第十九章 第三节 蛋白质类药物新型给药系统(1)
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《药剂学(第五版)》
一、新型注射(植入)给药系统
临床经验表明，很多蛋白质类药物在体内血浆半衰期短，清除率高，因而需要延长其在体内的平均驻留时间，或改变蛋白质在体内的药物动力学性质，有时需要制成非零级脉冲式释药系统(如疫苗)。为满足这些要求，既可以对蛋白质分子进行化学修饰，也可以控制蛋白质进入血流的释放速度等。目前已有用PEG修饰蛋白质分子以延长蛋白质药物在血浆中的半衰期。例如 PEG与蛋白质连接分子变大而不易被肾小球滤过，或者由于蛋白质的代谢和排泄所需的细胞受体的相互作用受到空间位阻。腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)即采用形成PEG-ADA这种方法，治疗因ADA缺乏而引起免疫缺损综合征的患者，此药已经获FDA批准生产
(一)控释微球制剂
为了达到蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂，目前已经实际应用的生物可降解材料有聚乳酸(PLA)或聚丙交酯-乙交酯(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)。PLGA也可叫聚乳酸乙醇酸共聚物(copoly(lactic／glycolic) acid)，改变丙交酯与乙交酯的比例或分子量，可得到不同时间生物可降解性质的材料。首次经FDA批准的蛋白质类药物微球制剂是醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)聚丙交酯-乙交酯微球。此种微球供肌内注射，用于治疗前列腺癌，可控制释放达30d之久，改变了普通注射剂需每天注射的传统，使用方便。
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用于制备生物大分子药物控释微球的方法很多，根据不同性质的载体材料可选择不同的制备方法。如相分离凝聚法、乳化蒸发法、复乳液中干燥法、低温喷雾提取法、喷雾干燥法以及超临界萃取法等，参见第十六章第四节。以下介绍几种常用于制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的方法。
1．复乳液中干燥法 将药物与保护剂(多为水溶性高分子聚合物)溶于水作为水相，将聚酯(如PLA、PLGA等)类高分子材料溶于二氯甲烷作为油相，两者在一定温度下(低于40℃)高速搅拌得W/O型初乳，冰浴冷却至10℃以下，倒至一定浓度的PVA水溶液中，经高速搅拌得W/O/W型复乳，一定温度下搅拌蒸去有机溶剂固化微球(或减压去有机溶剂)，离心水洗，真空干燥即得。该方法是制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的常用方法，其特点为药物包封率较高，药物活性损失小，设备和工艺简单，但首日突释明显，较难放大生产，目前用此法研究制备的药物有γ干扰素、白细胞介素、亮丙瑞林、人生长激素、环孢素以及促红细胞生长素(EPO)等。
, 百拇医药 2．低温喷雾提取法 将生物大分子药物与保护剂的均匀粉末加至生物可降解性聚合物的有机溶剂(如二氯甲烷)中混合形成混悬液，将此混悬液经喷头雾化后喷入冰冻的乙醇溶液(该溶液可与上述溶液混溶，但聚合物不溶于此溶液)，在低温(-70℃)状态下，聚合物载体中的有机溶剂在乙醇中不断扩散完全，分离微球，低温干燥除去乙醇得粉末状微球，该方法的特点：包封率高，微球粒径集中，工艺稳定，可实现产业化，但其活性损失较复乳液中干燥法大。
3．喷雾干燥法 将生物大分子药物及其稳定剂的混合粉末(或水溶液)与溶有高分子聚合物的有机溶液混合形成混悬液(或乳浊液)，将此混悬液(或乳浊液)经喷嘴雾化干燥制得微球。为了减少生物活性损失，文献报道采用双喷嘴喷雾干燥装置进行生物大分子药物微球的制备，可明显增加微球的收率，同时可减少多肽、蛋白质类药物的活性损失。该装置具有两个平行喷嘴，其中一个喷嘴喷出药物和聚合物的混悬液(或乳浊液)，另一喷嘴同时喷出5%的甘露醇溶液，将微球包层，这样可避免普通喷雾干燥装置制备微球过程中易粘附器壁的缺陷。
