HCV的新型体外细胞模型：复制子系统
Novel in vitro cell culture models for HCV: Replicon systems
ZHANG Fan, WANG XiaoHong
Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
【Abstract】 In 1989, the hepatitis C virus (HCV) was molecularly cloned. Since then, our understanding of the viral genome and epidemiology of hepatitis C has been considerably improved. However, the study on the HCV has been hampered due to the lack of appropriate cell culture models that allow the propagation of the virus. In 1999, selectable dicistronic subgenomic HCV RNA replicon was first described by Lohmann and his colleagues in Science, which is considered to be a milestone of the study on HCV in vitro cell models. The replicon is capable of selfamplifying to high levels in a human hepatoma cell line Huh7. It has been shown that the replicon has no significant impairment on the growth and metabolism of host cells. Most notably, cell culture adaptive mutations have been identified in various nonstructural proteins that enhance RNA replication by several orders of magnitude and the permissiveness of the host cell has been determined as an additional important factor contributing to efficient RNA replication. These discoveries make it possible for the development of selectable full length genome replicon. The replicon systems are useful tools for the study on HCV pathogenesis, the screening of antiviral drugs and the development of vaccines.
【Keywords】 hepatitis C virus；replicons；cell
【摘要】 自1989年丙型肝炎病毒(HCV)被分子克隆后，其流行病学、基因组学的相关研究取得了一定的进展，然而由于缺乏有效的体外细胞复制模型，HCV的研究长期以来受到阻碍. 1999年Lohmann等在Science上首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统，其被公认为是HCV RNA体外复制模型研究获得突破进展的里程碑. 复制子在人肝癌细胞株Huh7细胞株中能高水平的自主复制. 研究发现复制子在细胞中复制对宿主细胞生长和代谢无明显影响，高水平复制与病毒基因组的适应性突变和宿主细胞的容受性有关. 这些研究结果为选择性HCV全序列基因组复制子的研究奠定了基础. 复制子系统的建立对HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究具有重要的意义.
【关键词】 丙型肝炎病毒；复制子；细胞
0引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是丙型肝炎的致病体，丙型肝炎是世界范围内的重要传染病之一. 据估计，目前全世界约有 1亿7千万HCV感染者，其中85%发展成慢性丙型肝炎，在10~20 a中又有20%~50%进展成肝硬化，1%~2%发展成肝细胞肝癌，所以丙型肝炎为一全球性严重危害人民健康的疾病. 目前对HCV的预防和治疗十分有限，迄今还没有疫苗问世. HCV感染者最有效的治疗方法为聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，持续病毒学应答率可达54%~56%，但该疗法对基因型有很强的依赖性，即不同的基因型对治疗反应差异很大. 此外，其治疗费用颇高，且具有显著的副作用. 因此，迫切需要更加有效的治疗方法. 长期以来，由于缺乏合适的体外病毒复制的细胞模型，开发新型的抗HCV药物进展缓慢. 直到1999年，Lohmann建立了在肝癌细胞中可以高水平自主复制的亚基因组复制模型(复制子)，为HCV致病机制研究及抗病毒药物评价提供了一个新的途径. 本文综述了HCV复制子系统的建立及其基础研究进展和应用.
1HCV的基因组构成及其编码
蛋白的功能HCV是黄病毒家族成员之一，基因组为单链正义RNA，长约9.6 kb. HCV基因组的构成如图1所示：5′非编码区 (5′non coding region, 5′NCR)，含有内核糖体进入位点 (internal ribosome entry site, IRES), 在HCV 翻译过程中起重要作用. 病毒多聚蛋白的氨基端含有病毒结构蛋白即核心蛋白(C), 两个包膜蛋白(E1, E2)，疏水多肽P7被认为是一个离子通道，金刚烷胺是这一通道的抑制剂[1]，故推测P7控制着内质网向胞质的钠离子流，但其确切功能还需进一步研究. 非结构蛋白包括NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B，NS2/NS3编码一金属蛋白酶，裂解NS2与NS3连接位点，NS3 编码丝氨酸蛋白酶和病毒解链酶(helicase), NS4A 为丝氨酸蛋白酶的辅助因子，NS4B是一种高度疏水的蛋白质，可以吸引远处的膜囊泡[2,3]，聚集在胞质中表达完全的多肽；另有报道，NS4B形成一种叫“膜网(membranous web)”的结构，是HCV RNA复制的场所[4]. NS5A为一磷酸蛋白，含有已知的干扰素敏感性决定区域(IFN sensitivitydetermining region, ISDR)，NS5B编码病毒RNA聚合酶，3′非编码区(3′non coding region, 3′NCR)由三个部分构成，即可变区、多聚嘧啶区及高度保守的98个核苷酸末端，实验显示除了可变区，大部分3′NCR序列是HCV RNA复制不可缺少的重要成分. 目前世界各地分离的HCV RNA，以C和NS3~5区最保守，E基因核苷酸同源性较低，尤其是E2区变异性最大，含有两个高度可变区(HVR1,HVR2).
