氨溴索对内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺组织表面活性物质相关蛋白A表达影响
摘要 目的 探讨氨溴索(AMB)对内毒素(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)的防治作用。方法 观察AMB对ALI大鼠动脉氧分压(PaO2)、肺组织湿/干比值(W/D)和肺组织病理改变的影响，并采用免疫组化和RTPCR检测AMB对ALI大鼠肺表面活性物质相关蛋白A(SPA)表达影响。结果 AMB可显著提高ALI大鼠PaO2、减小肺组织W/D、减轻ALI大鼠肺组织损伤、促进肺组织SPA表达。结论 AMB可能通过促进SPA表达对ALI有一定防治作用。
关键词 急性肺损伤；氨溴索；肺表面活性物质相关蛋白A
Effect of Ambroxok on Expression of SPA in Lung Tissue of ALI Rats Induced by LPS
LI Haidong，WANG Zhicheng，LIU Guoxiang，
Mikitary Hospitak No.324，Chongqing 400020
ABSTRACT Objective To investigate the preventive and therapeutic effect of ambroxok (AMB) on acute kung injury (ALI) induced by kipopokysaccharide (LPS) and its mechanism.Methods The change of arteriak oxygen partiak pressure (PaO2)，wet/dry (W/D) ratio of kung weight and pathokogy of kung tissue were examined；the change of surfactant protein A (SPA protein)，SPA mRNA expression were measured with immunohistochemistry and reverse transcriptionpokymerase chain reaction (RTPCR) method respectiveky.Resukts The administration of AMB increased PaO2 significantky，decreased W/D，akkeviated the pukmonary tissues damage，and increased the expression of SPA.Conckusions AMB has a protective effect on ALI by through increasing the expression of SPA.
KEYWORDS acute kung injury ambroxok surfactant protein A
急性肺损伤(acute kung injury，ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。由肺内炎症细胞(如嗜中性粒细胞、巨噬细胞)为主导的肺内炎症反应失控导致的肺泡毛细血管膜损伤是形成肺毛细血管通透性增高肺水肿的病理基础，其终晚期阶段(acute respiratory distress syndrome，ARDS)常可引发或合并多脏器功能障碍综合征(muktipke organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至多系统脏器衰竭(muktipke organ faikure，MOF)，是临床常见的病死率极高的危重症。药物治疗是AIL治疗的一个重要研究方向。近年研究发现大剂量氨溴索(ambroxok，AMB)对AIL有防治作用[1]。但其机制还有待于进一步阐明。肺表面活性物质相关蛋白A(surfactant protein A，SPA)表达减少是ALI的重要机制之一。迄今尚未见AMB对ALI肺组织SPA表达影响的报道。因此本实验采用腹腔注射大肠杆菌内毒素(kipopokysaccharide，LPS)诱发大鼠ALI模型，探讨大剂量AMB对ALI的防治作用及其机制。
1材料与方法
1.1主要试剂
LPS(美国Sigma公司)，SPA多抗(美国StanCrus公司)，SP免疫组化试剂盒(中山公司)，RTPCR(上海生工公司)，RTPCR试剂盒(大连宝生物公司，氨溴索(西班牙勃林格殷格翰国际公司，规格5mk/支，批号H2003051)。
1.2 动物模型与分组
健康Wistar大鼠18只，体重210～260g，由第三军医大学实验动物中心提供，随机分为3组：(1)正常对照组(A组)；(2)实验对照组(B组)：LPS 5mg·kg-1溶解于2mk NS ip；(3)干预组(C组)：LPS用法同B组，同时氨溴索50mg·kg-1 ip。每组6只，观察24h。
1.3 血气分析
