高效液相色谱_电化学检测法测定脱氧核糖核酸分子氧化损伤标志物8_羟基脱氧鸟苷.PDF
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袭著革 晁福寰 孙咏梅 杨丹凤 张华山
高效液相色谱电化学检测,脱氧核糖核酸氧化损伤,8-羟基脱氧鸟苷
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参见附件(80KB，3页)。
高效液相色谱_电化学检测法测定脱氧核糖核酸分子氧化损伤标志物8_羟基脱氧鸟苷.PDF
第29卷
2001年7月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第7期
765～767
高效液相色谱2电化学检测法测定脱氧核糖核酸分子
氧化损伤标志物82羟基脱氧鸟苷
袭著革3
晁福寰 孙咏梅 杨丹凤 张华山
(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津 300050)
摘 要 采用螯合剂2Fe
2 +
2H2O2 作为 Fenton型反应的氧化源 ,与小牛胸腺脱氧核糖核酸反应生成 82羟
基脱氧鸟苷(82OhdG) ,建立脱氧核糖核酸(DNA)分子氧化损伤的体外反应模型 ,用高效液相色谱2电化学
检测方法对82OhdG进行定量。建立的方法灵敏度高 ,最低检出限 30 fmol ,线性范围宽 ,从 0. 32 pmol 到
3. 2 nmol ,相关系数达0. 9996 ,方法能够适用于生物体与细胞脱氧核糖核酸分子低水平氧化损伤的检测。
关键词 高效液相色谱电化学检测 ,脱氧核糖核酸氧化损伤 ,82羟基脱氧鸟苷
2000208221收稿;2001204202接受
本文系中国博士后科学基金及军事医学科学院创新基金资助课题
1 引 言
外源性因素如电离辐射、化学毒物以及机体代谢产生的内源性物质均可引起 DNA 分子损伤 ,并以
DNA氧化损伤为主要类型 ,其机制为上述因素诱发自由基攻击 DNA 分子 ,表现为 DNA 单链断裂、双链
断裂、交联等碱基损伤以及分子水平上出现无嘌呤位点、 82羟基脱氧鸟嘌呤(82OhdG)等 ,其中 82OhdG加
合物被认为是细胞氧化应激损伤与癌变的重要生物标志物〔 1～4〕。由于方法学的限制 ,导致有关 82OhdG
的形成、遗传毒性效应、化学致癌过程中的作用等研究不够深入。本文应用液相色谱(HPLC) ,结合电化
学检测(EC) ,以 H2O2 作为外源性氧化剂 ,对螯合剂2Fe
2 +
2H2O22DNA 反应体系生成的 82OhdG及影响因
素进行了探讨 ,建立了痕量82OhdG的分析方法 ,为开展有关生物体系82OhdG形成与毒性机制研究奠定
了基础。
2 实验部分
2. 1 试剂
小牛胸腺DNA、核酸酶 P1、 E. coli 碱性磷酸酶、 82OhdG标准品均购自于 SIGMA公司 ,甲醇为国产色
谱纯 ,其他试剂为国产分析纯。流动相为缓冲溶液∶甲醇 = 3∶ 1 ,其中缓冲液为 0. 03 mmol L 柠檬酸
- 0. 02 mmol L 冰醋酸 - 0. 05 mmol L ,醋酸钠 - 0. 05 mmol L 氢氧化钠(pH = 6. 8) ,实验用水均为去离子
水并经二次蒸馏。
2. 2 仪器
510型液相色谱仪,配464电化学检测器(美国 Waters 公司) ,μ 2Bondapak C18 柱 ,4. 6 ×300 mm。电
化学检测器工作电极为玻璃碳电极 ,参比电极为饱和甘汞电极 ,工作电压为800 mV。
3 结果与讨论
3. 1 HPLC2EC条件优化
3. 1. 1 EC工作电位的选择 对82OhdG标准作流体伏安曲线如图 1 所示。结果表明:电极电位在 0～
600 mV间 ,峰电流随电压的增大而减小;600～800 mV间 ,峰电流随电压变化趋于平坦;大于 900 mV峰
电流随电压变化陡减 ,基流明显增加且信噪比下降 ,故电位选择在800 mV。
3. 1. 2 流动相的配比 配含0. 03 mol L 柠檬酸、 0. 02 mol L 冰乙酸、 0. 05 mol L 醋酸钠、 0. 05 mol L 氢 图1 82OhdG的伏安曲线
Fig. 1 Polarogramof 8 2hydroxy 22′ 2deoxyguanosine (82OhdG)
氧化钠的pH = 6. 8 的缓冲液 ,与甲醇组成不同比例
的流动相。将一定量的 82OhdG标准品溶解在浓度
为0. 005 mmol L 的柠檬酸和0. 02 mmol L 的氢氧化
钠溶液中 ,以0. 6 mL min流速进行 HPLC分析 ,以观
察流动相对82OhdG色谱保留时间和柱压力的影响 ,结果表明 ,缓冲液与甲醇比例分别为2∶ 1、 3∶ 1、 4∶ 1、 5
∶ 1 时 ,保留时间分别为 24. 80、 32. 10、 40. 55、 48. 20
min ,柱压力分别为 3. 79 ×105
、 3. 45 ×105
、 3. 10 ×
105
、 2176 ×105
kPa ......