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4．超临界萃取法 超临界萃取技术是从20世纪80年代逐渐发展起来的一门新技术。近年来，超临界萃取技术已在化工、冶金、食品、医药、生物等领域得到广泛应用。超临界流体既具有对溶质有较大溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性。更重要的是在临界点附近，压力和温度微小的变化都可以引起流体密度很大的变化，并相应地表现为溶解度的变化。因此，人们可以利用压力、温度的变化来实现萃取和分离的过程而成为实现药物多组分分离的一种有效方法。人们将此技术应用于微粒给药系统，制备药物的控释聚合物微球、药物结晶的粉末、控释脂质体药物等。在制备微粒中根据聚合物及药物的溶解特性又分为超临界溶液快速膨胀(rapid expansion of supercritical solution，RESS)技术和气体反溶剂(gas antisolution，GAS)技术。RESS技术的操作过程是：将固体物质在一定的温度和压力下溶解在超临界流体中形成溶液，然后将此高压溶液从一个细小的喷嘴(一般喷嘴的内径为几十微米，长约几个毫米)喷射到常压的空间中，由于超临界流体在减压的过程中变成了气体，溶解在其中的溶质就沉淀析出，产生直径从几百纳米到几个微米左右的颗粒。一个典型的成功例子是包埋在聚乳酸小球中的Lovastatin晶体。颗粒的构型可以通过适当改变压力、温度、溶液浓度以及喷嘴几何形装来调节。因此用RESS技术得到的固体颗粒都在微米级而且粒径分布比较均匀。
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GAS技术是将溶质先溶解在某种有机溶剂中，然后将此溶液与超临界流体混合。由于有机溶剂可溶于超临界流体而溶质不溶，于是溶质析出形成微粒。由于液态二氧化碳对于有机溶剂具有溶解性，将药物与高分子材料溶解于有机溶剂中，将此溶液与液态二氧化碳混合，载有药物的高分子材料则析出形成微球。
Raouf G等采用超临界流体技术的RESS法和三种聚酯类高分子材料(DL-PLGA、L-PLA、DL-PLA)制备了氢化可的松微球，三种材料制得的微球均小于10μm，采用N2和CO2混合物比单用CO2可取得更高的分散度，空白微球和包封氢化可的松的微球的粒径大小无明显变化，氢化可的松收率为40%。
【实例1】
亮丙瑞林微球的制备：通过复乳液中干燥法制备。
取醋酸亮丙瑞林500mg，明胶80mg，水lml，混合加热至60℃为内水相，油相为PLA或PLGA 400mg溶于二氯甲烷5.5ml，然后将油相在搅拌或超声处理逐渐倒入水相中制成W／O微乳剂，此乳剂冷却至15℃，在5000r／min下用喷嘴加入到400m1，0.5％的聚乙烯醇水溶液中搅拌2min使成(W／O／W)乳剂。将此(W／O／W)乳剂在30℃下缓慢搅拌2h或旋转蒸发除去二氯甲烷，得硬化的圆形微球(或微囊)。粒径为5μm ~100μm，平均粒径20μm。药物含量约10％，体内外释放见表19-3。
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表19-3醋酸亮丙瑞林体内外释放与PLGA(75／25)平均分子量(12000)的关系
时间／d体外释放体内释放
剩余醋酸
亮丙瑞林／％PLGA
平均分子量剩余醋酸
亮丙瑞林／％PLGA
平均分子量
01001200010012000
770105007910500
14579400608800
21375600375000
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28215000302800