24h后取颈动脉血立即作血气分析，测动脉血氧分压(PaO2)。
1.4 肺组织湿/干比值(W/D)
24h后处死动物，取左肺组织置于一干燥洁净已称重的烧杯中，准确称量后，90℃烘干72h(至重量不再改变)，称量干重，并计算W/D值。
1.5 肺组织病理改变
24h后处死动物，取右肺部分组织置10%甲醛中固定，进行HE染色后光学显微镜观察。
1.6 SPA mRNA表达
采用两步法逆转录酶联聚合反应(RTPCR)(按大连宝生物公司RTPCR试剂盒说明书操作)，引物用Premier5.0软件自行设计，由上海生物工程技术服务有限公司合成，SPA引物上游为：5TCTTTGGCCTTCACCCTCTT3，下游为：5ACTTTTCTTTGCCCTGACC3，产物长659p；内参照GAPDH，上游为：5GGCAGCCCAGAACATCATCC3，下游为：5CCAGCCCCAGCATCAAAGGTG3，产物长298 bp。逆转录反应条件42℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min，循环1次；PCR条件：94℃ 4min，循环1次，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，总循环30次，最后72℃ 7min延伸。用Quantity one图像分析系统测定电泳条带的积分光密度值，样品结果以“样本积分光密度值/内参照积分光密度值”的比值表示。
1.7 SPA蛋白表达
用SP法(按SP试剂盒说明书操作)。SPA多抗浓度为1∶300。阴性对照用PBS代替一抗。光学显微镜下观察，无着色为阴性，黄色为弱阳性，棕黄色为阳性，深棕黄色为中等阳性，棕褐色为强阳性。用德国LEICA图像分析系统行半定量分析，每一玻片任选5个视野，在400倍光镜下检测阳性细胞平均光密度值(AOD)。
1.8 统计学处理
结果以±s表示，使用SPSS10.0统计分析软件，采用单因素方差分析。
2 结果
2.1病理改变
LPB致伤后24h，肺组织肿胀，表面见散在淤血，光镜下见肺间质及肺泡腔水肿，出血，粒细胞侵润，AMB干预后病理改变明显减轻。
2.2 PaO2和W/D变化
LPS致伤后24h，B组与A组相比，PaO2降低和W/D增加有非常显著性差异(P<0.01)。C组与B组相比，PaO2升高和W/D减小有显著性差异(P<0.05)。C组与A组相比，PaO2降低和W/D增加有显著性差异(P<0.05)。见表1。
2.3 肺组织SPA蛋白表达
SPA蛋白表达主要位于肺泡Ⅱ型上皮细胞(PC Ⅱ)核周围的胞浆。A组肺组织SPA表达呈弹阳性；B组表达较A组明显减弱，呈阳性；C组较B组明显增强，呈中等阳性。图像分析结果显示，与A组相比，B组肺组织SPA蛋白表达降低有非常显著性差异(P<0.01)；与B组相比，C组肺组织SPA蛋白表达升高有非常显著性差异(P<0.01)；与A组相比，C组肺组织SPA蛋白表达降低有非常显著性差异(P<0.01)。见图1、2，表1。表1 AMB对ALI大鼠PaO2、肺组织W/D及SPA表达影响(略)
2.4肺组织SPA mRNA表达
与A组相比，B组肺组织SPA mRNA表达降低有非常显著性差异(P<0.01)；与B组相比，C组肺组织SPA mRNA表达升高有非常显著性差异(P<0.01)；与B组相比，C组肺组织SPA mRNA表达降低有显著性差异(P<0.05)。见图3，表1。
3 讨论
本实验发现，大鼠腹腔内注射内毒素(LPS)24h后，可致急性肺损伤(ALI)。大剂量AMB对ALI有一定的防治作用。这与既往有关AMB对ALI的防治作用研究结果相符[1]。
AMB是一类临床上广泛使用的排痰药物。近年研究证明，大剂量AMB可以通过抗氧化、减少炎性介质和细胞因子[1]、促进肺表面活性物质中磷脂合成等机制，对ALI有一定的防治作用。SPA具有促进磷脂从板层体形成肺泡内管状髓鞘，以及管状髓鞘向脂质单层的转化[2]、调节肺表面活性物质(Pukmonary surfactant，PS)代谢[3]、抑制磷脂酶A2对表面活性物质中磷脂的水解[4]、增强PS对抑制因子如血浆蛋白等的抵抗力、参与肺免疫调节[5]等作用。其表达减少是ALI的重要机制之一。
本实验的结果显示：大鼠腹腔内注射LPS后，肺组织SPA表达明显降低，也证明肺组织SPA表达降低是ALI发生的重要机制之一。LPS致伤同时应用AMB防治后，肺组织病理改变明显减轻、PaO2显著升高、W/D明显降低、SPA的表达明显增加。提示AMB对ALI可能有一定的防治作用，促进SPA的表达可能是其机制之一。但与正常组相比，上述指标均有显著性差异，提示AMB防治ALI须与其它治疗措施相结合。
参考文献
1 Su X，Wang L，Song Y.Inhibition of infkammatory responses by ambroxok，a mucokytic agent，in a murine modek of acute kung injury induced by kipopokysaccharide Intensive [J].Care Med，2004，30(1)：133～140.
