第29卷

    2001年7月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第7期

    825～827

    虫荧光素酶报告基因用于二 英类化学物质的检测

    张志仁3

    徐顺清 周宜开 任 恕 刘志伟

    (华中科技大学同济医学院环境医学研究所 ,武汉 430030)

    摘 要 虫萤光素酶报告基因检测二 英类化学物质与传统的 EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优

    于 EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。适合大量样本的快速筛选及半定量检测。

    关键词 二 英 ,虫荧光素酶 ,报告基因

    2000209212收稿;2001204202接受

    本文系国家自然科学基金资助课题(No. 29877020)

    1 引 言

    二 英类化学物质在环境中广泛存在,毒性作用剂量低且易于生物富集 ,是重要的环境污染物〔 1〕。

    二 英类化学物质的监测属于痕量多组份分析 ,通常采用的色质联用法不仅对实验环境和人员有很高

    要求 ,而且需耗费大量的时间和财力 ,在实际应用中不易于开展。

    二 英类物质产生毒性作用需要与机体细胞核内的二 英反应增强子结合 ,诱导机体的特异基因

    (主要为 CYP1A1)表达〔 2〕,用于二 英类物质生物监测的方法就是依据这个原理 ,检测特异基因的表达

    产物(如72乙氧基2异吩 唑酮2脱乙基酶( EROD)

    〔 3〕。据此我们构建一质粒 ,使虫荧光素酶报告基因在

    二 英反应增强子的调控之下 ,将该质粒转染入细胞 ,建立一含重组质粒的稳定细胞珠 ,该细胞株可用

    于二 英类物质的检测。

    2 实验部分

    211 主要仪器

    22R低温离心机(德国MIKRO公司) ;恒温水浴摇床(江苏太仓市实验设备厂) ;2350MP型二氧化碳

    培养箱(美国 SHELL2AB公司) ;LB9507型弱光仪(美国 EG公司) ;H51300超净工作台。

    212 主要试剂

    HindⅢ,BgL Ⅱ,BamhⅠ,EcoRⅤ限制性内切酶; PGL32Prometer 载体(Promega 公司) ;2 ,3 ,7 ,82四氯代

    二苯并二 英(TCDD)标准品(Accustands Inc. ) 。

    2. 3 重组质粒的构建

    质粒pHAV和 pMcat (美国哈佛大学医学院J . P. Whitlock 教授馈赠) ,分别含二 英反应增强子和

    MMTV启动子。酶切后以 T4DNA连接酶连接得含增强子和启动子的目的片段。pGL32Prometer 载代(含

    虫荧光素酶报告基因) HindⅢ和BgL Ⅱ酶切去除了 SV40 启动子 ,与目的片段连接。连接产物转化感受

    态菌 ,于含Amp LB培养基上选择性生长 ,转化菌落酶切鉴定。

    214 细胞的培养,短暂、稳定转染及酶活性诱导

    人类肝肿瘤细胞株 HepG2 (中国武汉典型培养物保藏中心) 1640 培养基(Gibco)加入 10 %热灭活胎

    牛血清 ,于37度 ,5 %二氧化碳浓度下培养。细胞的短暂转染采用磷酸钙共沉淀法〔 4〕,细胞的稳定转染

    采用重组质粒(15μg) 和选择质粒 PTK 2Hyg (Clontech 公司) (15μg) 磷酸钙共沉淀法〔 5〕。荧光素酶和

    EROD的诱导分析方法参照徐盈和Aarts等的方法〔 6 ,7〕。

    215 数据的统计分析

    每个标准浓度做3个平行样,取其平均值 ,TCDD与酶活性间的关系采用 Excel 进行回归分析 ,计算

    检测下限。检测下限定义为实验空白平均值加上3倍标准差。3 结果与讨论

    311 重组质粒的鉴定

    重组质粒和载体 HindⅢ和BgL Ⅱ酶切电泳图谱见图 1 ......