科杂志,2002，10(13)：13011304.
〔2〕宋红星，杨敏杰，刘淼，等.黄韧带的病理和胶原含量变化及其与颈椎管狭窄症的关系[J].中国脊柱脊髓杂志，2000,10(3)：154156.
〔3〕Takeshita K,Peterson ET,BylskiAustrow D,et al.The nuchal ligament restrains cervical spine flexion[J].Spine,2004,29(18):388393.
〔4〕王长峰，贾连顺，魏梅洋，等.颈椎黄韧带退变和脊髓型颈椎病的发病关系研究[J].中国脊柱脊髓杂志,2005，15(8)：486488.
〔5〕陈锋.脊髓型颈椎病脊髓微血管神经元微环境改变实验研究[J].中国矫形外科杂志,2004，12(13)：10091010., 百拇医药(王长峰,贾连顺,魏海峰,施政,杨诚,马俊民)
摘要：[目的]探讨不同节段项韧带钙化与脊髓型颈椎病黄韧带退变的相关性。[方法]取脊髓型颈椎病患者黄韧带192块(项韧带钙化28个节段，相应黄韧带标本56块)和青壮年颈椎创伤(非颈椎病)的黄韧带标本38块。对切除的黄韧带标本进行测量及组织学检查；用Woessner法测定其胶原含量；用盐析法对黄韧带中的Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比进行测定；对黄韧带厚度与羟脯氨酸、胶原干粉含量及Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比进行相关性研究。[结论]颈椎病组中项韧带钙化相应节段的黄韧带弹力纤维含量下降，胶原纤维含量增加，弹力纤维发生排列紊乱。实验组中C4、5、C5、6项韧带钙化相应的节段黄韧带厚度、羟脯氨酸含量、Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比较阴性对照组有显著差异(P<005)；而C3、4、C6、7项韧带钙化相应节段的黄韧带上述指标则无显著差异(P>005)。[结论]C4、5、C5、6节段的项韧带钙化与颈椎病黄韧带的退变有相关性；上述节段的项韧带钙化提示存在应力异常分布，可能会加剧黄韧带退变，进而影响脊髓型颈椎病的发病进程。
关键词：项韧带；钙化；黄韧带；退变；相关性
Study on correlation between calsification of ligamentum nuchae and degeneration of ligamentum flavon∥
WANG Changfeng,JIA Lianshun,WEI Haifeng,et al
Department of Orthopedics,Jiangsu Corps Hospital of Police Army,Yangzhou 225003
Abstract：[Objective]To study the relationship between ossification of ligamentum nuchae (LN) and degeneration of ligamentum flavon (LF) of cervical spondylotic myelopathy (CSM)[Method]Fiftysix cervical LF samples from CSM patient of C3~7 in relation to the stage of ossification of LN samples (experimental group,EG) and 38 samples of corresponding ligament from patient with cervical vertebral trauma (CVT ) (control group,CG ) were obtained Thickness of LF was measured,their pathological change was examined by microscopy,content of collagen and kydrolyproline and the ratio of type Ⅰ/ type Ⅱ collagen were determined by Woessners method and setting Salting out method The correlation among the thickness of