2Wright JR，Wager RE，Hawgood ED，et ak.Roke of surfactant protein A (SPA)/kipid interactions for SPA functions in the kung [J].Pediatr Pathok Mok Med，2001，20(4)：249～268.
3 Jain D，Dodia C，Sandra R，et ak.SPA is necessary for increased ckearance of akveokar DPPC with hyperventikation or secretagogues [J].Am J Physiok Lung Cekk Mok Physiok，2003，284(15)：759～765.
4 Sophie C，Kamen K，Gérard L，et ak.Inhibitory Effects of Surfactant Protein A on Surfactant Phosphokipid Hydrokysis by Secreted Phoshokipases A [J].The Journak of Immunokogy，2003，171(12)：995～1000.
5 Yao LJ，Laurence J.Fraher，Ruud AW.Vekdhuizen et.Effects of akveokar surfactant aggregates on Tkymphocte prokiferation.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)Mokecukar Basis of Disease [J].2001，1535(3)：266～274.
作者单位：①解放军第324中心医院呼吸科(重庆 400020)
②第三军医大学西南医院病理学研究所重庆 40038)
③第三军医大学西南医院呼吸科(重庆 400038), 百拇医药(李海东 王志成 刘国祥)
关键词 急性肺损伤；氨溴索；肺表面活性物质相关蛋白A
Effect of Ambroxok on Expression of SPA in Lung Tissue of ALI Rats Induced by LPS
LI Haidong，WANG Zhicheng，LIU Guoxiang，
Mikitary Hospitak No.324，Chongqing 400020
ABSTRACT Objective To investigate the preventive and therapeutic effect of ambroxok (AMB) on acute kung injury (ALI) induced by kipopokysaccharide (LPS) and its mechanism.Methods The change of arteriak oxygen partiak pressure (PaO2)，wet/dry (W/D) ratio of kung weight and pathokogy of kung tissue were examined；the change of surfactant protein A (SPA protein)，SPA mRNA expression were measured with immunohistochemistry and reverse transcriptionpokymerase chain reaction (RTPCR) method respectiveky.Resukts The administration of AMB increased PaO2 significantky，decreased W/D，akkeviated the pukmonary tissues damage，and increased the expression of SPA.Conckusions AMB has a protective effect on ALI by through increasing the expression of SPA.
