肝细胞移植对大鼠实验性肝衰竭的疗效研究
关键词: 肝移植;细胞移植;肝功能衰竭，急性;半乳糖
摘 要:目的 探讨同种异体肝细胞经腹腔、门静脉移植对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用. 方法 采用D-gal诱导大鼠急性肝衰竭，诱导后60h，分4组进行治疗实验，Ⅰ组:经门静脉移植2×10
7 肝细胞，同时肌注环孢霉素A(CsA)10mg·kg-1 ;Ⅱ组:经门静脉注射生理盐水1mL，同时肌注CsA10mg·kg-1 ;Ⅲ组:经腹腔移植4×107 肝细胞;Ⅳ组:经腹腔注射生理盐水2mL，观察大鼠的存活率、肝脏功能、病理变化. 结果 Ⅰ组大鼠存活率与Ⅱ组无明显差异(42%vs37%，P>0.05)，肝脏功能、病理无明显改善.Ⅲ组大鼠存活率显著高于Ⅳ组(75%vs33%，P<0.05)，肝脏功能、病理均有部分改善. 结论 经腹腔移植同种异体肝细胞可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率，部分改善肝功能、病理;经门静脉移植同种异体肝细胞不能改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率、肝脏功能及病理改变.
Study on effect of hepatocytes transplantation in rats with acute hepatic failure
LI Yu BAI Xue-Fan ZHANG Hai ZHANG Yan
1 Department of Infectious Disease，Tangdu Hospi-tal，Xi'an710038，China，
2 Center of Laboratory Animal Research，Fourth Military Medical Univer-sity
Keywords:liver transplantation;cell transplantation;liver failure，acute;calactose
Abstract:AIM To study the effect of allogeneic hepatocytes transplantation(HcT)through venaportae or intraperi-toneally on acute hepatic failure(AHF)induced by D-galac-tosamine.METHODS AHF rats were induced by D-gal.HcT was received60h after intoxication，and the rats were divided into four groups.GroupⅠreceived2×107 hepato-cytes through venaportae with Cyclosporin A(CsA)10mg·kg-1 simultaneously.GroupⅡreceived1mL of normal saline(N.S)through venaportae with CAS10mg·kg-1 .GroupⅢreceived4×107 hepatocytes intraperitoneally.GroupⅣreceived2mL N.S intraperitoneally.Then the survival rates，liver function and liver histology of all rats were ob┐served.RESULTS Survival rate of GroupⅠwas similar to that of GroupⅡ(42%vs37%，P>0.05)，and liver func-tion and liver histology of GroupⅠwere not improved signif-icantly as compared with GroupⅡ.On the other hand，the survival rate of GroupⅢwas higher than that of GroupⅣ(75%vs33%，P<0.05)，the liver function and liver histol-ogy were obviously improved in GroupⅢas compared with GroupⅣ.CONCLUSION After HcT intraperitoneally，the survival rate of AHF rats intoxicated with D-gal is increased，and their liver function and histology is also improved.But，the survival rate，liver function and liver histology of AHF rats through venaportae HcT is not improved.
0 引言
急性肝衰竭(ALF)或亚急性肝衰竭(SALF)是各种肝脏疾病特别是病毒性肝炎的主要死因之一[1，2] ，肝脏移植被认为是对其最有效的治疗方法[3] .但由于受到价格昂贵、供体短缺、供体肝保存困难、移植物功能障碍、术后感染及不能耐受等问题的影响.目前，在我国广泛开展肝脏移植以治疗肝衰竭仍面临许多困难.肝细胞移植具有简单易行、供体肝细胞保存方便、应用灵活、对受体影响小及价格相对低廉等特点，近年来得到较快发展，成为继原位肝移植后又一治疗各种肝功能衰竭的有较好效果和应用前景的方法[4-6] .我们采用D-氨基半乳糖(D-gal)诱导大鼠肝衰竭，经门静脉、腹腔移植同种异体肝细胞治疗急性肝衰竭大鼠，观察急性肝衰竭大鼠存活率、肝脏功能、病理的变化，以期为临床开展肝细胞移植提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠180只，体质量(189±52)g，由第四军医大学实验动物中心提供，实验室温20～25℃，实验前12h禁食.IV型胶原酶、DNA酶I购于Sigma公司，D-gal购于重庆医科大学.全自动生化分析仪购自Simens公司.