degenerative LF,the ratio of type Ⅰ/ type Ⅱ collagen,the content of collagen and hydrokyproline,and arrangement disorder of LF in relation to the ossification stage of LN were analyzed[Result]In EG,as compared with in CG,there showed a decrease of elastic fibre,decrease of ratio type Ⅰ/ type Ⅱ collagen due to significant increase of type Ⅱ collagen,increase collagen content and disorder arrangement of LF In relation to the ossification of LN,above changes were more marked in LF of C4、5,C5、6,than that of C3、4,C6、7 (P<005)[Conclusion]The degeneration of LF is correlated with ossification stage of C4、5,C5、6LN,The ossification of LN,that resulted in abnormal distribute of stress in LF,may be a main etiologic factor to CSM
Key words：Ligamentum flavon;Ligamentum nuchae;Degeneration;Ossification;Cervical spondylotic myelopathy
随着对脊髓型颈椎病发病机理的深入研究，学者们认为颈椎病的发病除与三关节复合体的退变有关外，还与颈椎韧带及肌肉系统的动力失衡有关〔1〕。项韧带钙化在脊髓型颈椎病发展进程中的意义目前缺乏较深入的研究。不同节段项韧带钙化与脊髓型颈椎病黄韧带退变的关系值得探讨。
1资料和方法
11一般资料
自2004年1月～2004年9月，收集19例青壮年颈椎创伤及24例多节段脊髓型颈椎病的黄韧带标本。颈椎病患者中：男14人，女10人；年龄52～76岁，平均657岁；病史30～164 a，平均81 a；术前JOA评分为10～13分，平均123分。本组中项韧带钙化共28个节段，其中发生在C3、4水平3例次，占107%；发生在C4、5水平5例次，占179%；发生在C5、6水平7例，占25%；发生在C6、7水平13例次，占463%。密度均匀24节段；密度欠均匀4节段。最长者45 cm，最短者5 mm，宽约5~8 mm。X线片上：长条状钙化11例，占55%。节段条状钙化3例，占15%。圆球形钙化3例，占15%。串珠状钙化2例，占10%，条状并圆球形钙化1例，占5%。手术中获取项韧带钙化节段相应的黄韧带标本56块。颈椎创伤组作为对照，其中男13例，女6例；年龄26～41岁，平均348岁。收集C3、4、C4、5、C5、6、C6、7的黄韧带分别为8、10、12、8块，共计38块。
12方法
121黄韧带厚度测定及组织切片
取材后即刻用游标卡尺测量黄韧带椎板间的厚度。部分黄韧带用40 g/L甲醛固定、脱钙、石蜡包埋，作苏木精伊红(HE)染色。
122羟脯氨酸和胶原含量测定
部分黄韧带烘干后研磨成粉、称重，丙酮脱脂，自然干燥。用Woessner法测定黄韧带干粉中羟脯氨酸及胶原干粉含量；部分黄韧带标本称重后，用盐析法对黄韧带中的Ⅰ型和Ⅱ型胶原含量的比值进行测定。
2结果
21大体病理观察及测量结果
对照组黄韧带无增生、钙化或骨化；脊髓型颈椎病组黄韧带普遍增生肥厚，项韧带钙化组的黄韧带增厚更明显。
22组织病理学观察
221对照组
黄韧带主体由沿长轴排列的弹力纤维构成，弹力纤维彼此有分枝相互联结成网，其间是少量胶原纤维(图1)。
222脊髓型颈椎病组
黄韧带中弹力纤维大部分发生断裂，排列不规整，弹力纤维数量下降而胶原成分增加显著，项韧带钙化组表现更甚(图2)。项韧带钙化标本中可见钙化团块和骨细胞化生(图3、4)。
图1对照组黄韧带纤维排列整齐，纤维无明显中断(HE×200)(略)
图2项韧带钙化节段对应的黄韧带退变明显，纤维排列紊乱(HE×400)(略)
图3项韧带弹力纤维排列紊乱，部分发生钙化(HE×100)(略)