图1HCV基因组结构图 略
2HCV复制子
系统Lohmann等[5]于1999年在Science上首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统，其来源于共有序列Conl(HCV 1b)序列. 该复制子将编码结构蛋白的基因删除，用两个异源性成分取而代之. 其一为选择性标志物―新霉素磷酸转移酶(neo)基因，其二为心肌脑炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)的IRES，由此获得了所谓的选择性双顺反子HCV复制子：上游顺反子在天然HCV IRES(1~377nt或者1~389nt)控制下表达选择性抗生素标志物(neo)，以便获得含有大量HCV RNA和病毒蛋白的稳定细胞克隆，下游顺反子在心肌脑炎病毒IRES控制下编码非结构蛋白(NS35B). 构建的复制子转染人肝癌细胞系Huh7细胞，进行G418筛选，获得携带有高水平复制RNA与病毒蛋白的Huh7细胞克隆，与当时所有的体外感染细胞模型比较，该克隆细胞的HCV RNA复制水平大约高5个数量级，利用链特异性Northern blots检测，其单个细胞平均含大约1000~5000个正链RNA分子，而负链RNA含量较之低5~10倍左右，这与负链RNA是复制中间体的设想相一致. 实验表明选择性HCV RNA复制子能在人肝癌细胞系中高水平的自主复制. 同时，显示HCV与大多数RNA病毒一样，结构蛋白及NS2蛋白并非HCV RNA复制所必需的成分.
3复制子的宿主细胞特性
随着支持高水平HCV RNA复制的细胞克隆获得，有学者进行了HCV RNA复制对宿主细胞生长和代谢的影响研究[6]. 尽管HCV RNA高水平复制，研究显示未见有细胞致病性的明显征象，如生长率降低或形态学改变，这与大多数研究结果相一致，进一步表明肝损伤是由免疫反应所致，而不是病毒引起的细胞直接损害[7]. 然而，也有证据认为，HCV的直接致细胞病变作用也参与了肝细胞的损害[8].
当细胞在连续G418选择下传代时，复制子可在细胞中稳定维持多年；但如缺乏选择性压力，复制子的RNA水平将会逐渐下降，下降速度依赖于细胞的培养条件[6]. 此外，细胞在高融合状态下传代时，与对数生长期传代比较，HCV RNA复制水平下降较快，表明HCV复制与翻译依赖于宿主细胞的增殖，也就是说在宿主细胞增殖过程中，在丰度与活性方面发生改变的特定宿主细胞因素或特定的宿主细胞条件可能与此有关. 这有待进一步研究确证.
近来，在复制子细胞中发现一种细胞内的胞质结构，称“membranous web”[9]，此结构最早发现于能够诱导表达完整多聚蛋白或仅表达NS4B的人骨肉瘤细胞系中[2]. 有趣的是，感染其他正链RNA病毒(如脊髓灰质炎病毒和黄病毒属的Kunjin病毒)的细胞，也发现相似的膜结构，表明该结构可能是一种病毒复制复合体[10-12]. 由此推测，NS4B最可能的作用是诱导胞质泡的形成，建立HCV复制的场所，已有证据支持该观点，即发现所有的病毒蛋白与新生的HCV RNA位于膜网处.
4细胞培养的适应性
突变复制子系统能够高效复制，有两个主要的原因：细胞培养的适应性突变和宿主细胞的容受性水平. 细胞培养的适应性突变，趋向于集结成簇. Lohmann等[13]对26个独立的复制子细胞克隆进行了序列分析，发现绝大多数保留性突变聚集于NS5A区，试验表明NS5A适应性变异加强HCV复制子的复制能力，NS5A变异发生于6861~6951位核苷酸(nucleotide，nt) (2177~2204位氨基酸，编号基于Con1序列)之间，S2197F，S2204I，S2202L是三个独特的NS5A变异位点，其子代复制子转染Huh7细胞，产生的集落形成效率明显高于亲代复制子，提示这些变异是适应性变异，通过位点指导的诱变方法(sitedirected mutagenesis)将S2204I变异引入亲代复制子产生的子代复制子Rep1bNeo2204显示，其集落形成明显增多(>800个)，同时发现本身对集落形成效率无明显影响的NS3区D1431Y变异引入Rep1bNeo2204获得的复制子Rep1bNeo1431/2204的集落形成效率进一步得到提高(>80 000集落). 表明NS3变异与NS5A变异有高度协同增效作用. Ikeda等也证实了HCVN NS5A的氨基酸插入与Con1 NS5A突变引起高水平复制的机制相似. 第二个聚集区为NS3丝氨酸蛋白酶的羧基端和NS3解链酶的氨基端，三维结构显示几乎所有的突变位点均存在于HCV RNA分子与溶剂相接触的一面. 第三个聚集区在NS4B的两个位点：K1846T和V1897L/M/A.