1.2 方法
1.2.1 急性肝衰竭模型的建立 大鼠腹腔内注射不同剂量(1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2g·kg-1 )的D-gal，根据动物死亡率、肝脏病理及功能损害选择1.6g·kg-1 D-gal为大鼠急性肝衰竭的最适诱导剂量.
1.2.2 肝细胞的分离纯化 2g·L-1 戊巴比妥钠溶液以30mg·kg-1 腹腔麻醉大鼠，同时腹腔内注射200IU肝素钠溶液.消毒皮肤，显露游离门静脉后在距肝门2cm处插入18号导管，用D-Hanks液(含0.01g·L-1 EDTA，37℃，pH7.4，通以含950mL·L-1 O2 及50mL·L-1 CO2 的混和气体)以20mL·min-1 的速度灌入，随后于肝下后静脉插入16号导管放出积血、积液，并剪开胸腔，夹闭肝上后腔静脉.灌注5min后改为含0.05g·L-1 胶原酶，0.01g·L-1 DNA酶Ⅰ的Hanks液(37℃，pH7.4，通以含950mL·L-1 O2 ，50mL·L-1 CO2 的混合气体)持续灌注5min.取下肝脏，置于含4℃Han-ks液的平皿中，剪下肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液.将灌注剩余的胶原酶溶液倒入悬液中，并以Hanks液将总量调至100mL，置于37℃恒温水浴中孵化10min，然后，将此悬液以100目及200目网过滤，分装于3～4离心管中，以500r·min-1 离心2min，弃上清，以4℃Hanks液重悬，清洗并反复离心3次，再以4℃Hanks液重悬，做细胞涂片行HE染色判断肝实质细胞纯度，用0.4g·L-1 胎盘蓝染色判断细胞活率，用血细胞计数板计数细胞数量并计算细胞产量.肝细胞得率为(0.8～2.4)×108 个/鼠;细胞活率为90%，肝实质细胞纯度大于95%.
1.2.3 肝细胞移植 122只大鼠在D-gal诱导肝衰竭后60h，随机分为4组，各组大鼠在相同饲养条件下，体质量、鼠龄均无显著差异.Ⅰ组30只，常规麻醉后切开腹腔，经门静脉穿刺注射2×1010 ·L-1 的肝细胞悬液1mL，同时肌注环孢霉素A(CsA)10mg·kg-1 .Ⅱ组30只，经门静脉注射生理盐水1mL，其余处理同Ⅰ组.Ⅲ组32只，腹腔内移植2×1010 ·L-1 的肝细胞悬液2mL.Ⅳ组30只作为Ⅲ组的对照组，每只鼠腹腔注射生理盐水2mL.其中各 组用于观察2wk存活率及组织学检查的大鼠分别为20，15，20和15只，用于抽血及组织学检查的大鼠分别为10，15，12和15只.
1.2.4 肝脏功能测定 各组分别于注射肝细胞移植后第l，3，7日，经腹主动脉抽血，用全自动生化分析仪测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBi)、碱性磷酸酶(ALP).分别取6只大鼠作模型及正常对照.
1.2.5 肝组织学检查 取大鼠肝脏标本，用10g·L-1 甲醛固定，按常规方法作HE染色.
统计学处理:所有数据均以x ±s表示，死亡百分率比较采用Fisher确切概率计算，各项肝功能指标比较采用团体t检验.
2 结果
2.1 不同途径肝细胞移植后大鼠存活率的比较 所有大鼠于药物诱导48h后，活动减少，嗜睡，有时呈激惹状态.60h后逐步进入昏迷状态，部分伴尿失禁、尿色深黄，口腔、泌尿生殖道出血，死亡时间大多在72～96h之间，少部分鼠可自行恢复.不同处理组大鼠2wk存活百分比分别为I组42%(10/24)，Ⅱ组37%(6/16)，Ⅰ组与Ⅱ组无明显差异(P>0.05);Ⅲ组75%(15/20)，Ⅳ组33%(5/15)，Ⅲ组较Ⅳ组有显著提高(P<0.05).
