第十二章 第六节 药物稳定性试验方法(2)
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《药剂学(第五版)》
三、长期试验
长期试验(long-term testing)是在接近药品的实际贮存条件下进行，其目的是为制定药物的有效期提供依据。原料药与药物制剂均需进行长期试验，供试品三批，市售包装，在温度25±2℃，相对湿度60±10％的条件下放置12个月。每3个月取样一次，分别于0、3、6、9、12个月，按稳定性重点考察项目进行检测。6个月的数据可用于新药申报临床研究，12个月的数据用于申报生产，12个月以后，仍需继续考察，分别于18、24、36个月取样进行检测。将结果与0月比较以确定药品的有效期。若未取得足够数据(如只有18个月)，则应进行统计分析，以确定药品的有效期，统计分析方法见本节第五项。如三批统计分析结果差别较小则取其平均值为有效期限，若差别较大，则取其最短的为有效期，很稳定的药品，不作统计分析。
对温度特别敏感的药品，长期试验可在温度6±2℃的条件下放置12个月，按上述时间要求进行检测，12个月以后，仍需按规定继续考察，制定在低温贮条件下的有效期。
, 百拇医药
此种方式确定的药品有效期，在药品标签及说明书中均应指明在什么温度下保存，不得使用"室温"之类的名词。
对原料药进行加速试验与长期试验时所用包装可用模拟小桶，但所用材料与封装条件应与大桶一致。
四、稳定性重点考查项目
稳定性重点考查项目见表12-3。
表12-3 原料药及药物制剂稳定性重点考查项目表
剂 型
稳 定 性 重 点 考 查 项 目
原料药
性状、熔点、含量、有关物质、吸湿性以及根据品种性质选定的考查项目
, 百拇医药
片剂
性状、如为包衣片应同时考查片芯、含量、有关物质、溶解时限或溶出度
胶囊性状、内容物色泽、含量、降解产物、溶出度、水分，软胶囊需要检查内容物有无沉淀
注射液
外观色泽、含量、pH值、澄明度、有关物质、无菌检查、输液还应检查热原、不溶性微粒、塑料瓶容器还应检查可抽提物
栓剂性状、含量、软化、融变时限、有关物质
软膏性状、含量、均匀性、粒度、有关物质、如乳膏还应检查有无分层现象
眼膏性状、含量、均匀性、粒度、有关物质
滴眼剂如为澄清液，应考查：性状、澄明度、含量、pH值、有关物质、无菌检查、致病菌
, 百拇医药
如为混悬液，不检查澄明度、检查再悬浮性、粒度
丸剂性状、含量、色泽、有关物质，溶散时限
糖浆剂性状、含量、澄清度、相对密度、有关物质、卫生学检查、pH值
口服溶液剂性状、含量、色泽、澄清度、有关物质
乳剂性状、含量、分层速度、有关物质
混悬剂性状、含量、再悬性、粒度、有关物质
酊剂性状、含量、有关物质、含醇量
散剂性状、含量、粒度、外观均匀度、有关物质
计量吸入气雾剂容器严密性、含量、有关物质、每揿动一次的释放剂量、有效部位药物沉积量
, 百拇医药
膜剂性状、含量、溶化时限、有关物质、眼用膜剂应作无菌检查
颗粒剂性状、含量、粒度、溶化性
透皮帖片性状、含量、有关物质、释放度
搽剂性状、含量、有关物质
注：有关物质(含其他变化所生成的产物)应说明其生成产物的数目及量的变化，如有可能说明，应说明有关物质中哪个为原料中间体，哪个为降解产物，稳定性试验中重点考察降解产物。
五、有效期统计分析
在确定有效期的统计分析过程中，一般选择可以定量的指标进行处理，通常根据药物含量变化计算，按照长期试验测定数值，以标示量％对时间进行直线回归，获得回归方程，求出各时间点标示量的计算值(y'),然后计算标示量(y')95％单侧可信限的置信区间为y'±z，其中：
, 百拇医药
(12-21)
式中，tN-2-概率0.05，自由度N-2的t单侧分布值(见表12-4)，N为数组；X0-给定自变量； -自变量X的平均值；
(12-22)
式中， ；Lyy-y的离差平方和， ；Lxy-xy的离差乘积之和 ；b-直线斜率。
将有关点连接可得出分布于回归线两侧的曲线。取质量标准中规定的含量低限(根据各品种实际规定限度确定)与置信区间下界线相交点对应的时间，即为药物的有效期。根据情况也可拟合为二次或三次方程或对数函数方程。
此种方式确定的药物有效期，在药物标签及说明书中均指明什么温度下保存，不得使用"室温"之类的名词。
例：某药物在温度25±2℃，相对温度60±10%的条件下进行长期实验，得各时间的标示量如表12-4。