来源于HCV 1a H77[14]的复制子的NS3解链酶的P1496L的突变协同NS5A的S2204I，增加了RNA的复制能力. 最新报道的来源于HCV 2a的复制子JFH1[15]，无论是否产生适应性突变，都有着比Con1来源的复制子高20倍的复制能力，未修饰的复制子转染细胞的大量G418抗性克隆的产生说明此复制子不需适应性突变仍具有高水平复制能力，但是其中一些突变对于更高的复制能力似乎有重大意义.
由于一种瞬时RNA复制系统(transient RNA replication assays)的建立，使得复制子突变现象的研究简单易行，避免了繁琐的操作及费时的克隆筛选，由此短短的几年来，已获得以下结论：NS4B1846位点的突变对RNA复制能力影响最大；NS3的突变对RNA的复制影响较小；NS3的突变，尤其是E1202G，联合NS4B, NS5A或者NS5B的单一位点突变，有协同作用，可以增加RNA的复制；NS4B, NS5A和NA5B的某些突变及其相互联合，可以导致RNA复制的降低或者完全阻断复制.
为了研究细胞培养的适应性突变对于体内感染的影响，将没有适应性突变的亲代HCV复制子进行黑猩猩的肝内接种，其复制能力相差很大：Con1接种1 wk后，黑猩猩发生病毒血症，体内病毒载量持续在1×108 copies/L血清. 相反，NS3和NS5A发生适应性突变的类似复制子接种黑猩猩后，没有发生病毒血症. 有趣的是，仅NA5A发生适应性突变的复制子Con1/2197接种后，黑猩猩被感染，但是病毒血症比Con1延迟了1 wk. 这样看来，细胞培养的适应性突变导致了在体的减毒作用，至少在Con1来源的复制子如此. HCVN来源的复制子的在体感染水平低下，这归因于NS5A中4个氨基酸的插入，不过可以用来构建不需适应性突变就能在Huh7中高水平复制的复制子. 相反，H77来源的复制子具有高水平在体感染能力，即使引入单一NS5A突变或者合并NS3突变.
5宿主细胞的容受性
除细胞培养的适应性突变，HCV RNA高水平复制的另一决定因素就是宿主细胞自身[13,16,17]. 利用瞬时RNA复制系统，发现在同一株Huh7细胞的不同传代细胞中，RNA复制水平相差达100倍. 这种差异与复制子适应性突变的种类无关，并且存在于亲代HCV Con1 RNA中，然而，细胞容受性的水平难以控制且易于变化而不能预测. 实验显示IRES依赖性HCV RNA翻译方面的变化与RNA稳定性方面的差异，对细胞容受性的影响可以排除. 因此，推测细胞容受性水平是由RNA复制必需的一定的宿主细胞因子的数量或活性决定的. 有一项证据为：随着转染Huh7细胞的复制子的数量的增加，复制效率反而降低，表明Huh7的宿主细胞因子限制了RNA的扩增[13].
研究表明，有效的HCV RNA复制只存在于某一Huh7细胞亚群[16,17]. 无突变的复制子转染细胞，得到的G418抗性细胞克隆数量有限，其原因不仅仅是由于产生的适应性突变的频率的影响，还因为宿主细胞的容受性. G418筛选后的细胞克隆会含有适应性突变的复制子或(和)为筛选出来的具有较好细胞容受性的细胞亚群. 这一假设已经实验证实，具有稳定复制HCV RNA能力的Huh7细胞克隆经干扰素或者一种能有效阻断复制子RNA扩增的选择性抑制剂处理，2 wk后大部分HCV RNA被清除，剩下一群所谓的“治愈细胞”(cured cells)，如再将复制子转染这些细胞，得到的G418抗性克隆数量比转染天然的Huh7细胞要显著增多[16,17]，提示“治愈细胞”似乎比天然细胞更加具有容受性，也就是说“治愈细胞”是筛选出来的具有良好容受性的细胞亚群. 然而，由于容受性不是一种稳定的表型，而且天然细胞也具有可变性，“治愈细胞”与天然细胞在容受性方面的差异很难确定，如实验显示“治愈细胞”较第8代或37代天然细胞容受性好，但较第128代或142代天然细胞容受性差.