2.2 肝细胞移植后肝脏功能的改变 大鼠在注射D-gal后60h肝功能显著恶化，对照组肝衰竭大鼠ALT，AST，TBi，ALP等指标在移植后第1日无明显改善，第3日肝功能异常达高峰，第7日明显恢复.在移植肝细胞后第1日，Ⅰ组与Ⅱ组各项指标差异无显著性(P>0.05)，Ⅲ组与Ⅳ组亦无明显差异(P>0.05).第3日，Ⅲ组与Ⅳ组比较各项指标均有改善(P<0.05)，Ⅰ组与Ⅱ组变化不明显.第7日，肝功能均明显恢复，各组之间无显著差异(Tab1).
2.3 肝细胞移植后组织学改变 Ⅳ组在肝细胞移植后第3日，肝脏小叶结构破坏，肝索紊乱.肝细胞大片变性坏死，胞质疏松，大量空泡，可见核固缩或碎裂.由汇管区开始淋巴细胞、中性白细胞等炎性细胞浸润，坏死区亦见炎性细胞浸润.肝窦扩张，呈网眼状，可见淤血甚或出血(Fig1).Ⅲ组在肝细胞移植后第3日，肝脏组织病变轻于Ⅳ组，部分标本亦可见肝细胞破坏但轻于Ⅳ组，表现为肝小叶结构尚清，肝细胞变性为主，坏死灶小，炎性细胞浸润少，充血出血轻(Fig2).Ⅱ组及Ⅰ组肝脏病理与Ⅳ组无明显差异.细胞移植后第7日，各组实验动物组织学结构均大致恢复正常(Fig3).
3 讨论
自人类成功分离肝细胞以来，肝细胞移植作为治疗急性肝衰竭的一种有效方法而受到国内外学者的广泛关注[4] .目前，虽然国内相关研究还局限于动物试验阶段，但国外临床试验已取得较理想的治疗效果[4，6] .肝细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究大多采用腹腔、脾脏两种途径，我们采用门静脉、腹腔两种途径进行肝细胞移植，为经门静脉移植肝细胞的研究提供借鉴.本实验证实同种异体肝细胞经腹腔移植可显著改善D-gal诱导的急性肝衰竭大鼠的存活率，治疗效果明显，与相关文献报道一致[7，8] .应用这一途径，移植细胞数量大(4×107 )，操作简便，并发症少，大鼠腹腔内鲜见粘连，仅2例发生肝脏表面粘连，提示临床开展此途径移植肝细胞有一定的可行性和较高的安全性.
图1 -图3 略
表1 各组大鼠肝脏生化指标改变 略
本实验结果还表明，同种异体肝细胞经门静脉移植不能提高D-gal诱导的急性肝衰竭大鼠的存活率，其疗效较差，与临床治疗效果存在一定差异[6] .肝细胞移植后实验鼠死亡率较高，可能系由于实验鼠个体小，门静脉内径窄，穿刺行肝细胞移植难度较高，移植细胞数量有限，且易发生门静脉出血、栓塞至肝脏急性缺血、坏死等并发症.故有待较大个体肝衰竭动物的实验研究验证.
我们采用D-gal诱导急性肝衰竭大鼠模型，肝细胞移植后第1日，Ⅰ组比Ⅱ组，Ⅲ组比Ⅳ组，肝脏生化指标ALT，AST，TBi，ALP均无明显改善.移植后第3日，Ⅲ组肝脏功能有较大恢复，与Ⅳ组比较差异显著.至第7日，各组大鼠肝脏功能均大致恢复正常，提示该方法虽可较好模拟临床急性肝衰竭患者的病理生理改变，但仍存在模型存在时间短及稳定性较差的问题[9] .
肝脏病理改变与生化指标变化基本平行，细胞移植后第1日，Ⅰ组与Ⅱ组，Ⅲ组与Ⅳ组比较，肝脏病理均无明显改善.移植后第3日，Ⅲ组肝脏组织学变化明显，与Ⅳ组比较有明显恢复.但不如肝细胞移植治疗肝切除后大鼠急性肝衰竭的疗效明显[5] .其原因尚需探索，可能系供体肝细胞虽提供短暂功能支持，但不足以明显终止受体肝细胞的损害.移植肝细胞第7日，肝脏病理均得到明显恢复.
