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编号:10955420
葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的影响
http://www.100md.com 《第四军医大学学报》 2006年第3期
     Puerarin inhibits ionic channel current Ik1 in rat cardiac myocytes

    ZHANG Hua, MA LanXiang, YANG XingChang, ZHANG Lei, DUAN JiYuan, YUAN PingLi

    1Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China, 2Center of Cardiology, Shaanxi Provincial Corps Hospital, Chinese Peoples Armed Police Forces, Xian 710054, China

    【Abstract】 AIM: To explore the effect of puerarin on the inhibition of ionic channel current Ik1 in rat cardiac myocytes and the related mechanism of puerarin. METHODS: Ionic channel currents (Ik1, Ito) of isolated adult rat ventricular myocytes were investigated by using wholecell pathclamp technique. Isolated adult rat ventricular myocytes were randomly divided into 5 groups: control group, the group of 1.2 mmol/L puerarin, the group of 2.4 mmol/L puerarin, the group of 4.8 mmol/L puerarin and the group of 9.6 mmol/L puerarin. RESULTS: Puerarin decreased Ik1 instantaneou current and steadystate current elicited by 500 ms duration of pulses depolarized to different membrane potential in a dosedependent manner. CONCLUSION: Puerarin blocks Ik1 of ionic channel in rat cardiac myocytes in a dosedependent manner.

    【Keywords】 inward rectifier potassium channel; twoelectrode voltage clamping; ionic channel; patch clamp recording; puerarin

    【摘要】 目的: 探讨葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的影响及其抗心律失常的电生理学机制. 方法: 采用Langendoff胶原酶灌注加浸泡法分离大鼠心室肌细胞,据不同细胞外灌流液将实验分5组:对照组;葛根素1.2, 2.4, 4.8和9.6 mmol/L组. 分别用膜片钳全细胞记录各组内向整流钾通道(Ik1)、瞬时外向钾通道(Ito)的电流. 结果: 在500 ms去极化的实验条件下,葛根素使不同去极化水平时的Ik1瞬间电流及稳态电流均明显下降. 随着药物剂量的增加,这种抑制作用也增强. 结论: 葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的作用主要是抑制Ik1,且抑制呈浓度依赖性.

    【关键词】 Ik1通道;电压钳;离子通道;膜片钳;葛根素

     0引言

    心肌细胞的跨膜离子流和单离子通道电流是洞察动作电位产生机制和冲动传导的关键,也是了解心脏功能异常以及心律失常发生机制的前提,所有作用于心脏的药物,尤其是抗心律失常药作用的中心环节也是单离子通道和跨膜离子流. 我们已经证实葛根素对爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(Ik1)电流有抑制作用,那么,它对心肌细胞的Ik1是否也有同样的作用? 对心肌的其他离子通道有无影响? 有关这方面的研究报道甚少. 我们将观察葛根素对大鼠心肌离子通道的影响,为其抗心律失常作用的开发提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料

    成年雌性大鼠,25只,体质量(230±20)g,由第四军医大学实验动物中心提供. 葛根素, 牛血清白蛋白(购自Sigma),胶原酶1(购自Sigma),Hepes(购自Sigma), taurine(购自Sigma),倒置显微镜(Olympus IMT2, Japan) ,数据采集卡(Axon,USA),膜片钳放大器(Nikon Kohden, Japan).

    1.2方法

    1.2.1单心室肌细胞的分离及实验分组猛击大鼠头部,使其晕厥,迅速打开胸腔,剪开心包,沿主动脉根部向上约0.5 cm处剪下心脏和部分大血管,置于4℃的Tyrode液中. 冲洗冠脉迅速用分离装置行主动脉逆行灌流,无钙Tyrode液灌流3 min左右, 含胶原酶和牛血清白蛋白的无钙Tyrode液灌流约30 min,直至心脏变白、变软, KB液冲洗心脏5 min, 细剪刀剪下心室肌,在KB液中剪碎,37℃温育10 min后,用孔径200 μm的尼龙网过滤出单心室肌细胞,室温保存待测. 葛根素不同的浓度溶解于细胞外液中,大鼠随机分为5组(n=5):对照组、葛根素1.2, 2.4, 4.8和9.6 mmol/L组.

    1.2.2电生理学测定方法取一滴KB液中保存的心室肌细胞悬液,置于倒置显微镜实验平台上的玻璃灌流槽内,静置10 min使细胞贴附于灌流槽底部的玻片上. 加Tyrode液对细胞复钙. 选择边缘整齐、横纹清晰、表面光洁、静止的棒状心室肌细胞进行实验. 灌流槽内的细胞贴壁后,以正常的细胞外液灌流细胞. 操作微操纵器使玻璃微电极入水、封接测试,调节电极尖端电位为零,10 mV的除极化刺激,测电阻. 镜下调整电极位置,接触到细胞膜后可见阻值变大,略施负压持续吸引,形成巨阻抗封接,随后以脉冲式负压吸破细胞膜,形成全细胞记录状态. 此时可见有较大的膜电容电流出现,补偿膜电容,稳定5 min后记录电流.