6全基因组复制子
虽然亚基因组复制子是一项有用的工具，但最终目的是建立一个可以产生感染性HCV病毒颗粒的细胞培养系统. Pietschmann等[18]、Ikeda等[19]和Blight等[14]都先后报道了全基因组复制子系统，这些全基因组复制子与亚基因组复制子的差别在于用HCV的全长基因组替换了亚基因组复制子的NS35B.
为了增加复制子的复制能力，将适应性突变引入全基因组复制子，但是经转染Huh7细胞和G418筛选，得到的细胞克隆很少. 然而，在某一个克隆中，其复制能力仅较亚基因组复制子低5倍. 低数量的克隆和高水平的复制表明全基因组复制子发生了突变，但是转染Huh7细胞的序列分析并没有发现“保守性突变”[18]. 这些细胞用干扰素处理后，也未见容受性显著的升高. 由此可见，全基因组复制子G418克隆产生数量低的原因仍然不明确. 由于高水平复制的全基因组复制子的获得，多家实验室对病毒颗粒的产生进行了研究，结果表明，病毒产生的缺乏并非由于工程改造的携带外源基因成分(neo及EMCV IRES)的HCV基因所致，而可能是缺乏某些病毒形成或释放所必需的宿主细胞因子.
7复制子的应用
复制子系统已经成为研究HCV RNA复制、致病性和病毒持续性的最重要的工具之一. 例如，已经利用复制子成功的证明RNA复制必需的5′NCR的最小区域，即前125个核苷酸[20,21]；同时也证明3′NCR最后98个核苷酸(即X尾)是RNA复制所必需的[22-24]，删除3′NCR的可变区或缩短poly(U/UC)区，对HCV RNA复制能力影响很小. 这些结果与用黑猩猩模型得出的结果一致. 复制子系统目前已用于以下研究领域： RNA翻译与复制必需的宿主细胞因子的确定；翻译与复制，及复制与翻译调节开关机制研究；复制复合体形成机制及其结构与功能分析；作为病毒复制场所的“膜网”的形成机制研究； NS4B与NS5A对RNA复制的作用的明确；除了5′NCR与3′NCR外的其他顺式作用序列的明确等.
最后，值得重视的是复制子系统作为抗病毒药物评价模型具有十分重要的价值. 研究表明，复制子系统可能有助于阐明基因1型分离株对α干扰素抗性的作用机制，鉴于45%基因1型病毒对α干扰素治疗有效，因此可构建源于临床上对α干扰素治疗敏感与不敏感的病毒分离株的复制子系统进行比较动力学与定量研究.
8展望
自1999年第一个HCV复制子构建成功至今，已经有数家实验室报道成功构建高水平复制能力的复制子. 目前，能在Huh7细胞中高水平复制的复制子来源于1a[14]、1b[5,25,26]和2a[15]. 尽管复制子系统的应用大大促进了HCV的研究，该系统仍有一些缺陷，由于HCV RNA复制与宿主细胞增殖密切关联[6]，所以抑制宿主细胞生长的物质也能够减少复制子RNA水平，因此必需将影响细胞增殖和细胞毒性的物质排除在外. 值得注意的是发现当转染的RNA量增加时，复制能力反而下降[13]，这是否提示病毒RNA或者蛋白就是Huh7细胞的细胞毒性物质呢还有待进一步研究. 目前还不能完全排除结构蛋白对药物的抗病毒活性和抗性的影响，因此在进行药物观察时，有必要将亚基因组复制子与全长HCV RNA进行对照药物研究. 细胞培养的适应性突变可能影响一个蛋白的生物化学特性而改变其对抗病毒药物的敏感性. 目前公认的只有Huh7细胞能支持其高水平复制，但最近Zhu等[27]报道在HeLa和小鼠肝癌Hepa16细胞中复制子也可以有效复制，其他细胞系如HepG2和PH5CH的研究均未成功. 发现其他能够支持HCV复制子的细胞系，对拓宽复制子的应用领域将具有重要意义. 目前复制子模型仅限于4个HCV 1b株、1个HCV 1a株和1个HCV 2a株. 虽然亚基因组复制子是目前研究HCV的有效工具，但尚不能依次建立能产生HCV完整病毒颗粒的细胞培养系统.
综上所述，HCV新型体外细胞模型复制子系统的构建是HCV研究史上的一个里程碑，为HCV的发病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究提供了良好的实验模型. 但是目前此系统还存在很多缺陷，为此我们还要进行大量工作，如高水平复制的全基因组复制子的构建，容受性较好的其他细胞株的筛选，不同基因型的复制子模型的建立等.