本研究所采用的药物性大鼠肝衰竭模型能较好地模拟人体病情，所采用的同种异体移植方式较接近于临床移植中供体、受体实际情况，为临床开展肝细胞移植研究提供了新的途径.
参考文献:
[1]Lei QL，Zhao ZX，Huang YX，Wen QS，Liu ZX.Mental health status in patients with liver cirrhosis after hepatitis [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(9):849-851.
[2]Wang DS，Li KZ，Fu YC，Dou KF，Guan WX，Zhang JY.Liv-er regeneration after transplantation in rats [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(16):1473-1474.
[3]Li WB，Yan YP，Shao ZJ，Zhang ZY，Xu DZ.Most effective e-tiologic diagnosis strategy of acute viral hepatitis in China [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(22):2108-2111.
[4]NG VL，Alonso M，Bezerra JA.Hepatocyte transplantation ad- vancing biology and treating children [J].Clin Liver Dis，2000;4(4):929-945.
[5]Junta N，Tomoyoshi O，Ingo KS，Isao T，Namita RC，Jayanta RC，Ira JF.Treatment of surgically induced acute liver failure by transplantation of conditionally immortalized hepatocytes [J].Transplantation，1997;15:63(11):1541-1547.
[6]Jayanta RC，Namita RC，Stephen CS，Stuart SK.Human hepa-tocyte transplantation:Gene therapy and more [J]?Pediatrics，1998;102:647-648.
[7]Rotstein LE，Makowkwa L，Falk RE，Nossal NA，Falk JA，Field JE，Ascuali SS.Allogenic hepatocyte transplantation in the treatment of experimental acute hepatic failure [J].Gas-troenterology，1979;77:36.
[8]Sommer BG，Sutherland DER，Matas AJ，Simmon RL，Najari-an JS.Hepatocellular transplantation for treatment of D-galac-tosamine-induced acute liver failure in rats [J].Trans Proc，1979;11:578-584.
[9]Shito M，Balis UJ，Tompkins RG，Yarmush ML，Tonetr M.A fulminant hepatic failure model in the rat:Involvement of inter-leukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha [J].Dig Dis Sci，2001;46(8):1700-1708.
通讯作者: 白雪帆.Tel.(029)3377452 Email.xfbai@fmmu.edu.cn
作者简介: 李 羽(1967-)，男(汉族)，辽宁省西丰县人.硕士生(导师白雪帆)，主治医师.Tel.(029)2521467 Email.lyly0309@sina.com
第四军医大学:1 唐都医院感染病中心，陕西西安710038，
2 实验动物中心
编辑 王小仲, 百拇医药(李羽 白雪帆 张海 张岩)
摘 要:目的 探讨同种异体肝细胞经腹腔、门静脉移植对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用. 方法 采用D-gal诱导大鼠急性肝衰竭，诱导后60h，分4组进行治疗实验，Ⅰ组:经门静脉移植2×10
7 肝细胞，同时肌注环孢霉素A(CsA)10mg·kg-1 ;Ⅱ组:经门静脉注射生理盐水1mL，同时肌注CsA10mg·kg-1 ;Ⅲ组:经腹腔移植4×107 肝细胞;Ⅳ组:经腹腔注射生理盐水2mL，观察大鼠的存活率、肝脏功能、病理变化. 结果 Ⅰ组大鼠存活率与Ⅱ组无明显差异(42%vs37%，P>0.05)，肝脏功能、病理无明显改善.Ⅲ组大鼠存活率显著高于Ⅳ组(75%vs33%，P<0.05)，肝脏功能、病理均有部分改善. 结论 经腹腔移植同种异体肝细胞可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率，部分改善肝功能、病理;经门静脉移植同种异体肝细胞不能改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率、肝脏功能及病理改变.