3502600202200
表19-3说明醋酸亮丙瑞林随PLGA降解分子量下降而不断释放，在体内外大体一致，体内能维持一个月。
【实例2】
白细胞介素1α(IL-1α)PLGA微球的制备：Limor Chen等以改良的复乳溶剂挥发法制备。具体方法为：将含有20mg牛血清白蛋白(BSA)和8.5μg IL-1α的水溶液50μl与含有200mgPLGA的二氯甲烷0.5ml混合，用探针式超声乳化(56w)30s，将此初乳分散于1ml用二氯甲烷饱和的1%(w/v)PVA水溶液中，漩涡混悬形成复乳，再将该复乳倾入50ml 0.1%(w/w)PVA水溶液中搅拌5min，再加入50ml含有10%(v/v)2-丙醇的PVA溶液将二氯甲烷抽提到外水相中，连续搅拌30min后，离心10min收集微球，冰冻干燥成流动性粉末状微球。由于皮下注射微球后小于10μm微球易被巨噬细胞吞噬，故需将微球粒径控制在10μm以上。制备过程中界面张力影响IL-1α的活性，加入0.5%(w/w)磷脂酰胆碱(PC)可保护IL-1α，并显著减小微球的粒径。微球的体外释放度试验表明，牛血清白蛋白和白细胞介素1α在30min钟内分别释放38%和63%，40d内分别释放75%和100%。扫描电镜显示，突释后的释药过程与骨架的溶蚀过程同时进行。
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这类制剂，尽管发展前景广阔，但仍存在许多问题，主要是由于在体内多聚物降解而产生的酸性环境降低了蛋白质分子的稳定性，因此如何加入弱碱性添加剂以保持多聚物在降解过程中的蛋白质分子的稳定性是目前此类产品亟待解决的问题。
(二)脉冲式给药系统
肝炎、破伤风、白喉等疾病所用预防药物，即疫苗或类毒素均为抗原蛋白，使用这些疫苗全程免疫至少要进行三次接种，才能确保免疫效果。由于种种原因，全世界不能完成全程免疫接种而发生的辍种率达70%，因此为了提高免疫接种的覆盖率，减少重大疾病的死亡率，采用脉冲式给药系统将多剂量疫苗发展为单剂量控释疫苗，例如将破伤风类毒素制成PLGA脉冲式控释微球制剂，可根据PLGA中乳酸和羟乙酸的比例不同、分子量不同以及制备的微球大小不同，一次注射该制剂1d~14 d、l个月~2个月与9个月~12个月内分三次脉冲释放，可达到全程免疫的目的。此项研究，目前正在进行中。, http://www.100md.com
临床经验表明，很多蛋白质类药物在体内血浆半衰期短，清除率高，因而需要延长其在体内的平均驻留时间，或改变蛋白质在体内的药物动力学性质，有时需要制成非零级脉冲式释药系统(如疫苗)。为满足这些要求，既可以对蛋白质分子进行化学修饰，也可以控制蛋白质进入血流的释放速度等。目前已有用PEG修饰蛋白质分子以延长蛋白质药物在血浆中的半衰期。例如 PEG与蛋白质连接分子变大而不易被肾小球滤过，或者由于蛋白质的代谢和排泄所需的细胞受体的相互作用受到空间位阻。腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)即采用形成PEG-ADA这种方法，治疗因ADA缺乏而引起免疫缺损综合征的患者，此药已经获FDA批准生产
(一)控释微球制剂
为了达到蛋白质类药物控制释放，可将其制成生物可降解的微球制剂，目前已经实际应用的生物可降解材料有聚乳酸(PLA)或聚丙交酯-乙交酯(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)。PLGA也可叫聚乳酸乙醇酸共聚物(copoly(lactic／glycolic) acid)，改变丙交酯与乙交酯的比例或分子量，可得到不同时间生物可降解性质的材料。首次经FDA批准的蛋白质类药物微球制剂是醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)聚丙交酯-乙交酯微球。此种微球供肌内注射，用于治疗前列腺癌，可控制释放达30d之久，改变了普通注射剂需每天注射的传统，使用方便。