, 百拇医药
表12-4 供试品各时间的标示量
时间/月03691218
标示量/%99.397.697.398.496.094.0
以时间为自变量(x)，标示量%(y)为因变量进行回归，得回归方程
y= 99.18－0.26x，r=0.8970，查T单侧分布表，当自由度为4，P=0.05得
tN-2=2.132
当X0=0时，(即0月)
= 2.132×0.9297×
= 1.356
, 百拇医药 按回归方程计算0月时的y'值得99.18%，则y'值置信区间y'±z，即：
99.18 + 1.356=100.54
99.18－1.356=97.82
其他各时间(3、6、9、12、18月)的y'及置信区间按同法计算，结果见表12-5。
表12-5 稳定性数据表
时间
/月实测标示量(y)/%
计算标示量(y')/%
下界值
y'－z上界值
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y'+z
099.399.1897.82100.54
397.698.4097.3499.45
697.397.6296.7798.47
998.496.8496.0297.66
1296.096.0695.0897.04
1894.094.5092.9296.09
2492.9490.6195.27
3091.3888.2794.49
3689.8285.9193.72
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用时间与y、y'、y'－z、y'＋z作图，得图12-6，从标示量90%处划一条直线与置信区间下界线相交，自交点作垂线于时间轴相交处，即为有效期，本例有效期为25.5个月。
图12-6 药品产品有效期估算图
六、经典恒温法
前述实验方法主要用于新药申请，但在实际研究工作中，也可考虑采用经典恒温法，特别对水溶液的药物制剂，预测结果有一定的参考价值。
经典恒温法的理论依据是前述Arrhenius的指数定律K=Ae-E/RT，其对数形式为
(12-23)
以logK对1/T作图得一直线，此图称Arrhenius图，直线斜率为-E/(2.303R)，由此可计算出活化能E。若将直线外推至室温，就可求出室温时的速度常数(K25)。由K25可求出分解10%所需的时间(即T0.9)或室温贮藏若干时间以后残余的药物的浓度。
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实验设计时，除了首先确定含量测定方法外，还要进行预试，以便对该药的稳定性有一个基本的了解，然后设计实验温度与取样时间。计划好后，将样品放入各种不同温度的恒温水浴中，定时取样测定其浓度(或含量)，求出各温度下不同时间药物的浓度变化。以药物浓度或浓度的其他函数对时间作图，以判断反应级数。若以logc对T作图得一直线，则为一级反应。再由直线斜率求出各温度的速度常数，然后按前述方法求出活化能和T0.9。
要想得到预期的结果，除了精心设计实验外，很重要的问题是对实验数据进行正确的处理。化学动力学参数(如反应级数、K、E、T1/2)的计算，有图解法和统计学方法，后一种方法比较准确、合理，故近来在稳定性的研究中广泛应用。下面介绍线性回归法。例如某药物制剂，在40℃、50℃、60℃、70℃四个温度下进行加速实验，测得各个时间的浓度，确定为一级反应，用线性回归法求出各温度的速度常数，结果见表12-6。
表12-6 动力学数据表
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T/℃1/T×103K×105/h-1lgK
403.1922.66－4.575
503.0947.94－4.100
603.00122.38－3.650
702.91356.50－3.248
将上述数据(logK对1/T)进行一元线性回归，得回归方程：
logK=－47.65.98/T+10.64
E=－(－4765.98)×2.303×8.319
=91309.77(J/mol)=91.31(kJ/mol)
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除经典恒温法外，还有线性变温法，Q10法，活化能估算法等，在研究工作中，有时可以应用。