Study on effect of hepatocytes transplantation in rats with acute hepatic failure
LI Yu BAI Xue-Fan ZHANG Hai ZHANG Yan
1 Department of Infectious Disease，Tangdu Hospi-tal，Xi'an710038，China，
2 Center of Laboratory Animal Research，Fourth Military Medical Univer-sity
Keywords:liver transplantation;cell transplantation;liver failure，acute;calactose
Abstract:AIM To study the effect of allogeneic hepatocytes transplantation(HcT)through venaportae or intraperi-toneally on acute hepatic failure(AHF)induced by D-galac-tosamine.METHODS AHF rats were induced by D-gal.HcT was received60h after intoxication，and the rats were divided into four groups.GroupⅠreceived2×107 hepato-cytes through venaportae with Cyclosporin A(CsA)10mg·kg-1 simultaneously.GroupⅡreceived1mL of normal saline(N.S)through venaportae with CAS10mg·kg-1 .GroupⅢreceived4×107 hepatocytes intraperitoneally.GroupⅣreceived2mL N.S intraperitoneally.Then the survival rates，liver function and liver histology of all rats were ob┐served.RESULTS Survival rate of GroupⅠwas similar to that of GroupⅡ(42%vs37%，P>0.05)，and liver func-tion and liver histology of GroupⅠwere not improved signif-icantly as compared with GroupⅡ.On the other hand，the survival rate of GroupⅢwas higher than that of GroupⅣ(75%vs33%，P<0.05)，the liver function and liver histol-ogy were obviously improved in GroupⅢas compared with GroupⅣ.CONCLUSION After HcT intraperitoneally，the survival rate of AHF rats intoxicated with D-gal is increased，and their liver function and histology is also improved.But，the survival rate，liver function and liver histology of AHF rats through venaportae HcT is not improved.
0 引言
急性肝衰竭(ALF)或亚急性肝衰竭(SALF)是各种肝脏疾病特别是病毒性肝炎的主要死因之一[1，2] ，肝脏移植被认为是对其最有效的治疗方法[3] .但由于受到价格昂贵、供体短缺、供体肝保存困难、移植物功能障碍、术后感染及不能耐受等问题的影响.目前，在我国广泛开展肝脏移植以治疗肝衰竭仍面临许多困难.肝细胞移植具有简单易行、供体肝细胞保存方便、应用灵活、对受体影响小及价格相对低廉等特点，近年来得到较快发展，成为继原位肝移植后又一治疗各种肝功能衰竭的有较好效果和应用前景的方法[4-6] .我们采用D-氨基半乳糖(D-gal)诱导大鼠肝衰竭，经门静脉、腹腔移植同种异体肝细胞治疗急性肝衰竭大鼠，观察急性肝衰竭大鼠存活率、肝脏功能、病理的变化，以期为临床开展肝细胞移植提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠180只，体质量(189±52)g，由第四军医大学实验动物中心提供，实验室温20～25℃，实验前12h禁食.IV型胶原酶、DNA酶I购于Sigma公司，D-gal购于重庆医科大学.全自动生化分析仪购自Simens公司.
1.2 方法
1.2.1 急性肝衰竭模型的建立 大鼠腹腔内注射不同剂量(1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2g·kg-1 )的D-gal，根据动物死亡率、肝脏病理及功能损害选择1.6g·kg-1 D-gal为大鼠急性肝衰竭的最适诱导剂量.
1.2.2 肝细胞的分离纯化 2g·L-1 戊巴比妥钠溶液以30mg·kg-1 腹腔麻醉大鼠，同时腹腔内注射200IU肝素钠溶液.消毒皮肤，显露游离门静脉后在距肝门2cm处插入18号导管，用D-Hanks液(含0.01g·L-1 EDTA，37℃，pH7.4，通以含950mL·L-1 O2 及50mL·L-1 CO2 的混和气体)以20mL·min-1 的速度灌入，随后于肝下后静脉插入16号导管放出积血、积液，并剪开胸腔，夹闭肝上后腔静脉.灌注5min后改为含0.05g·L-1 胶原酶，0.01g·L-1 DNA酶Ⅰ的Hanks液(37℃，pH7.4，通以含950mL·L-1 O2 ，50mL·L-1 CO2 的混合气体)持续灌注5min.取下肝脏，置于含4℃Han-ks液的平皿中，剪下肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液.将灌注剩余的胶原酶溶液倒入悬液中，并以Hanks液将总量调至100mL，置于37℃恒温水浴中孵化10min，然后，将此悬液以100目及200目网过滤，分装于3～4离心管中，以500r·min-1 离心2min，弃上清，以4℃Hanks液重悬，清洗并反复离心3次，再以4℃Hanks液重悬，做细胞涂片行HE染色判断肝实质细胞纯度，用0.4g·L-1 胎盘蓝染色判断细胞活率，用血细胞计数板计数细胞数量并计算细胞产量.肝细胞得率为(0.8～2.4)×108 个/鼠;细胞活率为90%，肝实质细胞纯度大于95%.