图4项韧带纤维出现骨细胞化生(HE×100)(略)
23羟脯氨酸含量的测定和胶原的比例
经聚丙烯胺凝胶(SDSPAGE)电泳，有α2(Ⅰ)、α1(Ⅰ)、β和γ 4条区带的为Ⅰ型胶原，有α1(Ⅱ)、β和γ 3条区带为Ⅱ型胶原。Ⅰ型胶原/Ⅱ型胶原在颈椎病组中比例下降，Ⅱ型胶原含量增加。与对照组(颈椎创伤组)相比，项韧带钙化节段相应的黄韧带胶原含量显著增加，其中，C3、4、C6、7胶原增加明显(P<005)：C4、5、C5、6增加更显著(P<001)。与阴性对照组相比，C4、5、C5、6项韧带钙化者，黄韧带中羟脯氨酸含量和胶原干粉含量显著增加(表1～2)。
3讨论
31项韧带骨化的意义
颈段的棘上韧带宽而厚，附着于各棘突的尖端，前方与棘间韧带融合；后方附着于枕骨和颈椎棘突尖端的部分向后延伸，形成的三角形薄板样结构称项韧带。项韧带的主要作用为限制脊柱的前屈。正常项韧带的组成以网状排列的胶原纤维为主，间以少量的弹力纤维。这样的结构与其功能相适应，Chazal〔2〕将其描述为弹力纤维捆扎在一起的Z字结构。当项韧带受到拉伸负荷时，Z字结构被拉直，韧带变长；当拉伸解除后，胶原纤维在其周围弹力纤维的牵拉下，恢复其原有的弯曲结构。
Takeshita K〔3〕认为颈椎项韧带退变后可能增加颈椎的不稳定和序列紊乱，进一步加剧颈椎骨骼-肌肉系统的退变。当项韧带受到超负荷的牵拉时，弹力纤维及胶原纤维部分撕裂，从而使胶原纤维增生、变性，大量的软骨细胞增生、甲苯胺蓝染色示胶原纤维及软骨细胞呈现阳性，是韧带骨化形成的前期的特征。此外，软骨细胞具有合成碱性磷酸酶的能力，这也是基质钙化所必须的。多数学者认为：项韧带钙化可理解为项韧带超负荷的一种表现。
表1盐析法测定Ⅰ/Ⅱ型胶原含量比例的变化(略)
注：阴性对照组指脊髓型颈椎病组所有节段除去颈椎不稳和项韧带骨化节段与正常组相比，*P<001,**P<005
表2项韧带钙化对应节段与阴性对照组的黄韧带厚度及胶原干粉含量(略)
注：阴性对照组指脊髓型颈椎病组所有节段除去颈椎不稳和项韧带骨化节段项韧带钙化组与阴性对照组相比，*P<005,**P>005
32黄韧带中羟脯氨酸含量及Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比值的意义
胶原蛋白分子由3条α多肽链组成的螺旋样结构。羟脯氨酸对维持胶原的分子三螺旋结构起重要作用，每条α链都含有固定比例的羟脯氨酸。羟脯氨酸可作为半定量胶原纤维的指标。随着黄韧带的退变，Ⅰ型胶原的比例下降，而Ⅱ型胶原含量上升。黄韧带中Ⅰ型胶原较Ⅱ型胶原有更好的抗张力性能及刚度。Ⅰ型/Ⅱ型胶原含量比的变化，可以反映黄韧带的退变程度。
33黄韧带退变的形态学改变
资料显示黄韧带以弹力纤维为主要成分，其排列与黄韧带长轴平行，为胶原纤维基质分隔，染色测定发现黄韧带中弹力纤维占80%、胶原纤维占20%。当颈椎退变时，黄韧带则变性，弹力纤维分布紊乱，胶原纤维失去正常的结构。笔者〔4〕已证实黄韧带的退变和脊髓型颈椎病的病程密切相关。陈锋〔5〕等的研究进一步说明随着脊髓受压程度的加重，脊髓的微循环障碍加剧，导致脊髓功能的进一步缺失。
脊髓型颈椎病并发项韧带骨化时，相应节段的黄韧带中羟脯氨酸含量增加、Ⅰ型/Ⅱ型胶原的比值下降显著，使相应节段黄韧带的退变进一步加剧。脊髓型颈椎病时黄韧带的退变与项韧带钙化有一定的相关性。非颈椎病患者的项韧带钙化主要集中在C6、7节段。在脊髓型颈椎病患者中C4、5、C5、6项韧带钙化和相应节段的黄韧带退变密切相关。
参考文献：
〔1〕陈雄生，贾连顺，袁文，等.脊髓型颈椎病自然史规律研究[J].中国矫形外科杂志,2002，10(13)：13011304.
〔2〕宋红星，杨敏杰，刘淼，等.黄韧带的病理和胶原含量变化及其与颈椎管狭窄症的关系[J].中国脊柱脊髓杂志，2000,10(3)：154156.
〔3〕Takeshita K,Peterson ET,BylskiAustrow D,et al.The nuchal ligament restrains cervical spine flexion[J].Spine,2004,29(18):388393.
〔4〕王长峰，贾连顺，魏梅洋，等.颈椎黄韧带退变和脊髓型颈椎病的发病关系研究[J].中国脊柱脊髓杂志,2005，15(8)：486488.
〔5〕陈锋.脊髓型颈椎病脊髓微血管神经元微环境改变实验研究[J].中国矫形外科杂志,2004，12(13)：10091010., 百拇医药(王长峰,贾连顺,魏海峰,施政,杨诚,马俊民)