太子参醇提物对大鼠组织和红细胞的抗氧化活性

http://www.100md.com 《第四军医大学学报》 2005年第22期

     Antioxidative activity of EPHPH on tissues and erythrocytes of rats

    ZHANG ZhenMing, GE Bin, XU AiXia, YUAN YiMing, GAO Xiang

    1Department of Pharmaceutics, Peoples Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China, 2Department of Otorhinolaryngology, Second Clinical Hospital, Lanzhou Medical College, Lanzhou 730030, China

    【Abstract】 AIM: To study the antioxidative activity of the alcoholic extract from Pseudostellaria heterophylla Pax et Hoffm (EPHPH) and its mechanism. METHODS: The peroxidation in homogenates of heart and liver and kidney of rats was induced by ·HO generation system Fe2++ascorbic acid. Malondialdehyde(MDA)was determined using TBA colorimetric method and superoxide(O2-)from zymosanstimulated neutrophils of rats was measured by NBT reduction method. H2O2caused hemolysis of erythrocytes was measured spectrometrically. RESULTS: MDA formation in homogenates of heart and liver and kidney of rats induced by ·HO generation system Fe2++ascorbic acid was inhibited differently by 6.7, 13.4, 26.8, 53.5, 107.0 and 214.0 μg/L EPHPH, whose IC50 that inhibited MDA formation in heart, liver and kidney was 57.0, 51.5 and 53.2 μg/L respectively, whose relation between quantity and efficiency showed all negative and whose relative coefficient was -0.891,-0.883 and -0.893 respectively (all P<0.001). O2- generation from zymosanstimulated neutrophils of rats was inhibited distinctly by EPHPH, whose IC50 that inhibited O2- generation was 83.1 μg/L, whose relation between quantity and efficiency showed negative and whose relative coefficient was -0.894(P<0.001). H2O2caused hemolysis of erythrocytes was inhibited distinctly by EPHPH whose IC50 that inhibited hemolysis of erythrocytes was 86.5 μg/L, whose relation between quantity and efficiency showed negative and whose relative coefficient was -0.901 (P<0.001). CONCLUSION: EPHPH exerts its effect on antioxidation by scavenging ·HO, O2- and H2O2 in the biological system.

    【Keywords】 EPHPH; free radicals; hemolysis extent; erythrocytes; activitiy of antioxidation

    【摘要】 目的： 研究太子参醇提物的抗氧化活性及其机制. 方法： 用·HO生成系统Fe2++抗坏血酸诱导大鼠心、肝、肾组织匀浆脂质过氧化，TBA比色法测定MDA含量；NBT还原法测酵母多糖A刺激大鼠中性粒细胞产生的O2-；分光光度法测H2O2诱发的大鼠红细胞溶血度. 结果： 6.7， 13.4， 26.8， 53.5， 107.0和214.0 μg/L 太子参醇提物不同程度抑制Fe2++抗坏血酸诱导的大鼠心、肝、肾MDA生成，其抑制心、肝、肾MDA生成的IC50分别为57.0, 51.5及53.2 μg/L, 其量效关系均呈负相关，相关系数分别为-0.891, -0.883, -0.893 (P均<0.001)；不同程度抑制酵母多糖A刺激大鼠中性粒细胞生成O2-及红细胞氧化溶血，IC50分别为83.1和86.5 μg/L，其量效关系均呈负相关，相关系数分别为-0.894和-0.901 (P均<0.001). 结论： 太子参醇提物通过清除·HO, O2-及H2O2而发挥抗氧化活性.

    【关键词】 太子参醇提物；自由基；溶血度；红细胞；抗氧化活性

     0引言

    太子参(Pseudostellaria heterophylla Pax et Hoffm, PHPH)为传统中药，有补肺健脾功效. 近年有研究表明太子参总提物对环磷酰胺所致小鼠T、B淋巴细胞转化功能低下及白细胞吞噬功能降低有显著对抗作用，并能增加外周血白细胞数，其水提物有抗氧化作用[1]. 我们通过实验将太子参醇提物(EPHPH)对大鼠组织和红细胞的抗氧化活性及其机制进行了探讨.

    1材料和方法

    1.1材料

    EPHPH用50 mL/L DMSO溶解，硫代巴比妥酸(TBA)为上海试剂二厂产品，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)为上海前进试剂厂产品，酵母多糖A为Sigma产品，其它试剂均为进口或国产分析纯. Wistar大鼠40只，雌雄不拘，体质量(210±20) g，由兰州医学院实验动物中心提供. 药材购自本院药房.