1.2.3 肝细胞移植 122只大鼠在D-gal诱导肝衰竭后60h，随机分为4组，各组大鼠在相同饲养条件下，体质量、鼠龄均无显著差异.Ⅰ组30只，常规麻醉后切开腹腔，经门静脉穿刺注射2×1010 ·L-1 的肝细胞悬液1mL，同时肌注环孢霉素A(CsA)10mg·kg-1 .Ⅱ组30只，经门静脉注射生理盐水1mL，其余处理同Ⅰ组.Ⅲ组32只，腹腔内移植2×1010 ·L-1 的肝细胞悬液2mL.Ⅳ组30只作为Ⅲ组的对照组，每只鼠腹腔注射生理盐水2mL.其中各 组用于观察2wk存活率及组织学检查的大鼠分别为20，15，20和15只，用于抽血及组织学检查的大鼠分别为10，15，12和15只.
1.2.4 肝脏功能测定 各组分别于注射肝细胞移植后第l，3，7日，经腹主动脉抽血，用全自动生化分析仪测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBi)、碱性磷酸酶(ALP).分别取6只大鼠作模型及正常对照.
1.2.5 肝组织学检查 取大鼠肝脏标本，用10g·L-1 甲醛固定，按常规方法作HE染色.
统计学处理:所有数据均以x ±s表示，死亡百分率比较采用Fisher确切概率计算，各项肝功能指标比较采用团体t检验.
2 结果
2.1 不同途径肝细胞移植后大鼠存活率的比较 所有大鼠于药物诱导48h后，活动减少，嗜睡，有时呈激惹状态.60h后逐步进入昏迷状态，部分伴尿失禁、尿色深黄，口腔、泌尿生殖道出血，死亡时间大多在72～96h之间，少部分鼠可自行恢复.不同处理组大鼠2wk存活百分比分别为I组42%(10/24)，Ⅱ组37%(6/16)，Ⅰ组与Ⅱ组无明显差异(P>0.05);Ⅲ组75%(15/20)，Ⅳ组33%(5/15)，Ⅲ组较Ⅳ组有显著提高(P<0.05).
2.2 肝细胞移植后肝脏功能的改变 大鼠在注射D-gal后60h肝功能显著恶化，对照组肝衰竭大鼠ALT，AST，TBi，ALP等指标在移植后第1日无明显改善，第3日肝功能异常达高峰，第7日明显恢复.在移植肝细胞后第1日，Ⅰ组与Ⅱ组各项指标差异无显著性(P>0.05)，Ⅲ组与Ⅳ组亦无明显差异(P>0.05).第3日，Ⅲ组与Ⅳ组比较各项指标均有改善(P<0.05)，Ⅰ组与Ⅱ组变化不明显.第7日，肝功能均明显恢复，各组之间无显著差异(Tab1).
2.3 肝细胞移植后组织学改变 Ⅳ组在肝细胞移植后第3日，肝脏小叶结构破坏，肝索紊乱.肝细胞大片变性坏死，胞质疏松，大量空泡，可见核固缩或碎裂.由汇管区开始淋巴细胞、中性白细胞等炎性细胞浸润，坏死区亦见炎性细胞浸润.肝窦扩张，呈网眼状，可见淤血甚或出血(Fig1).Ⅲ组在肝细胞移植后第3日，肝脏组织病变轻于Ⅳ组，部分标本亦可见肝细胞破坏但轻于Ⅳ组，表现为肝小叶结构尚清，肝细胞变性为主，坏死灶小，炎性细胞浸润少，充血出血轻(Fig2).Ⅱ组及Ⅰ组肝脏病理与Ⅳ组无明显差异.细胞移植后第7日，各组实验动物组织学结构均大致恢复正常(Fig3).