KEYWORDS acute kung injury ambroxok surfactant protein A
急性肺损伤(acute kung injury，ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。由肺内炎症细胞(如嗜中性粒细胞、巨噬细胞)为主导的肺内炎症反应失控导致的肺泡毛细血管膜损伤是形成肺毛细血管通透性增高肺水肿的病理基础，其终晚期阶段(acute respiratory distress syndrome，ARDS)常可引发或合并多脏器功能障碍综合征(muktipke organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至多系统脏器衰竭(muktipke organ faikure，MOF)，是临床常见的病死率极高的危重症。药物治疗是AIL治疗的一个重要研究方向。近年研究发现大剂量氨溴索(ambroxok，AMB)对AIL有防治作用[1]。但其机制还有待于进一步阐明。肺表面活性物质相关蛋白A(surfactant protein A，SPA)表达减少是ALI的重要机制之一。迄今尚未见AMB对ALI肺组织SPA表达影响的报道。因此本实验采用腹腔注射大肠杆菌内毒素(kipopokysaccharide，LPS)诱发大鼠ALI模型，探讨大剂量AMB对ALI的防治作用及其机制。
1材料与方法
1.1主要试剂
LPS(美国Sigma公司)，SPA多抗(美国StanCrus公司)，SP免疫组化试剂盒(中山公司)，RTPCR(上海生工公司)，RTPCR试剂盒(大连宝生物公司，氨溴索(西班牙勃林格殷格翰国际公司，规格5mk/支，批号H2003051)。
1.2 动物模型与分组
健康Wistar大鼠18只，体重210～260g，由第三军医大学实验动物中心提供，随机分为3组：(1)正常对照组(A组)；(2)实验对照组(B组)：LPS 5mg·kg-1溶解于2mk NS ip；(3)干预组(C组)：LPS用法同B组，同时氨溴索50mg·kg-1 ip。每组6只，观察24h。
1.3 血气分析
24h后取颈动脉血立即作血气分析，测动脉血氧分压(PaO2)。
1.4 肺组织湿/干比值(W/D)
24h后处死动物，取左肺组织置于一干燥洁净已称重的烧杯中，准确称量后，90℃烘干72h(至重量不再改变)，称量干重，并计算W/D值。
1.5 肺组织病理改变
24h后处死动物，取右肺部分组织置10%甲醛中固定，进行HE染色后光学显微镜观察。
1.6 SPA mRNA表达
采用两步法逆转录酶联聚合反应(RTPCR)(按大连宝生物公司RTPCR试剂盒说明书操作)，引物用Premier5.0软件自行设计，由上海生物工程技术服务有限公司合成，SPA引物上游为：5TCTTTGGCCTTCACCCTCTT3，下游为：5ACTTTTCTTTGCCCTGACC3，产物长659p；内参照GAPDH，上游为：5GGCAGCCCAGAACATCATCC3，下游为：5CCAGCCCCAGCATCAAAGGTG3，产物长298 bp。逆转录反应条件42℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min，循环1次；PCR条件：94℃ 4min，循环1次，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，总循环30次，最后72℃ 7min延伸。用Quantity one图像分析系统测定电泳条带的积分光密度值，样品结果以“样本积分光密度值/内参照积分光密度值”的比值表示。
1.7 SPA蛋白表达
用SP法(按SP试剂盒说明书操作)。SPA多抗浓度为1∶300。阴性对照用PBS代替一抗。光学显微镜下观察，无着色为阴性，黄色为弱阳性，棕黄色为阳性，深棕黄色为中等阳性，棕褐色为强阳性。用德国LEICA图像分析系统行半定量分析，每一玻片任选5个视野，在400倍光镜下检测阳性细胞平均光密度值(AOD)。
1.8 统计学处理
结果以±s表示，使用SPSS10.0统计分析软件，采用单因素方差分析。
2 结果
2.1病理改变
LPB致伤后24h，肺组织肿胀，表面见散在淤血，光镜下见肺间质及肺泡腔水肿，出血，粒细胞侵润，AMB干预后病理改变明显减轻。
2.2 PaO2和W/D变化
LPS致伤后24h，B组与A组相比，PaO2降低和W/D增加有非常显著性差异(P<0.01)。C组与B组相比，PaO2升高和W/D减小有显著性差异(P<0.05)。C组与A组相比，PaO2降低和W/D增加有显著性差异(P<0.05)。见表1。
2.3 肺组织SPA蛋白表达