    1.2方法

    1.2.1EPHPH的制备用回流提取法，将药材适度粉碎，800 mL/L乙醇浸泡24 h，装入瓶内，约为容量的1/2，溶剂浸过药材表面约2 cm,水浴中加热回流，放冷过滤，第1次回流1 h，第2及第3次各约30 min，回收乙醇，60℃干燥即得. 样品主要成分为太子参皂甙(批号： 20040816).

    1.2.2实验分组及样本量设空白组，对照组及6个剂量受试药组(n=5). 空白组大鼠组织不加诱发剂，对照组加诱发剂，受试药1, 2, 3, 4, 5和6组大鼠组织分别加诱发剂及6.7, 13.4, 26.8, 53.5, 107.0和214.0 μg/L EPHPH.

    1.2.3酵母多糖A悬浮液的制备[2]酵母多糖A用大鼠血清悬浮为50 g/L,37℃温育30 min, 4℃, 3000 g×10 min离心，弃上清，用4倍量0.15 mmol/L磷酸缓冲盐水(BPS, pH7.4)冲洗，同法离心后弃上清，洗3次后用BPS悬浮，低温贮存备用.

    1.2.4中性粒细胞的制备[2]大鼠腹腔注射液体石腊10 mL, 20~22 h断头处死，4℃ Hanks (mmol/L) (Ca2+ 1.3, Mg2+0.8, Glucose 10.0， pH 7.4)分3次抽洗出腹腔渗出液，4℃, 500 g×10 min离心，弃上清，4倍量Hanks液洗涤及同法离心，洗3次后用Hanks液悬浮，调中性粒细胞计数为1×106/L，低温贮存备用.

    1.2.5红细胞的制备[2]大鼠断头取肝素抗凝全血，2000 g×6 min离心，弃血浆，所剩红细胞用4倍量生理盐水洗涤及同法离心，洗3次后用生理盐水悬浮，调红细胞体积分数为0.5%,贮存备用.

    1.2.6·OH生成系统诱发大鼠心、肝、肾匀浆产生丙二醛(MDA)的测定[3]大鼠心、肝、肾用Tris缓冲液(10.0 mmol/L TrisHCl, 0.1 mmol/L EDTA2Na, 10.0 mmol/L蔗糖, 8.0 g/L NaCl， pH 7.4)制备成5%匀浆，取组织匀浆1 mL及药液(对照及空白管加2.5 μmol/L DMSO)置反应管，37℃温育10 min,除空白管外各管加入50∶50 μmol/L Fe2++抗坏血酸溶液(终浓度)，继续温育30 min,用TBA比色法测定MDA含量.

    1.2.7酵母多糖A刺激大鼠中性粒细胞生成O2-的测定[2]取中性粒细胞悬浮液1 mL，按NBT还原法测定O2-，用吡啶作参比，515 nm处测A，以NBT还原物甲替的量反映O2-的变化. 抑制率=(对照管A-测试管A)/(对照管A-空管A)×100%.

    1.2.8H2O2诱发大鼠红细胞氧化溶血的测定[2]取红细胞悬浮液1 mL,加入100 mmol/L H2O2(空白管不加H2O2)及药液, 37℃温育1 h,加4倍量生理盐水稀释，3000 g×6 min离心,上清液于415 nm处测A. 用线性回归求算IC50，溶血度=(测试管A-空白管A)/(对照管A-空白管A)×100%.

    统计学处理： 数据用x±s表示，统计软件SPSS进行分析，组间实验数据显著性差异用单因素方差分析及多组间均数两两比较，受试药量效相关显著性差异用相关性检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义.