3 讨论
自人类成功分离肝细胞以来，肝细胞移植作为治疗急性肝衰竭的一种有效方法而受到国内外学者的广泛关注[4] .目前，虽然国内相关研究还局限于动物试验阶段，但国外临床试验已取得较理想的治疗效果[4，6] .肝细胞移植治疗急性肝衰竭的实验研究大多采用腹腔、脾脏两种途径，我们采用门静脉、腹腔两种途径进行肝细胞移植，为经门静脉移植肝细胞的研究提供借鉴.本实验证实同种异体肝细胞经腹腔移植可显著改善D-gal诱导的急性肝衰竭大鼠的存活率，治疗效果明显，与相关文献报道一致[7，8] .应用这一途径，移植细胞数量大(4×107 )，操作简便，并发症少，大鼠腹腔内鲜见粘连，仅2例发生肝脏表面粘连，提示临床开展此途径移植肝细胞有一定的可行性和较高的安全性.
图1 -图3 略
表1 各组大鼠肝脏生化指标改变 略
本实验结果还表明，同种异体肝细胞经门静脉移植不能提高D-gal诱导的急性肝衰竭大鼠的存活率，其疗效较差，与临床治疗效果存在一定差异[6] .肝细胞移植后实验鼠死亡率较高，可能系由于实验鼠个体小，门静脉内径窄，穿刺行肝细胞移植难度较高，移植细胞数量有限，且易发生门静脉出血、栓塞至肝脏急性缺血、坏死等并发症.故有待较大个体肝衰竭动物的实验研究验证.
我们采用D-gal诱导急性肝衰竭大鼠模型，肝细胞移植后第1日，Ⅰ组比Ⅱ组，Ⅲ组比Ⅳ组，肝脏生化指标ALT，AST，TBi，ALP均无明显改善.移植后第3日，Ⅲ组肝脏功能有较大恢复，与Ⅳ组比较差异显著.至第7日，各组大鼠肝脏功能均大致恢复正常，提示该方法虽可较好模拟临床急性肝衰竭患者的病理生理改变，但仍存在模型存在时间短及稳定性较差的问题[9] .
肝脏病理改变与生化指标变化基本平行，细胞移植后第1日，Ⅰ组与Ⅱ组，Ⅲ组与Ⅳ组比较，肝脏病理均无明显改善.移植后第3日，Ⅲ组肝脏组织学变化明显，与Ⅳ组比较有明显恢复.但不如肝细胞移植治疗肝切除后大鼠急性肝衰竭的疗效明显[5] .其原因尚需探索，可能系供体肝细胞虽提供短暂功能支持，但不足以明显终止受体肝细胞的损害.移植肝细胞第7日，肝脏病理均得到明显恢复.
本研究所采用的药物性大鼠肝衰竭模型能较好地模拟人体病情，所采用的同种异体移植方式较接近于临床移植中供体、受体实际情况，为临床开展肝细胞移植研究提供了新的途径.
参考文献:
[1]Lei QL，Zhao ZX，Huang YX，Wen QS，Liu ZX.Mental health status in patients with liver cirrhosis after hepatitis [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(9):849-851.
[2]Wang DS，Li KZ，Fu YC，Dou KF，Guan WX，Zhang JY.Liv-er regeneration after transplantation in rats [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(16):1473-1474.
[3]Li WB，Yan YP，Shao ZJ，Zhang ZY，Xu DZ.Most effective e-tiologic diagnosis strategy of acute viral hepatitis in China [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2001;22(22):2108-2111.
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通讯作者: 白雪帆.Tel.(029)3377452 Email.xfbai@fmmu.edu.cn
作者简介: 李 羽(1967-)，男(汉族)，辽宁省西丰县人.硕士生(导师白雪帆)，主治医师.Tel.(029)2521467 Email.lyly0309@sina.com
第四军医大学:1 唐都医院感染病中心，陕西西安710038，
2 实验动物中心
编辑 王小仲, 百拇医药(李羽 白雪帆 张海 张岩)