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基金项目：国家自然科学基金(30371663)
第三军医大学西南医院全军感染病研究所，重庆 400038
编辑王睿, 百拇医药(张帆 王小红)
ZHANG Fan, WANG XiaoHong
Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
【Abstract】 In 1989, the hepatitis C virus (HCV) was molecularly cloned. Since then, our understanding of the viral genome and epidemiology of hepatitis C has been considerably improved. However, the study on the HCV has been hampered due to the lack of appropriate cell culture models that allow the propagation of the virus. In 1999, selectable dicistronic subgenomic HCV RNA replicon was first described by Lohmann and his colleagues in Science, which is considered to be a milestone of the study on HCV in vitro cell models. The replicon is capable of selfamplifying to high levels in a human hepatoma cell line Huh7. It has been shown that the replicon has no significant impairment on the growth and metabolism of host cells. Most notably, cell culture adaptive mutations have been identified in various nonstructural proteins that enhance RNA replication by several orders of magnitude and the permissiveness of the host cell has been determined as an additional important factor contributing to efficient RNA replication. These discoveries make it possible for the development of selectable full length genome replicon. The replicon systems are useful tools for the study on HCV pathogenesis, the screening of antiviral drugs and the development of vaccines.
【Keywords】 hepatitis C virus；replicons；cell
【摘要】 自1989年丙型肝炎病毒(HCV)被分子克隆后，其流行病学、基因组学的相关研究取得了一定的进展，然而由于缺乏有效的体外细胞复制模型，HCV的研究长期以来受到阻碍. 1999年Lohmann等在Science上首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统，其被公认为是HCV RNA体外复制模型研究获得突破进展的里程碑. 复制子在人肝癌细胞株Huh7细胞株中能高水平的自主复制. 研究发现复制子在细胞中复制对宿主细胞生长和代谢无明显影响，高水平复制与病毒基因组的适应性突变和宿主细胞的容受性有关. 这些研究结果为选择性HCV全序列基因组复制子的研究奠定了基础. 复制子系统的建立对HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究具有重要的意义.
【关键词】 丙型肝炎病毒；复制子；细胞
0引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是丙型肝炎的致病体，丙型肝炎是世界范围内的重要传染病之一. 据估计，目前全世界约有 1亿7千万HCV感染者，其中85%发展成慢性丙型肝炎，在10~20 a中又有20%~50%进展成肝硬化，1%~2%发展成肝细胞肝癌，所以丙型肝炎为一全球性严重危害人民健康的疾病. 目前对HCV的预防和治疗十分有限，迄今还没有疫苗问世. HCV感染者最有效的治疗方法为聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，持续病毒学应答率可达54%~56%，但该疗法对基因型有很强的依赖性，即不同的基因型对治疗反应差异很大. 此外，其治疗费用颇高，且具有显著的副作用. 因此，迫切需要更加有效的治疗方法. 长期以来，由于缺乏合适的体外病毒复制的细胞模型，开发新型的抗HCV药物进展缓慢. 直到1999年，Lohmann建立了在肝癌细胞中可以高水平自主复制的亚基因组复制模型(复制子)，为HCV致病机制研究及抗病毒药物评价提供了一个新的途径. 本文综述了HCV复制子系统的建立及其基础研究进展和应用.
1HCV的基因组构成及其编码
蛋白的功能HCV是黄病毒家族成员之一，基因组为单链正义RNA，长约9.6 kb. HCV基因组的构成如图1所示：5′非编码区 (5′non coding region, 5′NCR)，含有内核糖体进入位点 (internal ribosome entry site, IRES), 在HCV 翻译过程中起重要作用. 病毒多聚蛋白的氨基端含有病毒结构蛋白即核心蛋白(C), 两个包膜蛋白(E1, E2)，疏水多肽P7被认为是一个离子通道，金刚烷胺是这一通道的抑制剂[1]，故推测P7控制着内质网向胞质的钠离子流，但其确切功能还需进一步研究. 非结构蛋白包括NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B，NS2/NS3编码一金属蛋白酶，裂解NS2与NS3连接位点，NS3 编码丝氨酸蛋白酶和病毒解链酶(helicase), NS4A 为丝氨酸蛋白酶的辅助因子，NS4B是一种高度疏水的蛋白质，可以吸引远处的膜囊泡[2,3]，聚集在胞质中表达完全的多肽；另有报道，NS4B形成一种叫“膜网(membranous web)”的结构，是HCV RNA复制的场所[4]. NS5A为一磷酸蛋白，含有已知的干扰素敏感性决定区域(IFN sensitivitydetermining region, ISDR)，NS5B编码病毒RNA聚合酶，3′非编码区(3′non coding region, 3′NCR)由三个部分构成，即可变区、多聚嘧啶区及高度保守的98个核苷酸末端，实验显示除了可变区，大部分3′NCR序列是HCV RNA复制不可缺少的重要成分. 目前世界各地分离的HCV RNA，以C和NS3~5区最保守，E基因核苷酸同源性较低，尤其是E2区变异性最大，含有两个高度可变区(HVR1,HVR2).