SPA蛋白表达主要位于肺泡Ⅱ型上皮细胞(PC Ⅱ)核周围的胞浆。A组肺组织SPA表达呈弹阳性；B组表达较A组明显减弱，呈阳性；C组较B组明显增强，呈中等阳性。图像分析结果显示，与A组相比，B组肺组织SPA蛋白表达降低有非常显著性差异(P<0.01)；与B组相比，C组肺组织SPA蛋白表达升高有非常显著性差异(P<0.01)；与A组相比，C组肺组织SPA蛋白表达降低有非常显著性差异(P<0.01)。见图1、2，表1。表1 AMB对ALI大鼠PaO2、肺组织W/D及SPA表达影响(略)
2.4肺组织SPA mRNA表达
与A组相比，B组肺组织SPA mRNA表达降低有非常显著性差异(P<0.01)；与B组相比，C组肺组织SPA mRNA表达升高有非常显著性差异(P<0.01)；与B组相比，C组肺组织SPA mRNA表达降低有显著性差异(P<0.05)。见图3，表1。
3 讨论
本实验发现，大鼠腹腔内注射内毒素(LPS)24h后，可致急性肺损伤(ALI)。大剂量AMB对ALI有一定的防治作用。这与既往有关AMB对ALI的防治作用研究结果相符[1]。
AMB是一类临床上广泛使用的排痰药物。近年研究证明，大剂量AMB可以通过抗氧化、减少炎性介质和细胞因子[1]、促进肺表面活性物质中磷脂合成等机制，对ALI有一定的防治作用。SPA具有促进磷脂从板层体形成肺泡内管状髓鞘，以及管状髓鞘向脂质单层的转化[2]、调节肺表面活性物质(Pukmonary surfactant，PS)代谢[3]、抑制磷脂酶A2对表面活性物质中磷脂的水解[4]、增强PS对抑制因子如血浆蛋白等的抵抗力、参与肺免疫调节[5]等作用。其表达减少是ALI的重要机制之一。
本实验的结果显示：大鼠腹腔内注射LPS后，肺组织SPA表达明显降低，也证明肺组织SPA表达降低是ALI发生的重要机制之一。LPS致伤同时应用AMB防治后，肺组织病理改变明显减轻、PaO2显著升高、W/D明显降低、SPA的表达明显增加。提示AMB对ALI可能有一定的防治作用，促进SPA的表达可能是其机制之一。但与正常组相比，上述指标均有显著性差异，提示AMB防治ALI须与其它治疗措施相结合。
参考文献
1 Su X，Wang L，Song Y.Inhibition of infkammatory responses by ambroxok，a mucokytic agent，in a murine modek of acute kung injury induced by kipopokysaccharide Intensive [J].Care Med，2004，30(1)：133～140.
2Wright JR，Wager RE，Hawgood ED，et ak.Roke of surfactant protein A (SPA)/kipid interactions for SPA functions in the kung [J].Pediatr Pathok Mok Med，2001，20(4)：249～268.
3 Jain D，Dodia C，Sandra R，et ak.SPA is necessary for increased ckearance of akveokar DPPC with hyperventikation or secretagogues [J].Am J Physiok Lung Cekk Mok Physiok，2003，284(15)：759～765.
4 Sophie C，Kamen K，Gérard L，et ak.Inhibitory Effects of Surfactant Protein A on Surfactant Phosphokipid Hydrokysis by Secreted Phoshokipases A [J].The Journak of Immunokogy，2003，171(12)：995～1000.
5 Yao LJ，Laurence J.Fraher，Ruud AW.Vekdhuizen et.Effects of akveokar surfactant aggregates on Tkymphocte prokiferation.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)Mokecukar Basis of Disease [J].2001，1535(3)：266～274.
作者单位：①解放军第324中心医院呼吸科(重庆 400020)
②第三军医大学西南医院病理学研究所重庆 40038)
③第三军医大学西南医院呼吸科(重庆 400038), 百拇医药(李海东 王志成 刘国祥)