    1.2.3Ik1的记录常规全细胞电压钳情况下,钳制心室肌细胞膜电位于-80 mV,测试电压从-140~+20 mV,以10 mV步幅使之去极化至不同膜电位水平,持续时间500 ms,刺激频率0.2 Hz. 观察各组对离子通道电流的影响.

    统计学处理:实验所得的电生理资料采用Microcal公司的Origin6.0软件包进行统计分析,并绘制统计图. 以正常细胞外液记录的电流峰值为100%,加药后的电流为正常电流的百分数. 数据均以x±s表示,多组比较采用oneway ANOVA方法. P<0.05认为差异有统计学意义.

     2结果

    在500 ms去极化的实验条件下,葛根素使不同去极化水平时的Ik1瞬间电流及稳态电流均明显下降,随着药物剂量的增加,这种抑制作用也增强. 将心肌细胞由-140 mV去极化至+20 mV,持续500 ms,测定不同浓度的葛根素对Ik1稳态电流的抑制作用. 在2~3 min内,葛根素即可浓度依赖性地抑制Ik1, 9.6 mmol/L葛根素对Ik1的抑制率平均达到了(58.0±2.1)%. 在药物被冲洗后,Ik1可几乎恢复到正常水平(图1).

     3讨论

    心肌细胞的动作电位和静息电位也和其他兴奋细胞一样,来源于肌细胞膜的跨膜离子流,即膜电流,多种跨膜离子流的复杂变化产生心肌细胞的动作电位和静息电位,即动作电位和静息电位是多种离子通道综合作用的结果. 大鼠和人或豚鼠的心肌离子通道分布有所不同,动作电位的形态就不同[1-2]. 心肌快反应细胞(如心室肌细胞)动作电位的除极期和0相,二者均主要由快钠通道开放引起大量钠内流(INa)形成,静息电位二者也均是钾的平衡电位,由Ik1电流及Na′K′泵电流共同参与形成. 但在动作电位复极期,人或豚鼠的动作电位的I相主要由瞬时外向钾通道(Ito)快速激活形成;接着出现一个2相平台期,它主要由缓慢内向电流钙电流(ICa)及外向电流延迟整流钾电流Ik共同形成;3相复极早期主要由Ik逐渐增强造成,3相复极晚期由Ik和少量Ik1的外向电流共同形成[3]. 在大鼠心室肌细胞延迟整流钾通道分布很少,Ik电流很弱,而Ito电流占明显优势. 大鼠心室肌细胞动作电位的复极相主要是由钙内流和瞬时外向钾电流共同参与形成,内向整流钾电流以Ik1的外向电流也对其复极晚期起促进作用. 因此,大鼠心室肌细胞动作电位的复极相明显区别于其他的一些动物如豚鼠等,即没有明显的平台期. 它们的平衡是影响心肌动作电位时程的决定因素[4-6]. 本研究在我们先前实验证明葛根素对卵母细胞表达的Ik1有肯定的强的抑制作用的基础上,探讨其对心肌细胞Ik1的影响. 由于大鼠心肌离子通道分布的特殊性,我们主要观察了葛根素对大鼠心室肌细胞上的Ik1,Ito的影响.

    采用大鼠急性分离心肌细胞证明,葛根素对大鼠心肌离子通道的作用是选择性的. 灌流1.2 mmol/L的葛根素时即出现Ik1的抑制作用,随着药物浓度的加大,抑制强度也增加,在9.6 mmol/L葛根素对Ik1的抑制率达(58.0±2.1)%. 即无论低浓度还是高浓度葛根素对Ik1均呈现强大的抑制作用;对Ito, 1.2~9.6 mmol/L的葛根素无作用. 即葛根素对大鼠心肌离子通道的主要作用位点是Ik1. 那么,以作用Ik1为主的葛根素是否有预防和治疗大鼠心律失常的作用呢?我们将在器官和整体水平的动物实验中作进一步观察.

    【参考文献】

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    作者简介:张华. 主任医师,博士,副院长. Tel:(029)83781003Email:zl1017@126.com

    (1第四军医大学西京医院心脏内科,陕西 西安 710033,2武警陕西总队医院心脏中心,陕西 西安 710054)

    编辑袁天峰

    收稿日期:20041228, 百拇医药(张华,马兰香,杨星昌,张磊,段继源,原平利)