图1HCV基因组结构图 略
2HCV复制子
系统Lohmann等[5]于1999年在Science上首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCV RNA复制子系统，其来源于共有序列Conl(HCV 1b)序列. 该复制子将编码结构蛋白的基因删除，用两个异源性成分取而代之. 其一为选择性标志物―新霉素磷酸转移酶(neo)基因，其二为心肌脑炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)的IRES，由此获得了所谓的选择性双顺反子HCV复制子：上游顺反子在天然HCV IRES(1~377nt或者1~389nt)控制下表达选择性抗生素标志物(neo)，以便获得含有大量HCV RNA和病毒蛋白的稳定细胞克隆，下游顺反子在心肌脑炎病毒IRES控制下编码非结构蛋白(NS35B). 构建的复制子转染人肝癌细胞系Huh7细胞，进行G418筛选，获得携带有高水平复制RNA与病毒蛋白的Huh7细胞克隆，与当时所有的体外感染细胞模型比较，该克隆细胞的HCV RNA复制水平大约高5个数量级，利用链特异性Northern blots检测，其单个细胞平均含大约1000~5000个正链RNA分子，而负链RNA含量较之低5~10倍左右，这与负链RNA是复制中间体的设想相一致. 实验表明选择性HCV RNA复制子能在人肝癌细胞系中高水平的自主复制. 同时，显示HCV与大多数RNA病毒一样，结构蛋白及NS2蛋白并非HCV RNA复制所必需的成分.
3复制子的宿主细胞特性
随着支持高水平HCV RNA复制的细胞克隆获得，有学者进行了HCV RNA复制对宿主细胞生长和代谢的影响研究[6]. 尽管HCV RNA高水平复制，研究显示未见有细胞致病性的明显征象，如生长率降低或形态学改变，这与大多数研究结果相一致，进一步表明肝损伤是由免疫反应所致，而不是病毒引起的细胞直接损害[7]. 然而，也有证据认为，HCV的直接致细胞病变作用也参与了肝细胞的损害[8].
当细胞在连续G418选择下传代时，复制子可在细胞中稳定维持多年；但如缺乏选择性压力，复制子的RNA水平将会逐渐下降，下降速度依赖于细胞的培养条件[6]. 此外，细胞在高融合状态下传代时，与对数生长期传代比较，HCV RNA复制水平下降较快，表明HCV复制与翻译依赖于宿主细胞的增殖，也就是说在宿主细胞增殖过程中，在丰度与活性方面发生改变的特定宿主细胞因素或特定的宿主细胞条件可能与此有关. 这有待进一步研究确证.
近来，在复制子细胞中发现一种细胞内的胞质结构，称“membranous web”[9]，此结构最早发现于能够诱导表达完整多聚蛋白或仅表达NS4B的人骨肉瘤细胞系中[2]. 有趣的是，感染其他正链RNA病毒(如脊髓灰质炎病毒和黄病毒属的Kunjin病毒)的细胞，也发现相似的膜结构，表明该结构可能是一种病毒复制复合体[10-12]. 由此推测，NS4B最可能的作用是诱导胞质泡的形成，建立HCV复制的场所，已有证据支持该观点，即发现所有的病毒蛋白与新生的HCV RNA位于膜网处.
4细胞培养的适应性
突变复制子系统能够高效复制，有两个主要的原因：细胞培养的适应性突变和宿主细胞的容受性水平. 细胞培养的适应性突变，趋向于集结成簇. Lohmann等[13]对26个独立的复制子细胞克隆进行了序列分析，发现绝大多数保留性突变聚集于NS5A区，试验表明NS5A适应性变异加强HCV复制子的复制能力，NS5A变异发生于6861~6951位核苷酸(nucleotide，nt) (2177~2204位氨基酸，编号基于Con1序列)之间，S2197F，S2204I，S2202L是三个独特的NS5A变异位点，其子代复制子转染Huh7细胞，产生的集落形成效率明显高于亲代复制子，提示这些变异是适应性变异，通过位点指导的诱变方法(sitedirected mutagenesis)将S2204I变异引入亲代复制子产生的子代复制子Rep1bNeo2204显示，其集落形成明显增多(>800个)，同时发现本身对集落形成效率无明显影响的NS3区D1431Y变异引入Rep1bNeo2204获得的复制子Rep1bNeo1431/2204的集落形成效率进一步得到提高(>80 000集落). 表明NS3变异与NS5A变异有高度协同增效作用. Ikeda等也证实了HCVN NS5A的氨基酸插入与Con1 NS5A突变引起高水平复制的机制相似. 第二个聚集区为NS3丝氨酸蛋白酶的羧基端和NS3解链酶的氨基端，三维结构显示几乎所有的突变位点均存在于HCV RNA分子与溶剂相接触的一面. 第三个聚集区在NS4B的两个位点：K1846T和V1897L/M/A.
