高速逆流色谱研究进展.PDF
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戴德舜 王义明 罗国安
高速逆流色谱,溶剂选择,天然产物,抗生素,蛋白质,无机物,质谱,pH,区带逆流色谱,离子对逆流色谱,评述
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参见附件(94KB，6页)。
高速逆流色谱研究进展.PDF
评述与进展
高速逆流色谱研究进展
戴德舜 王义明 罗国安3
(清华大学分析中心 ,北京 100084)
摘 要 综述了近年来高速逆流色谱(HSCCC)在分析、半制备和制备分离天然产物、蛋白质、抗生素、无
机物等领域的研究和应用进展 ,总结了适用于 HSCCC的溶剂体系 ,并展望了 HSCCC与质谱联用、 pH区
带逆流色谱和离子对逆流色谱新技术的应用前景。
关键词 高速逆流色谱 ,溶剂选择 ,天然产物 ,抗生素 ,蛋白质 ,无机物 ,质谱 ,pH区带逆流色谱 ,离子对
逆流色谱 ,评述
2000204217收稿;2000210217接受
本文系国家重大基础研究计划资助项目(G1999054404)
1 引 言
高速逆流色谱(high2speed countercurrent chromatography ,简称 HSCCC)是由美国国立卫生院 Ito 博士研
制开发的新型色谱技术 ,可以在短时间内实现高效分离和制备 ,并且可以达到几千个理论塔板数〔 1 ,2〕。
与高效液相色谱(HPLC)不同的是 ,它不使用固相载体作固定相 ,克服了固相载体带来的样品吸附、损
失、污染和峰形拖尾等缺点〔 3〕。最初 HSCCC主要的目的是进行制备型分离 ,一般用紫外检测器作样品
检测。80年代以后 ,随着逆流色谱仪的改进和完善 ,HSCCC的分析能力大大提高 ,其应用范围已从制备
量级扩展到微量分析〔 4〕。鉴于 HSCCC的显著特点 ,此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产
物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域〔 5〕。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应
用的国家。张天佑教授领导的研究小组在国内最先自行研制了分析型和制备型的高速逆流色谱仪〔 3〕,研究水平处于国际领先地位 ,尤其对天然产物的分离制备 ,作出了特色性的成果 ,在很多方面独树一帜。
本文对高速逆流色谱的最新研究进展作一综述。
2 高速逆流色谱仪及溶剂体系简介
2. 1 高速逆流色谱仪
HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象 ,使两个互不相溶的溶剂相在高
速旋转的螺旋管中单向分布。其中一相作固定相 ,由恒流泵输送载着样品的流动相穿过固定相 ,利用样
品在两相中分配系数的不同实现分离〔 2 ,3 ,5〕。最初的高速逆流色谱仪利用多层螺旋管作同步行星运动 ,只用一个支持件(holder) ,用配重平衡离心体系。最近的仪器在设计上有较大突破 ,降低配重质量或不
用配重 ,采用两个或更多对称的支持件〔 6〕,性能和实用能力大大提高。较大的制备型 HSCCC ,柱容积可
达530 mL ,一次最多进样可达20 g粗品;较小的分析型的 HSCCC柱容积为8 mL ,进样量为几十微克 ,最
大转速可达4000 r min ,分析能力与 HPLC相媲美。
在常用的 HSCCC 基础上 , 有人提出双向模式的高速逆流色谱〔 7〕( dual2mode countercurrent
chromatography ,简称DCCC) ,即前一次的流动相作下一次的固定相 ,洗脱方向相反。与常规的 HSCCC相
比 ,DCCC可以降低制备时间 ,免去柱冲洗时间 ,提高分离效率 ,不必预测溶质的保留时间和分配系数 ,减少了溶剂选择的繁琐。但目前由于溶剂体系系统不完善 ,应用范围较窄。
第29卷
2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 评述与进展
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第5期
