人MUC┐1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS┐7细胞中的表达
关键词: MUC-1基因;真核表达;COS-7细胞;电穿孔法
摘 要:目的 构建含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS-7细胞中的表达. 方法 将目的基因MUC-1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.亚克隆入真核质粒pcDNA3.1(+)，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MUC-1.用电穿孔法将重组质粒转入COS-7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC-1的表达. 结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC-1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC-1基因能在COS-7细胞中表达. 结论 人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础.
Construction of eukaryotic expression vectors con┐taining coding of human full length MUC┐1gene and its expression in COS┐7
YUAN Shi-Fang LI Kai-Zong HAN Wei YAN Zhen ZHANG Ying-Qi
1 Department of Vascular and Endocrine Surgery，
2 Department of Hepatobiliary Surgery，Xijing Hos-pital，
3 Biotechnology Center，Fourth Military Medi-cal University，Xi'an710033，China
Keywards:MUC-1gene;COS-7cell;electroporation;eu-karyotic expression
Abstract:AIM To construct an eukaryotic expression vec-tor containing the coding region of human full length MUC1gene and to detect its expression in COS-7cells.METHODS The MUC1gene was ligated into the sites of HindIII and Sal I of cloning vector pGEM-3zf.After identification，the gene was subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+).The recombinant pcDNA3.1(+)-MUC-1was trans-fected into COS-7cells by electroporation.Im-munoflourescence and FCM were used to detect the MUC1gene expression in COS-7cells.RESULTS Restriction anal-ysis and DNA sequencing showed that the recombinant plas-mid contained the coding region of human full length MUC1gene.Transfection experiment verified that MUC1gene could be expressed in COS-7cells.CONCLUSION The eu-karyotic expression vector containing the MUC1gene was succesfully constructed and expressed，which is a basis for the study for DNA vaccine.
0 引言
MUC-1又名PEM(polymorphic epithelial mucin)，该基因的一个重要特征是其多态性[1-3] (polymorphism)，即其第2个外显子中含有可变数量串联重复序列(variable number of tandem re-peats，VNTRs)，每个VNTR含有60个碱基，富含GC.不同人的VNTRs数量从20～125不等.正常情况下，MUC-1可表达于多种组织、器官中的上皮细胞.但研究[4-7] 发现，MUC-1在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达，即表达量增高，且整个细胞表面均表达.由于糖基化不全出现新的抗原表位，是一种肿瘤相关抗原;同时，由于MUC-1是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，肿瘤MUC-1可以非主要组织相容性复合体(MHC)限制性和MHC限制性方式活化杀伤性T淋巴细胞(CTLs)，这些活化的CTLs可杀伤表达MUC-1的肿瘤细胞[8] .因此，MUC-1是肿瘤主动特异性免疫治疗理想的靶分子.为研究MUC-1肿瘤核酸疫苗的特异性抗肿瘤作用，我们构建了含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察了该表达载体在COS-7细胞中的表达.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及细胞系 E.coli DH5α，pGEM-3zf(-)均由生物技术中心保存，MUC-1质粒(pVax-MUC-1，含32tandem repeats)和真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Imperial Cancer Research Fund的Taylor-Papadimitriou教授惠赠.COS-7细胞由本校生物化学和分子生物学教研室引进.
1.1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶HindⅢ，SalⅠ，XhoⅠ购自Gibco公司;T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;化学试剂均为国产分析纯.E.Z.N.AR plasmid Miniprep Kit购自Omega公司;核酸凝胶纯化试剂盒NucleoTrap R Gel Extraction Kit购自Clontech公司;DMEM购自Gibco公司;MUC-1mAb为Antibody Diagnostica公司产品;荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC购自华美公司;小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.
1.2 方法
1.2.1 MUC-1基因克隆 将质粒提取、酶切、连接及转化的主要方法均参照文献[9]进行.提取质粒pVax-MUC-1及pGEM-3zf(-)载体，分别经HindⅢ，XhoⅠ及HindⅢ，SalⅠ双酶切(SalⅠ与XholⅠ互补)，NucleoTrapR Gel Extraction Kit回收3.5kbp的MUC-1DNA片段及pGEM-3zf(-)，按DNA与载体3∶1比例于16℃连接过夜.取上述连接产物2μL转化感受态细胞DH5α，将转化后的DH5α涂布于含100mg·L-1 氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养.16h后挑取单克隆，提取质粒，经HindⅢ，XbaⅠ双酶切鉴定.
