芯片式流通池顺序注射可更新表面反射光谱法用于酶反应检测.PDF
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王建雅 方肇伦 徐淑坤
芯片式流通池,顺序注射可更新表面,反射光谱,酶反应
第1页 |
参见附件(181KB,5页)。
芯片式流通池顺序注射可更新表面反射光谱法用于酶反应检测.PDF
芯片式流通池顺序注射可更新
表面反射光谱法用于酶反应检测
王建雅 方肇伦3
徐淑坤 (东北大学分析科学研究中心 , 沈阳 110004)
摘 要 将芯片式流通池顺序注射可更新表面反射光谱法用于酶反应检测。HRP催化 H2O2 氧化 BPR底物
的反应用于对 H2O2 的检测。此反应体系与葡萄糖氧化酶联用 ,用于对血清中葡萄糖的检测。
关键词 芯片式流通池 ,顺序注射可更新表面 ,反射光谱 ,酶反应
2001204220收稿;2001208210接受
本文系教育部科学技术研究重点项目(No. 2000031)
1 引 言
将固体微珠做为试剂的载体, 通过流动注射或顺序注射系统将微珠注入检测系统并随后排废的流
动注射可更新表面技术(FI 2RST ,flow injection renewable surface technique)是流动注射分析的前沿领域之
一1
,该技术在痕量分析及生物分析中仍处于发展初期。具有可对微珠进行截留和排放功能的流通池
是 FI - RST系统的关键部件 ,适合于不同检测方法的流通池已见报道2 ~7。本文提出了一种加工简便、结构简单的新型芯片式流通池 ,将其用于流动注射可更新表面反射光谱法检测。以过氧化物酶催化 ,显
色的氢授体底物与 H2O2 反应的分光光度法检测 H2O2 已被广泛地用于生物分析中。近来文献报道了无
偶联剂的偶氮萘酚衍生物8
作为氢授体用于此类检测。本文将溴代邻苯三酚红( bromopyrogallol red ,BPR) 、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase , HRP) 、 H2O2 催化反应体系用于对 H2O2 的检测 ,并与葡萄
糖氧化酶(glucose oxidase , GOD)催化体系联用 , 用于检测葡萄糖。
2 实验部分
2. 1 试剂
辣根过氧化物酶(E. C. 1. 11. 1. 7 , 268 U mg , RZ > 3. 1 , Sigma) 。葡萄糖氧化酶(115 U mg , Toyobo
Co. , Ltd . , Japan) 。血糖试剂盒(GLU Kit , 北京北化精细化学品公司) 。溴代邻苯三酚红(上海试剂三
厂) 。Polysorb ACT 21 C218微珠(Transgenomic , Omaha , USA) , 微珠直径 20~60μm。实验中所用试剂均
为分析纯 ,去离子水经脱气处理。
2. 2 仪器
顺序注射(SI)系统由ASD210注射泵(Bodenseewerk , Perkin2Elmer , Uberlingen , Germany)和 10 位选择
阀(Valco , Houston , TX , USA)组成 ,配5 mL 针筒。选择阀和注射泵的操作由计算机同步控制。自制直
径20 mm铜芯加热棒 ,30 W,XMT 2数显控温仪(CHNT Group Corporation ,China)控温 ±1. 0℃,加热棒密闭
于套管中。722型光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂) 。LM142164型记录仪(上海大华仪表厂) 。自
制的芯片式流通池(详见文献9)通过一根多股双岔光纤与检测器相耦合 ,流通池固定在分光光度计的
液槽室中。可更新反应表面的反射光在556 nm处检测。流通池采用3层组合结构 ,上层有机玻璃片上
设出入孔 , 与内径0. 75 mm的聚四氟乙烯导管相接。中间层500μm厚的硅橡胶膜刻有宽 1. 8 mm流通
池通道 ,通道中部嵌入孔径20μm的多孔滤层。多股双岔反射式光纤一臂将光源 556 nm入射光导至流
通池中微珠所在检测区 ,另一臂将微珠表面反射光导至检测器。流通池与 SI系统用 25 cm长、 0. 7 mm
i . d.的聚四氟乙烯管相连接。贮存管 HC直径 0. 96 mm ,长 150 cm ,体积为 1100μ L。废液贮存管 WHC
直径0. 96 mm ,长56 cm ,体积为400μ L。多位阀与微珠悬浮液储瓶连接的管道直径为0. 7 mm ,长20 cm。
第30卷
2002年3月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第3期
307~311 图1 流动注射可更新表面检测系统
Fig. 1 Flow injection renewable surface assay system
a. SI 2RST系统示意图( schematic diagram of the sequential injection2
renewable surface technique (SI 2RST) system) 。C. 载流(H2O carrier) ;
