固定化葡萄糖氧化酶活性的 X射线微区分析

    黄永章 姚子华3

    王桂华 仇满德 (河北大学理化分析中心 ,保定 071002)

    摘 要 利用 X射线微区分析方法 ,对固定化活性葡萄糖氧化酶进行了定位分析;葡萄糖作为底物 ,FeSO4 和

    KI作为捕捉剂 ,底物经固定化葡萄糖氧化酶催化产生 H2O2 ,后者和捕捉剂反应生成沉淀 ,可以确定固定化葡

    萄糖氧化酶的催化活性部位。结果表明:颗粒越小 ,酶活越高 ,活性葡萄糖氧化酶在凝胶内分布均匀 ,且绝大

    多数葡萄糖氧化酶固定在凝胶的内部。作者还研究了固定化活性葡萄糖氧化酶定位的最佳条件。

    关键词 X射线微区分析 ,固定化葡萄糖氧化酶 ,活性

    2001201206收稿;2001208213接受

    1 引 言

    固定化葡萄糖氧化酶的研究长期以来是倍受关注的研究课题〔 1～3〕。包埋固化法〔 4〕是一种常用的方

    法 ,该方法把酶定位于聚合物材料或膜的格子结构中 ,这样可防止酶蛋白释放。由于酶和载体间没有结

    合作用 ,故酶活性高。如果能对固定化活性葡萄糖氧化酶进行定位 ,清晰地确定凝胶中活性葡萄糖氧化

    酶的分布 ,将有助于葡萄糖氧化酶的固定化研究。

    固定化酶进行活性定位的基本原理是:

    底物 酶 产物 +捕获剂(金属离子) 活性部位沉淀

    利用聚焦电子束对固定化酶表面进行激发 ,有活性的部位发射出沉淀金属的特征 X射线 ,通过 X

    射线能谱分析即可定位酶的活性部位。本工作研究了利用 X射线微区分析对凝胶中活性葡萄糖氧化

    酶定位的可能性和最佳定位条件 ,并对凝胶粒径大小与固定化葡萄糖氧化酶酶活性的关系进行了研究。

    2 实验部分

    2. 1 材料及仪器

    KYKY 21000B扫描电镜(附 TN25400X射线能谱仪) ; Si (Li)探测器(Be 窗厚7. 6μm;测量范围Na2U) ;

    含不同量的葡萄糖氧化酶及不同颗粒的固定化葡萄糖氧化酶(自制) ,葡萄糖为分析纯及 KI (10 gP L)和

    FeSO4 (10 gP L)水溶液 ,葡萄糖氧化酶(GOD)为日本 Toyobo 公司产品(122 uP mg) 。

    2. 2 酶的固定化

    本文采用溶胶凝胶技术〔 5〕制备了固定化葡萄糖氧化酶。用研磨方法获得不同粒径的固定化葡萄糖

    氧化酶。

    2. 3 固定化葡萄糖氧化酶的孵育

    向50 mL 的小烧杯中加入0. 1 molP L 醋酸缓冲溶液(pH = 5. 6) 5 mL ,KI和 FeSO4 各 10 mg ,再加入葡

    萄糖0. 9 g以及固定化葡萄糖氧化酶0. 01 g ,水浴孵育1 h后 ,将固定化葡萄糖氧化酶滤出 ,用蒸馏水漂

    洗干净。

    2. 4 固定化葡萄糖氧化酶的对照实验

    除了孵育液中未加入葡萄糖外 ,其余所加试剂和操作与2. 3相同。

    2. 5 不同条件下固定化葡萄糖氧化酶的孵育

    改变孵育液中一种试剂的加入量 ,其余试剂的量不变 ,操作与2. 3相同。

    第29卷

    2001年12月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第12期

    1434～14362. 6 X射线微区分析

    将制备好的试样用 SEM进行形貌观察。对上述样品随机采集6次 X射线能谱 ,得到对应谱图。利

    用 TN25400图像处理系统的 IPP程序分别对上述样品进行 Fe 元素的 X射线面分布采集。

    3 结果与讨论

    3. 1 固定化 GOD与捕捉剂的反应

    图1a 上没有 Fe 峰出现 ,说明固定化 GOD不与捕捉剂发生作用 ,从而排除了捕捉剂对固定化 GOD

    的干扰。图1b中有明显的 Fe 峰出现 ,这是因为:在消除了上述干扰的情况下 ,葡萄糖在固定化 GOD作

    图1 孵育后的固定化 GOD(未加底物)的谱图(a)和孵育后的固定化 GOD的谱图(b)

    Fig. 1 The spectra of immobilized glucose oxidase (GOD) incubated (without substrate) (a) and the spectra

    of immobilized GOD incubated (b)

    用下产生 H2O2 ,H2O2 被 FeI 2 捕捉形成沉淀 ,并沉积在固定化 GOD酶有活性部位 ,所以谱图上出现了 Fe

    峰 ,证明了该方法的可行性及所测定的区域内有活性 GOD存在 ......