2001年7月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第7期
765～767
高效液相色谱2电化学检测法测定脱氧核糖核酸分子
氧化损伤标志物82羟基脱氧鸟苷
袭著革3
晁福寰 孙咏梅 杨丹凤 张华山
(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津 300050)
摘 要 采用螯合剂2Fe
2 +
2H2O2 作为 Fenton型反应的氧化源 ,与小牛胸腺脱氧核糖核酸反应生成 82羟
基脱氧鸟苷(82OhdG) ,建立脱氧核糖核酸(DNA)分子氧化损伤的体外反应模型 ,用高效液相色谱2电化学
检测方法对82OhdG进行定量。建立的方法灵敏度高 ,最低检出限 30 fmol ,线性范围宽 ,从 0. 32 pmol 到
3. 2 nmol ,相关系数达0. 9996 ,方法能够适用于生物体与细胞脱氧核糖核酸分子低水平氧化损伤的检测。
关键词 高效液相色谱电化学检测 ,脱氧核糖核酸氧化损伤 ,82羟基脱氧鸟苷
2000208221收稿;2001204202接受
本文系中国博士后科学基金及军事医学科学院创新基金资助课题
1 引 言
外源性因素如电离辐射、化学毒物以及机体代谢产生的内源性物质均可引起 DNA 分子损伤 ,并以
DNA氧化损伤为主要类型 ,其机制为上述因素诱发自由基攻击 DNA 分子 ,表现为 DNA 单链断裂、双链
断裂、交联等碱基损伤以及分子水平上出现无嘌呤位点、 82羟基脱氧鸟嘌呤(82OhdG)等 ,其中 82OhdG加
合物被认为是细胞氧化应激损伤与癌变的重要生物标志物〔 1～4〕。由于方法学的限制 ,导致有关 82OhdG
的形成、遗传毒性效应、化学致癌过程中的作用等研究不够深入。本文应用液相色谱(HPLC) ,结合电化
学检测(EC) ,以 H2O2 作为外源性氧化剂 ,对螯合剂2Fe
2 +
2H2O22DNA 反应体系生成的 82OhdG及影响因
素进行了探讨 ,建立了痕量82OhdG的分析方法 ,为开展有关生物体系82OhdG形成与毒性机制研究奠定
了基础。
2 实验部分
2. 1 试剂
小牛胸腺DNA、核酸酶 P1、 E. coli 碱性磷酸酶、 82OhdG标准品均购自于 SIGMA公司 ,甲醇为国产色
谱纯 ,其他试剂为国产分析纯。流动相为缓冲溶液∶甲醇 = 3∶ 1 ,其中缓冲液为 0. 03 mmol L 柠檬酸
- 0. 02 mmol L 冰醋酸 - 0. 05 mmol L ,醋酸钠 - 0. 05 mmol L 氢氧化钠(pH = 6. 8) ,实验用水均为去离子
水并经二次蒸馏。
2. 2 仪器
510型液相色谱仪,配464电化学检测器(美国 Waters 公司) ,μ 2Bondapak C18 柱 ,4. 6 ×300 mm。电
化学检测器工作电极为玻璃碳电极 ,参比电极为饱和甘汞电极 ,工作电压为800 mV。
3 结果与讨论
3. 1 HPLC2EC条件优化
3. 1. 1 EC工作电位的选择 对82OhdG标准作流体伏安曲线如图 1 所示。结果表明:电极电位在 0～
600 mV间 ,峰电流随电压的增大而减小;600～800 mV间 ,峰电流随电压变化趋于平坦;大于 900 mV峰
电流随电压变化陡减 ,基流明显增加且信噪比下降 ,故电位选择在800 mV。
3. 1. 2 流动相的配比 配含0. 03 mol L 柠檬酸、 0. 02 mol L 冰乙酸、 0. 05 mol L 醋酸钠、 0. 05 mol L 氢 图1 82OhdG的伏安曲线
Fig. 1 Polarogramof 8 2hydroxy 22′ 2deoxyguanosine (82OhdG)
氧化钠的pH = 6. 8 的缓冲液 ,与甲醇组成不同比例
的流动相。将一定量的 82OhdG标准品溶解在浓度
为0. 005 mmol L 的柠檬酸和0. 02 mmol L 的氢氧化
钠溶液中 ,以0. 6 mL min流速进行 HPLC分析 ,以观
察流动相对82OhdG色谱保留时间和柱压力的影响 ,结果表明 ,缓冲液与甲醇比例分别为2∶ 1、 3∶ 1、 4∶ 1、 5
∶ 1 时 ,保留时间分别为 24. 80、 32. 10、 40. 55、 48. 20
min ,柱压力分别为 3. 79 ×105
、 3. 45 ×105
、 3. 10 ×
105
、 2176 ×105
kPa ......
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