SP.泵( syringe pump ) ; HC. 贮存管 ( holding coil ) ; Heater. 加热棒
(heating rod ) ; MPV. 多位阀 (multiposition valve ) ; VSP. 注入阀
(syringe valve ) ; FC. 流通池 (microchip flow cell ) ; REC. 记录仪
(recorder) ;L.卤素灯(light) ;D.检测器(detector) ; WHC.废液贮存
管(waste holding coil) ; Bead. 微珠(2. 4 g L bead suspension) 。b. 样
带顺序(schematic diagramof the sequence of zones in HCwhen step 12 of
Table 1) Pho. 缓冲溶液 (phosphate buffer ) ; BHP. 试剂 (mixture of
bromopyrogallol red (BPR) , horseradish peroxidase (HRP) and buffer) 。
与其它试液储瓶间连接管道直径为 0. 5 mm。微
珠悬浮液储瓶置于 45°倾角保持旋转以维持微珠
的悬浮。
2. 3 实验方法
2. 3. 1 溶液的配制 HRP储备液40 U mL , GOD
储备液 11. 5 U mL , BPR 储备液 2 ×10 - 4
mol L ,均在 4 ℃冰箱中保存。H2O2 储备液以 KMnO4 标
定 ,H2O2 溶液使用时新配。磷酸盐缓冲溶液配
制:34. 0 g KH2PO4 溶于 500 mL H2O ,加入 90 mL
0. 5 mol L KOH并调节至pH 6. 2。C218 微珠悬浮
液的配制:先将微珠以少量乙醇润湿 ,然后加水稀
释成2. 4 × 10 - 3
g mL。
2. 3. 2 SI 2RST检测系统及检测过程 SI 2RST检
测系统结构见图 1a。SI 系统从流通池入口端将
微珠悬浮液、试剂、试样等注入流通池 ,检测器实
时监测微珠表面并记录。检测结束后 SI泵以反
向流将微珠及废液从此端吸出流通池并排废。SI
系统计算机控制程序见表 1。反应液吸入 HC中
区带排列顺序见图 1b。检测过程中实时记录的
吸光度2时间曲线见图 2。酶反应底物 BPR 在微
珠表面的吸附线性范围的测定过程按表 1 进行 ,但省去6222步 ,加一步吸入BPR试样。
表1 SI系统操作程序
Table 1 Sequence of operation of the sequential injection system ......
表面反射光谱法用于酶反应检测
王建雅 方肇伦3
徐淑坤 (东北大学分析科学研究中心 , 沈阳 110004)
摘 要 将芯片式流通池顺序注射可更新表面反射光谱法用于酶反应检测。HRP催化 H2O2 氧化 BPR底物
的反应用于对 H2O2 的检测。此反应体系与葡萄糖氧化酶联用 ,用于对血清中葡萄糖的检测。
关键词 芯片式流通池 ,顺序注射可更新表面 ,反射光谱 ,酶反应
2001204220收稿;2001208210接受
本文系教育部科学技术研究重点项目(No. 2000031)
1 引 言
将固体微珠做为试剂的载体, 通过流动注射或顺序注射系统将微珠注入检测系统并随后排废的流
动注射可更新表面技术(FI 2RST ,flow injection renewable surface technique)是流动注射分析的前沿领域之
一1
,该技术在痕量分析及生物分析中仍处于发展初期。具有可对微珠进行截留和排放功能的流通池
是 FI - RST系统的关键部件 ,适合于不同检测方法的流通池已见报道2 ~7。本文提出了一种加工简便、结构简单的新型芯片式流通池 ,将其用于流动注射可更新表面反射光谱法检测。以过氧化物酶催化 ,显
色的氢授体底物与 H2O2 反应的分光光度法检测 H2O2 已被广泛地用于生物分析中。近来文献报道了无
偶联剂的偶氮萘酚衍生物8
作为氢授体用于此类检测。本文将溴代邻苯三酚红( bromopyrogallol red ,BPR) 、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase , HRP) 、 H2O2 催化反应体系用于对 H2O2 的检测 ,并与葡萄
糖氧化酶(glucose oxidase , GOD)催化体系联用 , 用于检测葡萄糖。
2 实验部分
2. 1 试剂
辣根过氧化物酶(E. C. 1. 11. 1. 7 , 268 U mg , RZ > 3. 1 , Sigma) 。葡萄糖氧化酶(115 U mg , Toyobo
Co. , Ltd . , Japan) 。血糖试剂盒(GLU Kit , 北京北化精细化学品公司) 。溴代邻苯三酚红(上海试剂三
厂) 。Polysorb ACT 21 C218微珠(Transgenomic , Omaha , USA) , 微珠直径 20~60μm。实验中所用试剂均