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用于制备生物大分子药物控释微球的方法很多，根据不同性质的载体材料可选择不同的制备方法。如相分离凝聚法、乳化蒸发法、复乳液中干燥法、低温喷雾提取法、喷雾干燥法以及超临界萃取法等，参见第十六章第四节。以下介绍几种常用于制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的方法。
1．复乳液中干燥法 将药物与保护剂(多为水溶性高分子聚合物)溶于水作为水相，将聚酯(如PLA、PLGA等)类高分子材料溶于二氯甲烷作为油相，两者在一定温度下(低于40℃)高速搅拌得W/O型初乳，冰浴冷却至10℃以下，倒至一定浓度的PVA水溶液中，经高速搅拌得W/O/W型复乳，一定温度下搅拌蒸去有机溶剂固化微球(或减压去有机溶剂)，离心水洗，真空干燥即得。该方法是制备多肽、蛋白质等生物大分子药物微球的常用方法，其特点为药物包封率较高，药物活性损失小，设备和工艺简单，但首日突释明显，较难放大生产，目前用此法研究制备的药物有γ干扰素、白细胞介素、亮丙瑞林、人生长激素、环孢素以及促红细胞生长素(EPO)等。
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3．喷雾干燥法 将生物大分子药物及其稳定剂的混合粉末(或水溶液)与溶有高分子聚合物的有机溶液混合形成混悬液(或乳浊液)，将此混悬液(或乳浊液)经喷嘴雾化干燥制得微球。为了减少生物活性损失，文献报道采用双喷嘴喷雾干燥装置进行生物大分子药物微球的制备，可明显增加微球的收率，同时可减少多肽、蛋白质类药物的活性损失。该装置具有两个平行喷嘴，其中一个喷嘴喷出药物和聚合物的混悬液(或乳浊液)，另一喷嘴同时喷出5%的甘露醇溶液，将微球包层，这样可避免普通喷雾干燥装置制备微球过程中易粘附器壁的缺陷。
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4．超临界萃取法 超临界萃取技术是从20世纪80年代逐渐发展起来的一门新技术。近年来，超临界萃取技术已在化工、冶金、食品、医药、生物等领域得到广泛应用。超临界流体既具有对溶质有较大溶解度的特点，又具有气体易于扩散和运动的特性。更重要的是在临界点附近，压力和温度微小的变化都可以引起流体密度很大的变化，并相应地表现为溶解度的变化。因此，人们可以利用压力、温度的变化来实现萃取和分离的过程而成为实现药物多组分分离的一种有效方法。人们将此技术应用于微粒给药系统，制备药物的控释聚合物微球、药物结晶的粉末、控释脂质体药物等。在制备微粒中根据聚合物及药物的溶解特性又分为超临界溶液快速膨胀(rapid expansion of supercritical solution，RESS)技术和气体反溶剂(gas antisolution，GAS)技术。RESS技术的操作过程是：将固体物质在一定的温度和压力下溶解在超临界流体中形成溶液，然后将此高压溶液从一个细小的喷嘴(一般喷嘴的内径为几十微米，长约几个毫米)喷射到常压的空间中，由于超临界流体在减压的过程中变成了气体，溶解在其中的溶质就沉淀析出，产生直径从几百纳米到几个微米左右的颗粒。一个典型的成功例子是包埋在聚乳酸小球中的Lovastatin晶体。颗粒的构型可以通过适当改变压力、温度、溶液浓度以及喷嘴几何形装来调节。因此用RESS技术得到的固体颗粒都在微米级而且粒径分布比较均匀。
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GAS技术是将溶质先溶解在某种有机溶剂中，然后将此溶液与超临界流体混合。由于有机溶剂可溶于超临界流体而溶质不溶，于是溶质析出形成微粒。由于液态二氧化碳对于有机溶剂具有溶解性，将药物与高分子材料溶解于有机溶剂中，将此溶液与液态二氧化碳混合，载有药物的高分子材料则析出形成微球。