来源于HCV 1a H77[14]的复制子的NS3解链酶的P1496L的突变协同NS5A的S2204I，增加了RNA的复制能力. 最新报道的来源于HCV 2a的复制子JFH1[15]，无论是否产生适应性突变，都有着比Con1来源的复制子高20倍的复制能力，未修饰的复制子转染细胞的大量G418抗性克隆的产生说明此复制子不需适应性突变仍具有高水平复制能力，但是其中一些突变对于更高的复制能力似乎有重大意义.
由于一种瞬时RNA复制系统(transient RNA replication assays)的建立，使得复制子突变现象的研究简单易行，避免了繁琐的操作及费时的克隆筛选，由此短短的几年来，已获得以下结论：NS4B1846位点的突变对RNA复制能力影响最大；NS3的突变对RNA的复制影响较小；NS3的突变，尤其是E1202G，联合NS4B, NS5A或者NS5B的单一位点突变，有协同作用，可以增加RNA的复制；NS4B, NS5A和NA5B的某些突变及其相互联合，可以导致RNA复制的降低或者完全阻断复制.
为了研究细胞培养的适应性突变对于体内感染的影响，将没有适应性突变的亲代HCV复制子进行黑猩猩的肝内接种，其复制能力相差很大：Con1接种1 wk后，黑猩猩发生病毒血症，体内病毒载量持续在1×108 copies/L血清. 相反，NS3和NS5A发生适应性突变的类似复制子接种黑猩猩后，没有发生病毒血症. 有趣的是，仅NA5A发生适应性突变的复制子Con1/2197接种后，黑猩猩被感染，但是病毒血症比Con1延迟了1 wk. 这样看来，细胞培养的适应性突变导致了在体的减毒作用，至少在Con1来源的复制子如此. HCVN来源的复制子的在体感染水平低下，这归因于NS5A中4个氨基酸的插入，不过可以用来构建不需适应性突变就能在Huh7中高水平复制的复制子. 相反，H77来源的复制子具有高水平在体感染能力，即使引入单一NS5A突变或者合并NS3突变.
5宿主细胞的容受性
除细胞培养的适应性突变，HCV RNA高水平复制的另一决定因素就是宿主细胞自身[13,16,17]. 利用瞬时RNA复制系统，发现在同一株Huh7细胞的不同传代细胞中，RNA复制水平相差达100倍. 这种差异与复制子适应性突变的种类无关，并且存在于亲代HCV Con1 RNA中，然而，细胞容受性的水平难以控制且易于变化而不能预测. 实验显示IRES依赖性HCV RNA翻译方面的变化与RNA稳定性方面的差异，对细胞容受性的影响可以排除. 因此，推测细胞容受性水平是由RNA复制必需的一定的宿主细胞因子的数量或活性决定的. 有一项证据为：随着转染Huh7细胞的复制子的数量的增加，复制效率反而降低，表明Huh7的宿主细胞因子限制了RNA的扩增[13].
研究表明，有效的HCV RNA复制只存在于某一Huh7细胞亚群[16,17]. 无突变的复制子转染细胞，得到的G418抗性细胞克隆数量有限，其原因不仅仅是由于产生的适应性突变的频率的影响，还因为宿主细胞的容受性. G418筛选后的细胞克隆会含有适应性突变的复制子或(和)为筛选出来的具有较好细胞容受性的细胞亚群. 这一假设已经实验证实，具有稳定复制HCV RNA能力的Huh7细胞克隆经干扰素或者一种能有效阻断复制子RNA扩增的选择性抑制剂处理，2 wk后大部分HCV RNA被清除，剩下一群所谓的“治愈细胞”(cured cells)，如再将复制子转染这些细胞，得到的G418抗性克隆数量比转染天然的Huh7细胞要显著增多[16,17]，提示“治愈细胞”似乎比天然细胞更加具有容受性，也就是说“治愈细胞”是筛选出来的具有良好容受性的细胞亚群. 然而，由于容受性不是一种稳定的表型，而且天然细胞也具有可变性，“治愈细胞”与天然细胞在容受性方面的差异很难确定，如实验显示“治愈细胞”较第8代或37代天然细胞容受性好，但较第128代或142代天然细胞容受性差.