1.2.2 DNA序列测定 E.Z.N.A R plasmid Miniprep Kit小量快速法提取重组质粒pGEM-3zf-MUC-1，用T7promoter引物和SP6引物从正反两向测序.DNA序列测定在博亚公司完成.
1.2.3 真核表达载体的构建 重组质粒pGEM-3zf-MUC-1测序正确后，将双酶切回收之MUC-1目的基因，与预先经HindⅢ和XhoⅠ双酶切的pcD-NA3.1(+)载体进行连接反应.以连接反应液转化感受态DH5α，挑选10个转化菌落，小量法提取质粒，进行酶切鉴定.阳性重组子命名为pcDNA3.1(+)-MUC-1.
1.2.4 细胞培养 COS-7细胞用含100mL·L-1 FCS的DMEM培养于100mL细胞培养瓶，约75%长满，10g·L-1 胰酶加2g·L-1 EDTA消化后，2000r·min-1 离心10min，收集细胞，用少量1×PBS液重悬，调整细胞数至2×1010 个·L-1 .
1.2.5 质粒制备和电穿孔法转染COS-7细胞[10] 小量提取质粒pcDNA3.1(+)-MUC-1及pcDNA3.1(+)，用Omega E.Z.N.AR plasmid Miniprep Kit纯化后，紫外分光光度法测定DNA含量和纯度.调整DNA浓度为1g·L-1 .取质粒40μg加入0.8mL细胞悬液中混匀，移入0.4cm穿孔杯中，冰浴10min，放入电穿孔仪的正负电极之间，电击条件为电容50μF，电压450V，电阻250Ω，电击后，将穿孔杯继续冰浴10min，移入已加入含100mL·L-1 FCS的DMEM完全培养液的3cm塑料平皿，混匀，37℃，50mL·L-1 CO2 孵箱培养.
1.2.6 间接免疫荧光法检测MUC-1的表达 转染54h后，2g·L-1 EDTA消化并收集COS-7细胞，用1×PBS调整细胞数为(0.5～1.0)×1010 ·L-1 ;取40μL细胞悬液加入预先加有MUC-1mAb10μL的5mL离心管，再加50μL以1∶20稀释的灭活正常兔血清，4℃孵育30min，洗涤液洗涤2次，2mL/次，1000r·min-1 离心5min;弃上清，加50μL工作浓度的羊抗鼠Ig-FITC荧光二抗，充分振荡，4℃孵育30min，洗涤液洗涤2次，2mL/次，1000r·min-1 离心5min;加固定液100μL，制片后荧光显微镜下观察.
1.2.7 流式细胞仪检测MUC-1的表达 免疫荧光染色的转染COS-7细胞上机检测.
2 结果
2.1 MUC┐1基因的克隆 选择重组克隆提取质粒，经双酶切鉴定，切出3.5kb的片段(Fig1)，表明MUC-1全长cDNA已克隆于载体中，命名为pGEM-3zf-MUC-1.
图1 略
2.2 MUC┐1基因的序列测定及分析 直接以pGEM-3zf-MUC-1为模板进行DNA测序，经计算机分析，与已知的包括13个氨基酸信号肽序列在内的人MUC-1cDNA序列相符.
2.3 pcDNA3.1(+)┐MUC┐1真核表达载体的鉴定 将重组的pcDNA3.1(+)-MUC-1质粒DNA以HindⅢ和XholⅠ双酶切鉴定，结果表明，MUC-1基因正确插入pcDNA3.1(+)载体的预期酶切位点之间(Fig2).
2.4 间接免疫荧光法检测MUC┐1在COS┐7细胞中的表达 活细胞免疫荧光染色观察发现，pcDNA3.1(+)空载体转染的细胞内未见荧光，而经pcDNA3.1(+)-MUC-1重组质粒转染的COS-7细胞膜及胞质中可见明亮荧光，表明pcDNA3.1(+)-MUC-1在COS-7细胞中得到了表达(Fig3).
2.5 流式细胞仪检测 免疫荧光染色的转染细胞经流式细胞仪检测，结果进一步证实MUC-1在COS-7细胞中得到了表达(Fig4).