586～5912. 2 两相溶剂体系的选择和优化
根据色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数〔 8〕。溶剂体系的选择对于 HSCCC十分关
键 ,一般根据实验积累的经验 ,而没有更充分的理论依据。溶剂选择的困难也制约了逆流色谱的应用。
通常来说 ,两相溶剂体系应满足以下要求〔 6 ,9〕: ⑴为了保证固定相保留值合适(不低于 50 %) ,溶剂体系
的分层时间小于30 s ; ⑵目标样品的分配系数 K接近于1 ,容量因子应大于1. 5 ; ⑶上下两相的体积大致
相等 ,以免浪费溶剂; ⑷尽量采用挥发性溶剂 ,以方便后续处理 ,易于物质纯化。Ito 根据在螺旋管中行
星运动的溶剂流体力学特性将溶剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系〔 3〕。按照上述四个条件 ,以下
两种疏水性范围很宽的体系对很多样品都比较适合:正己烷乙酸乙酯正丁醇甲醇水;氯仿甲醇
水。对于未知样品混合物 , Ito 认为一般先采用正己烷乙酸乙酯甲醇水(1∶ 1∶ 1∶ 1)或氯仿甲醇水(10
∶ 3∶ 7)尝试 ,再根据目标组分的分配系数调整溶剂组成〔 9〕。如果需要疏水性更强的体系 ,建议用乙醇代
替甲醇;需要亲水性更强的体系 ,加入盐(乙酸铵等)或酸(三氟乙酸或乙酸) 。还有人提出正丁醇乙酸
乙酯水(3∶ 2∶ 5)适于分离极性大的物质 ,而正庚醇乙酸乙酯甲醇水(6∶ 1∶ 6∶ 1)适于弱极性和非极性
体系〔 10〕。
近年来 ,溶剂体系的选择范围越来越广泛。只要满足 4 个基本条件 ,可根据样品的化学性质 ,自由
选择溶剂。有人提出用超临界二氧化碳(SFCO2)作流动相〔 11〕,利用 SFCO2 高扩散性、低粘度、流体特性、环境友好等其他有机溶剂不可比拟的优势〔 12〕,分离 3 种甾族化合物〔 13〕:黄体酮 ,Δ4
2雄甾酮23 ,172土卫
四 , ( + )242cholesten232 one。固定相是乙醇2水(30∶ 70 V V) ,实验的最优条件是 40 ℃,10MPa。有人提出
用制冷剂 R134a (1 ,1 ,1 ,22tetrafluoroethane)作流动相的可能性。其相对于 SFCO2 ,甲醇2SFCO2保留值更
高 ,适用于极性体系。由于 R134a 的化学性质与氯仿相近 ,溶剂体系一般采用甲醇2水作固定相〔 14〕。由
于这种流动相在常温常压下是气体 ,当样品从柱中流出 ,流动相常压下变为气体 ,即得纯品 ,不必再富集
或蒸干溶剂收集 ,从而避免了纯品的损失。有人提出当准确了解两相组成后 ,可以独立配制上下两相 ,避免溶剂的浪费〔 15〕。
3 最新研究进展
3. 1 天然产物
HSCCC可采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件 ,具有较强的适应性 ,为从复杂的天
然产物粗制品中提取不同特性(如不同极性)的有效成分提供了有利条件。因此在80年代后期 ,在世界
范围内的“回归大自然”浪潮的席卷之下 ,HSCCC被大量用于天然产物化学成分的分析和制备分离〔 16〕,目前报道也最多。
例如:用正己烷乙酸乙酯甲醇水(3∶ 7∶ 5∶ 5)分离粉防己干根粗提物〔 5〕;正己烷乙酸乙酯乙醇
水(6∶ 3∶ 2∶ 5)或正己烷乙酸乙酯甲醇水(1∶ 1∶ 1∶ 1)体系分离红豆杉粗提物〔 5〕;分离紫杉醇混合物采用
石油醚(40～60 ℃) 乙酸乙酯甲醇水(50∶ 70∶ 80∶ 65)体系比较合适〔 5〕;采用正己烷乙酸乙酯甲醇水
(3∶ 7∶ 5∶ 5)有效分离肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸混合物〔 5〕;采用正己烷乙酸乙酯甲醇乙醇水(5∶ 7∶ 5∶ 1∶
1. 5)五元体系分离紫杉醇和caphalomannine
〔 17〕;氯仿 0. 07 mol L 磷酸钠、 0. 04 mol L 柠檬酸缓冲液体系
(pH = 5108 ,1∶ 1)分离制备马钱子碱和番木鳖碱〔 18〕;用氯仿甲醇丙酮水(5∶ 6∶ 1∶ 4)分离挪威云杉针叶
粗提物〔 19〕;用正庚烷乙酸乙酯甲醇水(3∶ 10∶ 10∶ 7)分离杂交番茄枝种子的粗提物〔 20〕 等等 ,一般均采
用下相作流动相 ......