七、固体制剂稳定性实验的特殊要求和特殊方法
(一)固体剂型稳定性实验的特殊要求
前节所述加速实验方法，一般适用于固体制剂，但根据固体药物稳定性的特点，还要有一些特殊要求，须引起实验者的注意：①如水分对固体药物稳定性影响较大，则每个样品必须测定水分，加速实验过程中也要测定；②样品必须密封容器，但为了考察材料的影响，可以用开口容器与密封容器同时进行，以便比较；③测定含量和水分的样品，都要分别单次包装；④固体剂型要使样品含量尽量均匀，以避免测定结果的分散性；⑤药物颗粒的大小对结果也有影响，故样品要用一定规格的筛号过筛，并测定其粒度，固体的表面是微粉的重要性质，必要时可用BET方法测定；⑥实验温度不宜过高，以60℃以下为宜。
此外还需注意赋形剂对药物稳定性的影响。研究这种影响，通常可用下述方法设计实验：药物与赋形剂以1：5配料，药物与润滑剂按20：1配料。常用赋形剂和润滑剂有淀粉、糊精、蔗糖、磷酸氢钙、硫酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸等。配好料后，其中一半用小瓶密封，另一半吸入或加入5%水后，也用小瓶密封。然后在5、25、50、60℃温度和4500lx光照下进行加速实验，定期取样测含量或薄层分析，并观察外观、色泽等变化，以判断赋形剂是否影响药物的稳定性。
药物与赋形剂有无相互作用，比较适用的实验方法有热分析法、漫反射光谱法和薄层层析法。
(二)热分析法在研究固体药物稳定性中的应用
热分析法以差示热分析法(differential thermal analysis, DTA)和差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)为常用。
此外还可用漫反射光谱法测定药物的颜色变化及药物与辅料的相互作用。固体药物制剂稳定性，目前积累资料还不多，有待进一步研究发展。前面只是介绍一些基本内容，读者如欲进一步了解，可以参阅有关文献。, 百拇医药
长期试验(long-term testing)是在接近药品的实际贮存条件下进行，其目的是为制定药物的有效期提供依据。原料药与药物制剂均需进行长期试验，供试品三批，市售包装，在温度25±2℃，相对湿度60±10％的条件下放置12个月。每3个月取样一次，分别于0、3、6、9、12个月，按稳定性重点考察项目进行检测。6个月的数据可用于新药申报临床研究，12个月的数据用于申报生产，12个月以后，仍需继续考察，分别于18、24、36个月取样进行检测。将结果与0月比较以确定药品的有效期。若未取得足够数据(如只有18个月)，则应进行统计分析，以确定药品的有效期，统计分析方法见本节第五项。如三批统计分析结果差别较小则取其平均值为有效期限，若差别较大，则取其最短的为有效期，很稳定的药品，不作统计分析。
对温度特别敏感的药品，长期试验可在温度6±2℃的条件下放置12个月，按上述时间要求进行检测，12个月以后，仍需按规定继续考察，制定在低温贮条件下的有效期。
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此种方式确定的药品有效期，在药品标签及说明书中均应指明在什么温度下保存，不得使用"室温"之类的名词。
对原料药进行加速试验与长期试验时所用包装可用模拟小桶，但所用材料与封装条件应与大桶一致。
四、稳定性重点考查项目
稳定性重点考查项目见表12-3。
表12-3 原料药及药物制剂稳定性重点考查项目表
剂 型
稳 定 性 重 点 考 查 项 目
原料药
性状、熔点、含量、有关物质、吸湿性以及根据品种性质选定的考查项目
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片剂
性状、如为包衣片应同时考查片芯、含量、有关物质、溶解时限或溶出度
胶囊性状、内容物色泽、含量、降解产物、溶出度、水分，软胶囊需要检查内容物有无沉淀
注射液
外观色泽、含量、pH值、澄明度、有关物质、无菌检查、输液还应检查热原、不溶性微粒、塑料瓶容器还应检查可抽提物
栓剂性状、含量、软化、融变时限、有关物质
软膏性状、含量、均匀性、粒度、有关物质、如乳膏还应检查有无分层现象
眼膏性状、含量、均匀性、粒度、有关物质