6全基因组复制子
虽然亚基因组复制子是一项有用的工具，但最终目的是建立一个可以产生感染性HCV病毒颗粒的细胞培养系统. Pietschmann等[18]、Ikeda等[19]和Blight等[14]都先后报道了全基因组复制子系统，这些全基因组复制子与亚基因组复制子的差别在于用HCV的全长基因组替换了亚基因组复制子的NS35B.
为了增加复制子的复制能力，将适应性突变引入全基因组复制子，但是经转染Huh7细胞和G418筛选，得到的细胞克隆很少. 然而，在某一个克隆中，其复制能力仅较亚基因组复制子低5倍. 低数量的克隆和高水平的复制表明全基因组复制子发生了突变，但是转染Huh7细胞的序列分析并没有发现“保守性突变”[18]. 这些细胞用干扰素处理后，也未见容受性显著的升高. 由此可见，全基因组复制子G418克隆产生数量低的原因仍然不明确. 由于高水平复制的全基因组复制子的获得，多家实验室对病毒颗粒的产生进行了研究，结果表明，病毒产生的缺乏并非由于工程改造的携带外源基因成分(neo及EMCV IRES)的HCV基因所致，而可能是缺乏某些病毒形成或释放所必需的宿主细胞因子.
7复制子的应用
复制子系统已经成为研究HCV RNA复制、致病性和病毒持续性的最重要的工具之一. 例如，已经利用复制子成功的证明RNA复制必需的5′NCR的最小区域，即前125个核苷酸[20,21]；同时也证明3′NCR最后98个核苷酸(即X尾)是RNA复制所必需的[22-24]，删除3′NCR的可变区或缩短poly(U/UC)区，对HCV RNA复制能力影响很小. 这些结果与用黑猩猩模型得出的结果一致. 复制子系统目前已用于以下研究领域： RNA翻译与复制必需的宿主细胞因子的确定；翻译与复制，及复制与翻译调节开关机制研究；复制复合体形成机制及其结构与功能分析；作为病毒复制场所的“膜网”的形成机制研究； NS4B与NS5A对RNA复制的作用的明确；除了5′NCR与3′NCR外的其他顺式作用序列的明确等.
最后，值得重视的是复制子系统作为抗病毒药物评价模型具有十分重要的价值. 研究表明，复制子系统可能有助于阐明基因1型分离株对α干扰素抗性的作用机制，鉴于45%基因1型病毒对α干扰素治疗有效，因此可构建源于临床上对α干扰素治疗敏感与不敏感的病毒分离株的复制子系统进行比较动力学与定量研究.
8展望
自1999年第一个HCV复制子构建成功至今，已经有数家实验室报道成功构建高水平复制能力的复制子. 目前，能在Huh7细胞中高水平复制的复制子来源于1a[14]、1b[5,25,26]和2a[15]. 尽管复制子系统的应用大大促进了HCV的研究，该系统仍有一些缺陷，由于HCV RNA复制与宿主细胞增殖密切关联[6]，所以抑制宿主细胞生长的物质也能够减少复制子RNA水平，因此必需将影响细胞增殖和细胞毒性的物质排除在外. 值得注意的是发现当转染的RNA量增加时，复制能力反而下降[13]，这是否提示病毒RNA或者蛋白就是Huh7细胞的细胞毒性物质呢还有待进一步研究. 目前还不能完全排除结构蛋白对药物的抗病毒活性和抗性的影响，因此在进行药物观察时，有必要将亚基因组复制子与全长HCV RNA进行对照药物研究. 细胞培养的适应性突变可能影响一个蛋白的生物化学特性而改变其对抗病毒药物的敏感性. 目前公认的只有Huh7细胞能支持其高水平复制，但最近Zhu等[27]报道在HeLa和小鼠肝癌Hepa16细胞中复制子也可以有效复制，其他细胞系如HepG2和PH5CH的研究均未成功. 发现其他能够支持HCV复制子的细胞系，对拓宽复制子的应用领域将具有重要意义. 目前复制子模型仅限于4个HCV 1b株、1个HCV 1a株和1个HCV 2a株. 虽然亚基因组复制子是目前研究HCV的有效工具，但尚不能依次建立能产生HCV完整病毒颗粒的细胞培养系统.
综上所述，HCV新型体外细胞模型复制子系统的构建是HCV研究史上的一个里程碑，为HCV的发病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究提供了良好的实验模型. 但是目前此系统还存在很多缺陷，为此我们还要进行大量工作，如高水平复制的全基因组复制子的构建，容受性较好的其他细胞株的筛选，不同基因型的复制子模型的建立等.
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基金项目：国家自然科学基金(30371663)
第三军医大学西南医院全军感染病研究所，重庆 400038
编辑王睿, 百拇医药(张帆 王小红)