     2结果

    2.1EPHPH对·OH生成系统诱发大鼠心、肝、肾匀浆MDA的影响大鼠心、肝、肾匀浆经Fe2++抗坏血酸溶液诱发后MDA显著升高，而EPHPH可显著抑制MDA含量升高，其量效关系均呈负相关，相关系数分别为-0.891, -0.883, -0.893,相关性检验P值均<0.001. 抑制心、肝、肾MDA生成的IC50分别为57.0, 51.5及53.2 μg/L(Tab 1).表1EPHPH对·OH生成系统诱发大鼠心、肝、肾匀浆MDA的影响(略)

    2.2EPHPH对大鼠中性粒细胞生成O2-及红细胞氧化溶血的影响大鼠中性粒细胞受酵母多糖A刺激后O2-显著升高，红细胞经H2O2诱发后溶血度显著升高，6.7, 13.4, 26.8, 53.5, 107.0和214.0 μg/L EPHPH不同程度抑制酵母多糖A刺激大鼠中性粒细胞生成O2-及红细胞氧化溶血，其IC50分别为83.1和86.5 μg/L(Tab 2).表2EPHPH对大鼠中性白细胞生成O2-及红细胞氧化溶血的影响(略)

    3讨论

    Fe2++抗坏血酸产生·OH是基于Fenton反应原理进行的,抗坏血酸+2H++2O2-→H2O2+脱氢抗坏血酸，Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH. 可见少量抗坏血酸可清除O2-，对机体有保护作用. H2O2和O2-均为正常组织中氧的代谢产物，大量抗坏血酸存在时组织中H2O2形成反而增多，它与Fe2+反应生成毒性更大的·OH，引起脂质过氧化. 氧自由基包括羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-)不断产生于生物体. 适量自由基对细胞的分裂，生长，消炎，解毒等起积极作用，但过剩会损伤细胞膜，使DNA断裂，蛋白质变性，酶失活，最后导致细胞解体和死亡. 脂质过氧化是氧自由基损伤组织的重要方式，其损伤途径为： 氧自由基+细胞膜脂质→脂质过氧化反应→过氧化脂质→MDA. 可见脂质过氧化与氧自由基密切相关. 若设法清除氧自由基，就可抑制脂质过氧化. 业已证明，氧自由基过剩可诱发炎症、免疫失调、恶性肿瘤等，也是导致肝，肾缺血性损伤及心脑组织缺血再灌注损伤的关键因素，研究和开发抗氧化剂及自由基清除剂对防治与自由基有关的疾病有重大意义.

    本实验结果表明： 6.7, 13.4, 26.8, 53.5, 107.0和214.0 μg/L EPHPH能不同程度抑制Fe2++抗坏血酸诱导的大鼠心、肝、肾脂质过氧化产物MDA生成，这提示EPHPH具有清除·OH的显著作用；能不同程度抑制酵母多糖A刺激中性粒细胞生成O2-，其量效关系呈负相关；能不同程度抑制H2O2诱发的红细胞氧化溶血，其量效关系呈负相关. 提示EPHPH具有清除H2O2及对抗生物膜过氧化的显著作用；可见，EPHPH通过清除·OH, O2-及H2O2而发挥抗氧化活性. 本实验结果显示EPHPH是一种有效的氧自由基清除剂，可能用于与自由基相关疾病的防治.

     【参考文献】

    [1]Ng TB, Liu F, Wang HX. The antioxidant effects of aqueous and organic extracts of panax quinquefolium, panax notoginseng, codonopsis pilosula, pseudostellaria heterophylla and glehnia littoralis [J]. J Ethnopharmacol, 2004;93(23):285-288.

    [2] 葛斌，陈立德，张振明. 4磺酸酯2, 2, 6, 6四甲基哌啶氮氧自由基对大鼠组织和红细胞的抗脂质过氧化作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2001;15(1):47-50.

    Ge B, Chen LD, Zhang ZM. Antioxidative activity of 4sulfonate2, 2, 6, 6tetramethylpiperidineoxyl in tissues and erythrocytes from rats [J]. Chin J Pharmacol Toxico, 2001;15(1):47-50.

    [3] 刘世坤,陈修. 丙二醛测定法[A]. 徐叔云,卞如濂,陈修主编. 药理实验方法学[M]. 第3版, 北京： 人民卫生出版社,2002:434-437.

    基金项目：甘肃省科学事业费科研项目(QS041C3320)

    通讯作者：葛斌. Tel. (0931)8281809Email. gebin1965@sina.com

    作者简介：张振明(1954)，男(汉族)，甘肃省通渭县人. 学士，副主任药师. Tel. (0931)8281682Email. gebin1965@sina.com

    (1甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000， 2兰州医学院第二临床医院耳鼻喉科，甘肃 兰州 730030)

    编辑井晓梅(张振明，葛斌，许爱霞，袁逸铭，高湘)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/DirDu/2006/03/12/94/98/00.htm