为分析纯 ,去离子水经脱气处理。
2. 2 仪器
顺序注射(SI)系统由ASD210注射泵(Bodenseewerk , Perkin2Elmer , Uberlingen , Germany)和 10 位选择
阀(Valco , Houston , TX , USA)组成 ,配5 mL 针筒。选择阀和注射泵的操作由计算机同步控制。自制直
径20 mm铜芯加热棒 ,30 W,XMT 2数显控温仪(CHNT Group Corporation ,China)控温 ±1. 0℃,加热棒密闭
于套管中。722型光栅分光光度计(山东高密分析仪器厂) 。LM142164型记录仪(上海大华仪表厂) 。自
制的芯片式流通池(详见文献9)通过一根多股双岔光纤与检测器相耦合 ,流通池固定在分光光度计的
液槽室中。可更新反应表面的反射光在556 nm处检测。流通池采用3层组合结构 ,上层有机玻璃片上
设出入孔 , 与内径0. 75 mm的聚四氟乙烯导管相接。中间层500μm厚的硅橡胶膜刻有宽 1. 8 mm流通
池通道 ,通道中部嵌入孔径20μm的多孔滤层。多股双岔反射式光纤一臂将光源 556 nm入射光导至流
通池中微珠所在检测区 ,另一臂将微珠表面反射光导至检测器。流通池与 SI系统用 25 cm长、 0. 7 mm
i . d.的聚四氟乙烯管相连接。贮存管 HC直径 0. 96 mm ,长 150 cm ,体积为 1100μ L。废液贮存管 WHC
直径0. 96 mm ,长56 cm ,体积为400μ L。多位阀与微珠悬浮液储瓶连接的管道直径为0. 7 mm ,长20 cm。
第30卷
2002年3月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第3期
307~311 图1 流动注射可更新表面检测系统
Fig. 1 Flow injection renewable surface assay system
a. SI 2RST系统示意图( schematic diagram of the sequential injection2
renewable surface technique (SI 2RST) system) 。C. 载流(H2O carrier) ;
SP.泵( syringe pump ) ; HC. 贮存管 ( holding coil ) ; Heater. 加热棒
(heating rod ) ; MPV. 多位阀 (multiposition valve ) ; VSP. 注入阀
(syringe valve ) ; FC. 流通池 (microchip flow cell ) ; REC. 记录仪
(recorder) ;L.卤素灯(light) ;D.检测器(detector) ; WHC.废液贮存
管(waste holding coil) ; Bead. 微珠(2. 4 g L bead suspension) 。b. 样
带顺序(schematic diagramof the sequence of zones in HCwhen step 12 of
Table 1) Pho. 缓冲溶液 (phosphate buffer ) ; BHP. 试剂 (mixture of
bromopyrogallol red (BPR) , horseradish peroxidase (HRP) and buffer) 。
与其它试液储瓶间连接管道直径为 0. 5 mm。微
珠悬浮液储瓶置于 45°倾角保持旋转以维持微珠
的悬浮。
2. 3 实验方法
2. 3. 1 溶液的配制 HRP储备液40 U mL , GOD
储备液 11. 5 U mL , BPR 储备液 2 ×10 - 4
mol L ,均在 4 ℃冰箱中保存。H2O2 储备液以 KMnO4 标
定 ,H2O2 溶液使用时新配。磷酸盐缓冲溶液配
制:34. 0 g KH2PO4 溶于 500 mL H2O ,加入 90 mL
0. 5 mol L KOH并调节至pH 6. 2。C218 微珠悬浮
液的配制:先将微珠以少量乙醇润湿 ,然后加水稀
释成2. 4 × 10 - 3
g mL。
2. 3. 2 SI 2RST检测系统及检测过程 SI 2RST检
测系统结构见图 1a。SI 系统从流通池入口端将
微珠悬浮液、试剂、试样等注入流通池 ,检测器实
时监测微珠表面并记录。检测结束后 SI泵以反
向流将微珠及废液从此端吸出流通池并排废。SI
系统计算机控制程序见表 1。反应液吸入 HC中
区带排列顺序见图 1b。检测过程中实时记录的
吸光度2时间曲线见图 2。酶反应底物 BPR 在微
珠表面的吸附线性范围的测定过程按表 1 进行 ,但省去6222步 ,加一步吸入BPR试样。
表1 SI系统操作程序
Table 1 Sequence of operation of the sequential injection system ......
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