图2 - 图4 略
3 讨论
人MUC-1基因的编码产物Mucin是一种Ⅰ型跨膜蛋白，它的多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞内段3部分组成，含有抗原表位的重复序列位于胞外段，其长度约为240～630nm，是细胞表面最先与机体免疫系统接触的膜表面分子，可诱发特异性抗肿瘤的CTL免疫应答[11，12] .核酸疫苗是指将含有编码保护性抗原基因的真核表达载体直接接种体内，在体内表达相应抗原以刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，以预防和治疗疾病.目的DNA可直接注入宿主体内(im，sc等)而不需要使用病毒载体，该方法安全、方便且疫苗制备容易、生产成本低廉.MUC-1的特有的结构和功能特点，使其成为一种肿瘤靶向治疗的靶抗原.研究表明，以MUC-1免疫原作为治疗肿瘤的疫苗具有广阔的应用价值[13-15] .
本研究构建的重组质粒pGEM-3zf-MUC-1经酶切鉴定和序列分析表明，克隆的MUC-1序列正确，重组子pcDNA3.1(+)-MUC-1的酶切鉴定说明MUC-1真核表达载体构建成功.脂质体是转染细胞的重要载体，脂质体包裹法是转染细胞的重要方法之一.本研究曾用脂质体包裹法转染COS-7，但转染效率差，可能与MUC-1基因分子大有关，故本实验采用电穿孔法，有利于MUC-1在COS-7细胞的转染及表达.其优点是无毒性、无免疫原性，特异性强，且方法简单，容易操作.间接免疫荧光法和流式细胞仪检测表明，MUC-1在COS-7细胞表达成功，免疫荧光染色发出荧光主要在细胞膜上，也证实了MUC-1粘蛋白是一种跨膜蛋白，为下一步MUC-1疫苗的研究奠定了基础.
参考文献:
[1]Moller H，Serttas N，Paulsen H，Burchell JM，Taylor-Pa-padimitriou J，Bernd M.NMR-based determination of the bind-ing epitope and conformational analysis of MUC-1glycopeptides and peptides bound to the breast cancer-selective monoclonal antibody SM3[J].Eur J Biochem，2002;269(5):1444-1455.
[2]Miles DW，Taylor-Papadimitriou J.Therapeutic aspects of polymorphic epithelial mucin in adenocarcinoma [J].Pharmacol Ther，1999;82(1):97-106.
[3]Gendler SJ，Lancaster CA，Taylor-Papadimitriou J，Duhig T，Peat N，Burchell J，Pemberton L，Lalani EI-N，Wilson D.Molecular Cloning and Expression of Human Tumor-associated Polymorphic Epithelial Mucin [J].J Biol Chem，1990;265(25):15286-15293.
[4]Rahn JJ，Dabbagh L，Pasdar M，Hugh JC.The importance of MUC1cellular localization in patients with breast carcinoma: An immunohistologic study of71patients and review of the lit-erature [J].Cancer，2001;91(11):1973-1982.
[5]von Mensdorff-Pouilly S，Snijdewint FG，Verstraeten AA，Ver-heijen RH，Kenemans P.Human MUC1mucin:A multifaceted glycoprotein [J].Int J Biol Markers，2000;15(4):343-356.
[6]Cui DX，Wang L，Yan XJ，Su CZ，Wang JB.Alteration of ex-pression of nm23-H1and muc1and their clinical significance [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1999;20(9):823-826.
[7]Lalani EI-N，Berdichevsky F，Boshell M，Shearer M，Wilson D，Stauss H，Gendler SJ，Taylor-Papadimitriou J.Expression of the gene coding for a human mucin in mouse mammary tumor cell can affect their tumorigenicity [J].J Biol Chem，1991;266(23):15420-15426.
[8]Mukherjee P，Ginardi AR，Tinder TL，Sterner CJ，Gendler SJ.MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo [J].Clin Cancer Res，2001;7(3Suppl):848s-855s.
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[11]Snijdewint FG，von Mensdorff-Pouilly S，Karuntu-Wanamarta AH，Verstraeten AA，Livingston PO，Hilgers J，Kenemans P.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity can be induced by MUC1peptide vaccination of breast cancer patients [J].Int J Cancer，2001;93(1):97-106.
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[14]Soares MM，Mehta V，Finn OJ.Three different vaccines based on the140-amino acid MUC1peptide with seven tandemly re-peated tumor-specific epitopes elicit distinct immune effector mechanisms in wild-type versus MUC1-transgenic mice with different potential for tumor rejection [J].J Immunol，2001;166(11):6555-6563.