高速逆流色谱研究进展
戴德舜 王义明 罗国安3
(清华大学分析中心 ,北京 100084)
摘 要 综述了近年来高速逆流色谱(HSCCC)在分析、半制备和制备分离天然产物、蛋白质、抗生素、无
机物等领域的研究和应用进展 ,总结了适用于 HSCCC的溶剂体系 ,并展望了 HSCCC与质谱联用、 pH区
带逆流色谱和离子对逆流色谱新技术的应用前景。
关键词 高速逆流色谱 ,溶剂选择 ,天然产物 ,抗生素 ,蛋白质 ,无机物 ,质谱 ,pH区带逆流色谱 ,离子对
逆流色谱 ,评述
2000204217收稿;2000210217接受
本文系国家重大基础研究计划资助项目(G1999054404)
1 引 言
高速逆流色谱(high2speed countercurrent chromatography ,简称 HSCCC)是由美国国立卫生院 Ito 博士研
制开发的新型色谱技术 ,可以在短时间内实现高效分离和制备 ,并且可以达到几千个理论塔板数〔 1 ,2〕。
与高效液相色谱(HPLC)不同的是 ,它不使用固相载体作固定相 ,克服了固相载体带来的样品吸附、损
失、污染和峰形拖尾等缺点〔 3〕。最初 HSCCC主要的目的是进行制备型分离 ,一般用紫外检测器作样品
检测。80年代以后 ,随着逆流色谱仪的改进和完善 ,HSCCC的分析能力大大提高 ,其应用范围已从制备
量级扩展到微量分析〔 4〕。鉴于 HSCCC的显著特点 ,此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产
物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域〔 5〕。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应
用的国家。张天佑教授领导的研究小组在国内最先自行研制了分析型和制备型的高速逆流色谱仪〔 3〕,研究水平处于国际领先地位 ,尤其对天然产物的分离制备 ,作出了特色性的成果 ,在很多方面独树一帜。
本文对高速逆流色谱的最新研究进展作一综述。
2 高速逆流色谱仪及溶剂体系简介
2. 1 高速逆流色谱仪
HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象 ,使两个互不相溶的溶剂相在高
速旋转的螺旋管中单向分布。其中一相作固定相 ,由恒流泵输送载着样品的流动相穿过固定相 ,利用样
品在两相中分配系数的不同实现分离〔 2 ,3 ,5〕。最初的高速逆流色谱仪利用多层螺旋管作同步行星运动 ,只用一个支持件(holder) ,用配重平衡离心体系。最近的仪器在设计上有较大突破 ,降低配重质量或不
用配重 ,采用两个或更多对称的支持件〔 6〕,性能和实用能力大大提高。较大的制备型 HSCCC ,柱容积可
达530 mL ,一次最多进样可达20 g粗品;较小的分析型的 HSCCC柱容积为8 mL ,进样量为几十微克 ,最
大转速可达4000 r min ,分析能力与 HPLC相媲美。
在常用的 HSCCC 基础上 , 有人提出双向模式的高速逆流色谱〔 7〕( dual2mode countercurrent
chromatography ,简称DCCC) ,即前一次的流动相作下一次的固定相 ,洗脱方向相反。与常规的 HSCCC相
比 ,DCCC可以降低制备时间 ,免去柱冲洗时间 ,提高分离效率 ,不必预测溶质的保留时间和分配系数 ,减少了溶剂选择的繁琐。但目前由于溶剂体系系统不完善 ,应用范围较窄。
第29卷
2001年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 评述与进展
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第5期
586～5912. 2 两相溶剂体系的选择和优化
根据色谱理论,样品分离的必要条件是合适的分配系数〔 8〕。溶剂体系的选择对于 HSCCC十分关
键 ,一般根据实验积累的经验 ,而没有更充分的理论依据。溶剂选择的困难也制约了逆流色谱的应用。