滴眼剂如为澄清液，应考查：性状、澄明度、含量、pH值、有关物质、无菌检查、致病菌
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如为混悬液，不检查澄明度、检查再悬浮性、粒度
丸剂性状、含量、色泽、有关物质，溶散时限
糖浆剂性状、含量、澄清度、相对密度、有关物质、卫生学检查、pH值
口服溶液剂性状、含量、色泽、澄清度、有关物质
乳剂性状、含量、分层速度、有关物质
混悬剂性状、含量、再悬性、粒度、有关物质
酊剂性状、含量、有关物质、含醇量
散剂性状、含量、粒度、外观均匀度、有关物质
计量吸入气雾剂容器严密性、含量、有关物质、每揿动一次的释放剂量、有效部位药物沉积量
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膜剂性状、含量、溶化时限、有关物质、眼用膜剂应作无菌检查
颗粒剂性状、含量、粒度、溶化性
透皮帖片性状、含量、有关物质、释放度
搽剂性状、含量、有关物质
注：有关物质(含其他变化所生成的产物)应说明其生成产物的数目及量的变化，如有可能说明，应说明有关物质中哪个为原料中间体，哪个为降解产物，稳定性试验中重点考察降解产物。
五、有效期统计分析
在确定有效期的统计分析过程中，一般选择可以定量的指标进行处理，通常根据药物含量变化计算，按照长期试验测定数值，以标示量％对时间进行直线回归，获得回归方程，求出各时间点标示量的计算值(y'),然后计算标示量(y')95％单侧可信限的置信区间为y'±z，其中：
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(12-21)
式中，tN-2-概率0.05，自由度N-2的t单侧分布值(见表12-4)，N为数组；X0-给定自变量； -自变量X的平均值；
(12-22)
式中， ；Lyy-y的离差平方和， ；Lxy-xy的离差乘积之和 ；b-直线斜率。
将有关点连接可得出分布于回归线两侧的曲线。取质量标准中规定的含量低限(根据各品种实际规定限度确定)与置信区间下界线相交点对应的时间，即为药物的有效期。根据情况也可拟合为二次或三次方程或对数函数方程。
此种方式确定的药物有效期，在药物标签及说明书中均指明什么温度下保存，不得使用"室温"之类的名词。
例：某药物在温度25±2℃，相对温度60±10%的条件下进行长期实验，得各时间的标示量如表12-4。
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表12-4 供试品各时间的标示量
时间/月03691218
标示量/%99.397.697.398.496.094.0
以时间为自变量(x)，标示量%(y)为因变量进行回归，得回归方程
y= 99.18－0.26x，r=0.8970，查T单侧分布表，当自由度为4，P=0.05得
tN-2=2.132
当X0=0时，(即0月)
= 2.132×0.9297×
= 1.356
, 百拇医药 按回归方程计算0月时的y'值得99.18%，则y'值置信区间y'±z，即：
99.18 + 1.356=100.54
99.18－1.356=97.82
其他各时间(3、6、9、12、18月)的y'及置信区间按同法计算，结果见表12-5。
表12-5 稳定性数据表
时间
/月实测标示量(y)/%
计算标示量(y')/%
下界值
y'－z上界值
, 百拇医药
y'+z
099.399.1897.82100.54
397.698.4097.3499.45
697.397.6296.7798.47
998.496.8496.0297.66
1296.096.0695.0897.04
1894.094.5092.9296.09
2492.9490.6195.27
3091.3888.2794.49
3689.8285.9193.72
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用时间与y、y'、y'－z、y'＋z作图，得图12-6，从标示量90%处划一条直线与置信区间下界线相交，自交点作垂线于时间轴相交处，即为有效期，本例有效期为25.5个月。
图12-6 药品产品有效期估算图
六、经典恒温法