[15]Musselli C，Ragupathi G，Gilewski T，Panageas KS，Spinat Y，Livingston PO.Reevaluation of the cellular immune response in breast cancer patients vaccinated with MUC1[J].Int J Cancer，2002;97(5):660-667.
通讯作者: 张英起.Tel.(029)3374773 Email.zhangyqi@fmmu.edu.cn
作者简介: 袁时芳(1964-)，男(汉族)，安徽省马鞍山市人.主治医师，讲师，博士生(导师李开宗，张英起).Tel.(029)3375271 Email.shifangy@fmmu.edu.cn
第四军医大学:1 西京医院血管内分泌外科，
2 西京医院肝胆外科，
3 科研部生物技术中心，陕西西安710033
编辑 王 睿, http://www.100md.com(袁时芳 李开宗 韩苇 颜真 张英起)
摘 要:目的 构建含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS-7细胞中的表达. 方法 将目的基因MUC-1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.亚克隆入真核质粒pcDNA3.1(+)，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MUC-1.用电穿孔法将重组质粒转入COS-7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC-1的表达. 结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC-1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC-1基因能在COS-7细胞中表达. 结论 人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础.
Construction of eukaryotic expression vectors con┐taining coding of human full length MUC┐1gene and its expression in COS┐7
YUAN Shi-Fang LI Kai-Zong HAN Wei YAN Zhen ZHANG Ying-Qi
1 Department of Vascular and Endocrine Surgery，
2 Department of Hepatobiliary Surgery，Xijing Hos-pital，
3 Biotechnology Center，Fourth Military Medi-cal University，Xi'an710033，China
Keywards:MUC-1gene;COS-7cell;electroporation;eu-karyotic expression
Abstract:AIM To construct an eukaryotic expression vec-tor containing the coding region of human full length MUC1gene and to detect its expression in COS-7cells.METHODS The MUC1gene was ligated into the sites of HindIII and Sal I of cloning vector pGEM-3zf.After identification，the gene was subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+).The recombinant pcDNA3.1(+)-MUC-1was trans-fected into COS-7cells by electroporation.Im-munoflourescence and FCM were used to detect the MUC1gene expression in COS-7cells.RESULTS Restriction anal-ysis and DNA sequencing showed that the recombinant plas-mid contained the coding region of human full length MUC1gene.Transfection experiment verified that MUC1gene could be expressed in COS-7cells.CONCLUSION The eu-karyotic expression vector containing the MUC1gene was succesfully constructed and expressed，which is a basis for the study for DNA vaccine.
0 引言
MUC-1又名PEM(polymorphic epithelial mucin)，该基因的一个重要特征是其多态性[1-3] (polymorphism)，即其第2个外显子中含有可变数量串联重复序列(variable number of tandem re-peats，VNTRs)，每个VNTR含有60个碱基，富含GC.不同人的VNTRs数量从20～125不等.正常情况下，MUC-1可表达于多种组织、器官中的上皮细胞.但研究[4-7] 发现，MUC-1在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达，即表达量增高，且整个细胞表面均表达.由于糖基化不全出现新的抗原表位，是一种肿瘤相关抗原;同时，由于MUC-1是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，肿瘤MUC-1可以非主要组织相容性复合体(MHC)限制性和MHC限制性方式活化杀伤性T淋巴细胞(CTLs)，这些活化的CTLs可杀伤表达MUC-1的肿瘤细胞[8] .因此，MUC-1是肿瘤主动特异性免疫治疗理想的靶分子.为研究MUC-1肿瘤核酸疫苗的特异性抗肿瘤作用，我们构建了含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察了该表达载体在COS-7细胞中的表达.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及细胞系 E.coli DH5α，pGEM-3zf(-)均由生物技术中心保存，MUC-1质粒(pVax-MUC-1，含32tandem repeats)和真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Imperial Cancer Research Fund的Taylor-Papadimitriou教授惠赠.COS-7细胞由本校生物化学和分子生物学教研室引进.
1.1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶HindⅢ，SalⅠ，XhoⅠ购自Gibco公司;T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;化学试剂均为国产分析纯.E.Z.N.AR plasmid Miniprep Kit购自Omega公司;核酸凝胶纯化试剂盒NucleoTrap R Gel Extraction Kit购自Clontech公司;DMEM购自Gibco公司;MUC-1mAb为Antibody Diagnostica公司产品;荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC购自华美公司;小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.