Raouf G等采用超临界流体技术的RESS法和三种聚酯类高分子材料(DL-PLGA、L-PLA、DL-PLA)制备了氢化可的松微球，三种材料制得的微球均小于10μm，采用N2和CO2混合物比单用CO2可取得更高的分散度，空白微球和包封氢化可的松的微球的粒径大小无明显变化，氢化可的松收率为40%。
【实例1】
亮丙瑞林微球的制备：通过复乳液中干燥法制备。
取醋酸亮丙瑞林500mg，明胶80mg，水lml，混合加热至60℃为内水相，油相为PLA或PLGA 400mg溶于二氯甲烷5.5ml，然后将油相在搅拌或超声处理逐渐倒入水相中制成W／O微乳剂，此乳剂冷却至15℃，在5000r／min下用喷嘴加入到400m1，0.5％的聚乙烯醇水溶液中搅拌2min使成(W／O／W)乳剂。将此(W／O／W)乳剂在30℃下缓慢搅拌2h或旋转蒸发除去二氯甲烷，得硬化的圆形微球(或微囊)。粒径为5μm ~100μm，平均粒径20μm。药物含量约10％，体内外释放见表19-3。
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表19-3醋酸亮丙瑞林体内外释放与PLGA(75／25)平均分子量(12000)的关系
时间／d体外释放体内释放
剩余醋酸
亮丙瑞林／％PLGA
平均分子量剩余醋酸
亮丙瑞林／％PLGA
平均分子量
01001200010012000
770105007910500
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28215000302800
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表19-3说明醋酸亮丙瑞林随PLGA降解分子量下降而不断释放，在体内外大体一致，体内能维持一个月。
【实例2】
白细胞介素1α(IL-1α)PLGA微球的制备：Limor Chen等以改良的复乳溶剂挥发法制备。具体方法为：将含有20mg牛血清白蛋白(BSA)和8.5μg IL-1α的水溶液50μl与含有200mgPLGA的二氯甲烷0.5ml混合，用探针式超声乳化(56w)30s，将此初乳分散于1ml用二氯甲烷饱和的1%(w/v)PVA水溶液中，漩涡混悬形成复乳，再将该复乳倾入50ml 0.1%(w/w)PVA水溶液中搅拌5min，再加入50ml含有10%(v/v)2-丙醇的PVA溶液将二氯甲烷抽提到外水相中，连续搅拌30min后，离心10min收集微球，冰冻干燥成流动性粉末状微球。由于皮下注射微球后小于10μm微球易被巨噬细胞吞噬，故需将微球粒径控制在10μm以上。制备过程中界面张力影响IL-1α的活性，加入0.5%(w/w)磷脂酰胆碱(PC)可保护IL-1α，并显著减小微球的粒径。微球的体外释放度试验表明，牛血清白蛋白和白细胞介素1α在30min钟内分别释放38%和63%，40d内分别释放75%和100%。扫描电镜显示，突释后的释药过程与骨架的溶蚀过程同时进行。
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这类制剂，尽管发展前景广阔，但仍存在许多问题，主要是由于在体内多聚物降解而产生的酸性环境降低了蛋白质分子的稳定性，因此如何加入弱碱性添加剂以保持多聚物在降解过程中的蛋白质分子的稳定性是目前此类产品亟待解决的问题。
(二)脉冲式给药系统
肝炎、破伤风、白喉等疾病所用预防药物，即疫苗或类毒素均为抗原蛋白，使用这些疫苗全程免疫至少要进行三次接种，才能确保免疫效果。由于种种原因，全世界不能完成全程免疫接种而发生的辍种率达70%，因此为了提高免疫接种的覆盖率，减少重大疾病的死亡率，采用脉冲式给药系统将多剂量疫苗发展为单剂量控释疫苗，例如将破伤风类毒素制成PLGA脉冲式控释微球制剂，可根据PLGA中乳酸和羟乙酸的比例不同、分子量不同以及制备的微球大小不同，一次注射该制剂1d~14 d、l个月~2个月与9个月~12个月内分三次脉冲释放，可达到全程免疫的目的。此项研究，目前正在进行中。, http://www.100md.com