前述实验方法主要用于新药申请，但在实际研究工作中，也可考虑采用经典恒温法，特别对水溶液的药物制剂，预测结果有一定的参考价值。
经典恒温法的理论依据是前述Arrhenius的指数定律K=Ae-E/RT，其对数形式为
(12-23)
以logK对1/T作图得一直线，此图称Arrhenius图，直线斜率为-E/(2.303R)，由此可计算出活化能E。若将直线外推至室温，就可求出室温时的速度常数(K25)。由K25可求出分解10%所需的时间(即T0.9)或室温贮藏若干时间以后残余的药物的浓度。
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实验设计时，除了首先确定含量测定方法外，还要进行预试，以便对该药的稳定性有一个基本的了解，然后设计实验温度与取样时间。计划好后，将样品放入各种不同温度的恒温水浴中，定时取样测定其浓度(或含量)，求出各温度下不同时间药物的浓度变化。以药物浓度或浓度的其他函数对时间作图，以判断反应级数。若以logc对T作图得一直线，则为一级反应。再由直线斜率求出各温度的速度常数，然后按前述方法求出活化能和T0.9。
要想得到预期的结果，除了精心设计实验外，很重要的问题是对实验数据进行正确的处理。化学动力学参数(如反应级数、K、E、T1/2)的计算，有图解法和统计学方法，后一种方法比较准确、合理，故近来在稳定性的研究中广泛应用。下面介绍线性回归法。例如某药物制剂，在40℃、50℃、60℃、70℃四个温度下进行加速实验，测得各个时间的浓度，确定为一级反应，用线性回归法求出各温度的速度常数，结果见表12-6。
表12-6 动力学数据表
, 百拇医药
T/℃1/T×103K×105/h-1lgK
403.1922.66－4.575
503.0947.94－4.100
603.00122.38－3.650
702.91356.50－3.248
将上述数据(logK对1/T)进行一元线性回归，得回归方程：
logK=－47.65.98/T+10.64
E=－(－4765.98)×2.303×8.319
=91309.77(J/mol)=91.31(kJ/mol)
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除经典恒温法外，还有线性变温法，Q10法，活化能估算法等，在研究工作中，有时可以应用。
七、固体制剂稳定性实验的特殊要求和特殊方法
(一)固体剂型稳定性实验的特殊要求
前节所述加速实验方法，一般适用于固体制剂，但根据固体药物稳定性的特点，还要有一些特殊要求，须引起实验者的注意：①如水分对固体药物稳定性影响较大，则每个样品必须测定水分，加速实验过程中也要测定；②样品必须密封容器，但为了考察材料的影响，可以用开口容器与密封容器同时进行，以便比较；③测定含量和水分的样品，都要分别单次包装；④固体剂型要使样品含量尽量均匀，以避免测定结果的分散性；⑤药物颗粒的大小对结果也有影响，故样品要用一定规格的筛号过筛，并测定其粒度，固体的表面是微粉的重要性质，必要时可用BET方法测定；⑥实验温度不宜过高，以60℃以下为宜。
此外还需注意赋形剂对药物稳定性的影响。研究这种影响，通常可用下述方法设计实验：药物与赋形剂以1：5配料，药物与润滑剂按20：1配料。常用赋形剂和润滑剂有淀粉、糊精、蔗糖、磷酸氢钙、硫酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸等。配好料后，其中一半用小瓶密封，另一半吸入或加入5%水后，也用小瓶密封。然后在5、25、50、60℃温度和4500lx光照下进行加速实验，定期取样测含量或薄层分析，并观察外观、色泽等变化，以判断赋形剂是否影响药物的稳定性。
药物与赋形剂有无相互作用，比较适用的实验方法有热分析法、漫反射光谱法和薄层层析法。
(二)热分析法在研究固体药物稳定性中的应用
热分析法以差示热分析法(differential thermal analysis, DTA)和差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)为常用。
此外还可用漫反射光谱法测定药物的颜色变化及药物与辅料的相互作用。固体药物制剂稳定性，目前积累资料还不多，有待进一步研究发展。前面只是介绍一些基本内容，读者如欲进一步了解，可以参阅有关文献。, 百拇医药