1.2 方法
1.2.1 MUC-1基因克隆 将质粒提取、酶切、连接及转化的主要方法均参照文献[9]进行.提取质粒pVax-MUC-1及pGEM-3zf(-)载体，分别经HindⅢ，XhoⅠ及HindⅢ，SalⅠ双酶切(SalⅠ与XholⅠ互补)，NucleoTrapR Gel Extraction Kit回收3.5kbp的MUC-1DNA片段及pGEM-3zf(-)，按DNA与载体3∶1比例于16℃连接过夜.取上述连接产物2μL转化感受态细胞DH5α，将转化后的DH5α涂布于含100mg·L-1 氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养.16h后挑取单克隆，提取质粒，经HindⅢ，XbaⅠ双酶切鉴定.
1.2.2 DNA序列测定 E.Z.N.A R plasmid Miniprep Kit小量快速法提取重组质粒pGEM-3zf-MUC-1，用T7promoter引物和SP6引物从正反两向测序.DNA序列测定在博亚公司完成.
1.2.3 真核表达载体的构建 重组质粒pGEM-3zf-MUC-1测序正确后，将双酶切回收之MUC-1目的基因，与预先经HindⅢ和XhoⅠ双酶切的pcD-NA3.1(+)载体进行连接反应.以连接反应液转化感受态DH5α，挑选10个转化菌落，小量法提取质粒，进行酶切鉴定.阳性重组子命名为pcDNA3.1(+)-MUC-1.
1.2.4 细胞培养 COS-7细胞用含100mL·L-1 FCS的DMEM培养于100mL细胞培养瓶，约75%长满，10g·L-1 胰酶加2g·L-1 EDTA消化后，2000r·min-1 离心10min，收集细胞，用少量1×PBS液重悬，调整细胞数至2×1010 个·L-1 .
1.2.5 质粒制备和电穿孔法转染COS-7细胞[10] 小量提取质粒pcDNA3.1(+)-MUC-1及pcDNA3.1(+)，用Omega E.Z.N.AR plasmid Miniprep Kit纯化后，紫外分光光度法测定DNA含量和纯度.调整DNA浓度为1g·L-1 .取质粒40μg加入0.8mL细胞悬液中混匀，移入0.4cm穿孔杯中，冰浴10min，放入电穿孔仪的正负电极之间，电击条件为电容50μF，电压450V，电阻250Ω，电击后，将穿孔杯继续冰浴10min，移入已加入含100mL·L-1 FCS的DMEM完全培养液的3cm塑料平皿，混匀，37℃，50mL·L-1 CO2 孵箱培养.
1.2.6 间接免疫荧光法检测MUC-1的表达 转染54h后，2g·L-1 EDTA消化并收集COS-7细胞，用1×PBS调整细胞数为(0.5～1.0)×1010 ·L-1 ;取40μL细胞悬液加入预先加有MUC-1mAb10μL的5mL离心管，再加50μL以1∶20稀释的灭活正常兔血清，4℃孵育30min，洗涤液洗涤2次，2mL/次，1000r·min-1 离心5min;弃上清，加50μL工作浓度的羊抗鼠Ig-FITC荧光二抗，充分振荡，4℃孵育30min，洗涤液洗涤2次，2mL/次，1000r·min-1 离心5min;加固定液100μL，制片后荧光显微镜下观察.
1.2.7 流式细胞仪检测MUC-1的表达 免疫荧光染色的转染COS-7细胞上机检测.
2 结果
2.1 MUC┐1基因的克隆 选择重组克隆提取质粒，经双酶切鉴定，切出3.5kb的片段(Fig1)，表明MUC-1全长cDNA已克隆于载体中，命名为pGEM-3zf-MUC-1.
图1 略
2.2 MUC┐1基因的序列测定及分析 直接以pGEM-3zf-MUC-1为模板进行DNA测序，经计算机分析，与已知的包括13个氨基酸信号肽序列在内的人MUC-1cDNA序列相符.
2.3 pcDNA3.1(+)┐MUC┐1真核表达载体的鉴定 将重组的pcDNA3.1(+)-MUC-1质粒DNA以HindⅢ和XholⅠ双酶切鉴定，结果表明，MUC-1基因正确插入pcDNA3.1(+)载体的预期酶切位点之间(Fig2).