通常来说 ,两相溶剂体系应满足以下要求〔 6 ,9〕: ⑴为了保证固定相保留值合适(不低于 50 %) ,溶剂体系
的分层时间小于30 s ; ⑵目标样品的分配系数 K接近于1 ,容量因子应大于1. 5 ; ⑶上下两相的体积大致
相等 ,以免浪费溶剂; ⑷尽量采用挥发性溶剂 ,以方便后续处理 ,易于物质纯化。Ito 根据在螺旋管中行
星运动的溶剂流体力学特性将溶剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系〔 3〕。按照上述四个条件 ,以下
两种疏水性范围很宽的体系对很多样品都比较适合:正己烷乙酸乙酯正丁醇甲醇水;氯仿甲醇
水。对于未知样品混合物 , Ito 认为一般先采用正己烷乙酸乙酯甲醇水(1∶ 1∶ 1∶ 1)或氯仿甲醇水(10
∶ 3∶ 7)尝试 ,再根据目标组分的分配系数调整溶剂组成〔 9〕。如果需要疏水性更强的体系 ,建议用乙醇代
替甲醇;需要亲水性更强的体系 ,加入盐(乙酸铵等)或酸(三氟乙酸或乙酸) 。还有人提出正丁醇乙酸
乙酯水(3∶ 2∶ 5)适于分离极性大的物质 ,而正庚醇乙酸乙酯甲醇水(6∶ 1∶ 6∶ 1)适于弱极性和非极性
体系〔 10〕。
近年来 ,溶剂体系的选择范围越来越广泛。只要满足 4 个基本条件 ,可根据样品的化学性质 ,自由
选择溶剂。有人提出用超临界二氧化碳(SFCO2)作流动相〔 11〕,利用 SFCO2 高扩散性、低粘度、流体特性、环境友好等其他有机溶剂不可比拟的优势〔 12〕,分离 3 种甾族化合物〔 13〕:黄体酮 ,Δ4
2雄甾酮23 ,172土卫
四 , ( + )242cholesten232 one。固定相是乙醇2水(30∶ 70 V V) ,实验的最优条件是 40 ℃,10MPa。有人提出
用制冷剂 R134a (1 ,1 ,1 ,22tetrafluoroethane)作流动相的可能性。其相对于 SFCO2 ,甲醇2SFCO2保留值更
高 ,适用于极性体系。由于 R134a 的化学性质与氯仿相近 ,溶剂体系一般采用甲醇2水作固定相〔 14〕。由
于这种流动相在常温常压下是气体 ,当样品从柱中流出 ,流动相常压下变为气体 ,即得纯品 ,不必再富集
或蒸干溶剂收集 ,从而避免了纯品的损失。有人提出当准确了解两相组成后 ,可以独立配制上下两相 ,避免溶剂的浪费〔 15〕。
3 最新研究进展
3. 1 天然产物
HSCCC可采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件 ,具有较强的适应性 ,为从复杂的天
然产物粗制品中提取不同特性(如不同极性)的有效成分提供了有利条件。因此在80年代后期 ,在世界
范围内的“回归大自然”浪潮的席卷之下 ,HSCCC被大量用于天然产物化学成分的分析和制备分离〔 16〕,目前报道也最多。
例如:用正己烷乙酸乙酯甲醇水(3∶ 7∶ 5∶ 5)分离粉防己干根粗提物〔 5〕;正己烷乙酸乙酯乙醇
水(6∶ 3∶ 2∶ 5)或正己烷乙酸乙酯甲醇水(1∶ 1∶ 1∶ 1)体系分离红豆杉粗提物〔 5〕;分离紫杉醇混合物采用
石油醚(40～60 ℃) 乙酸乙酯甲醇水(50∶ 70∶ 80∶ 65)体系比较合适〔 5〕;采用正己烷乙酸乙酯甲醇水
(3∶ 7∶ 5∶ 5)有效分离肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸混合物〔 5〕;采用正己烷乙酸乙酯甲醇乙醇水(5∶ 7∶ 5∶ 1∶
1. 5)五元体系分离紫杉醇和caphalomannine
〔 17〕;氯仿 0. 07 mol L 磷酸钠、 0. 04 mol L 柠檬酸缓冲液体系
(pH = 5108 ,1∶ 1)分离制备马钱子碱和番木鳖碱〔 18〕;用氯仿甲醇丙酮水(5∶ 6∶ 1∶ 4)分离挪威云杉针叶
粗提物〔 19〕;用正庚烷乙酸乙酯甲醇水(3∶ 10∶ 10∶ 7)分离杂交番茄枝种子的粗提物〔 20〕 等等 ,一般均采
用下相作流动相 ......
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