2.4 间接免疫荧光法检测MUC┐1在COS┐7细胞中的表达 活细胞免疫荧光染色观察发现，pcDNA3.1(+)空载体转染的细胞内未见荧光，而经pcDNA3.1(+)-MUC-1重组质粒转染的COS-7细胞膜及胞质中可见明亮荧光，表明pcDNA3.1(+)-MUC-1在COS-7细胞中得到了表达(Fig3).
2.5 流式细胞仪检测 免疫荧光染色的转染细胞经流式细胞仪检测，结果进一步证实MUC-1在COS-7细胞中得到了表达(Fig4).
图2 - 图4 略
3 讨论
人MUC-1基因的编码产物Mucin是一种Ⅰ型跨膜蛋白，它的多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞内段3部分组成，含有抗原表位的重复序列位于胞外段，其长度约为240～630nm，是细胞表面最先与机体免疫系统接触的膜表面分子，可诱发特异性抗肿瘤的CTL免疫应答[11，12] .核酸疫苗是指将含有编码保护性抗原基因的真核表达载体直接接种体内，在体内表达相应抗原以刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，以预防和治疗疾病.目的DNA可直接注入宿主体内(im，sc等)而不需要使用病毒载体，该方法安全、方便且疫苗制备容易、生产成本低廉.MUC-1的特有的结构和功能特点，使其成为一种肿瘤靶向治疗的靶抗原.研究表明，以MUC-1免疫原作为治疗肿瘤的疫苗具有广阔的应用价值[13-15] .
本研究构建的重组质粒pGEM-3zf-MUC-1经酶切鉴定和序列分析表明，克隆的MUC-1序列正确，重组子pcDNA3.1(+)-MUC-1的酶切鉴定说明MUC-1真核表达载体构建成功.脂质体是转染细胞的重要载体，脂质体包裹法是转染细胞的重要方法之一.本研究曾用脂质体包裹法转染COS-7，但转染效率差，可能与MUC-1基因分子大有关，故本实验采用电穿孔法，有利于MUC-1在COS-7细胞的转染及表达.其优点是无毒性、无免疫原性，特异性强，且方法简单，容易操作.间接免疫荧光法和流式细胞仪检测表明，MUC-1在COS-7细胞表达成功，免疫荧光染色发出荧光主要在细胞膜上，也证实了MUC-1粘蛋白是一种跨膜蛋白，为下一步MUC-1疫苗的研究奠定了基础.
参考文献:
[1]Moller H，Serttas N，Paulsen H，Burchell JM，Taylor-Pa-padimitriou J，Bernd M.NMR-based determination of the bind-ing epitope and conformational analysis of MUC-1glycopeptides and peptides bound to the breast cancer-selective monoclonal antibody SM3[J].Eur J Biochem，2002;269(5):1444-1455.
[2]Miles DW，Taylor-Papadimitriou J.Therapeutic aspects of polymorphic epithelial mucin in adenocarcinoma [J].Pharmacol Ther，1999;82(1):97-106.
[3]Gendler SJ，Lancaster CA，Taylor-Papadimitriou J，Duhig T，Peat N，Burchell J，Pemberton L，Lalani EI-N，Wilson D.Molecular Cloning and Expression of Human Tumor-associated Polymorphic Epithelial Mucin [J].J Biol Chem，1990;265(25):15286-15293.
[4]Rahn JJ，Dabbagh L，Pasdar M，Hugh JC.The importance of MUC1cellular localization in patients with breast carcinoma: An immunohistologic study of71patients and review of the lit-erature [J].Cancer，2001;91(11):1973-1982.
[5]von Mensdorff-Pouilly S，Snijdewint FG，Verstraeten AA，Ver-heijen RH，Kenemans P.Human MUC1mucin:A multifaceted glycoprotein [J].Int J Biol Markers，2000;15(4):343-356.
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通讯作者: 张英起.Tel.(029)3374773 Email.zhangyqi@fmmu.edu.cn
作者简介: 袁时芳(1964-)，男(汉族)，安徽省马鞍山市人.主治医师，讲师，博士生(导师李开宗，张英起).Tel.(029)3375271 Email.shifangy@fmmu.edu.cn
第四军医大学:1 西京医院血管内分泌外科，
2 西京医院肝胆外科，
3 科研部生物技术中心，陕西西安710033
编辑 王 睿, http://www.100md.com(袁时芳 李开宗 韩苇 颜真 张英起)