降钙素受体家族的受体活性修饰蛋白的研究进展
降钙素基因相关肽家族包括降钙素(calcitonin，CT)、两种降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptides，CGRP)、肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)和胰淀粉样酶(amylin);它们均与相应的高亲和力受体结合而发挥作用，并且某些受体存在不同的亚型。这些受体包括降钙素受体(Calcitonin receptor，CTR)和降钙素受体样受体(calcitonin receptor-lile re-ceptor，CRLR)。1991年CTR首先被克隆出来，随后的研究发现CTR属于G蛋白耦连受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)家族B组，与CT结合可以介导其抑制骨吸收的作用。CRLR与CTR有55%的同源性;它需要一组称作受体活性修饰蛋白(receptor activity modifying proteins，RAMPs)的Ⅰ型跨膜蛋白的协同作用，才可以介导CGRP的作用。对GPCRs的研究一直以配体-受体作用为中心，RAMPs的发现使蛋白质-蛋白质作用的研究得到了广泛重视。
1 RAMPs的发现
1998年，McLatchie [1] 等发现从表达CGRP受体的细胞系SK-N-MC中提取RNA作用Xenopus细胞后，CGRP可以诱导细胞反应;cRNA相应的蛋白质称为人RAMP1，对其进行克隆研究，发现它由148个氨基酸组成，分子结构包括一段含有氨基端的长胞外区、跨膜区和一段短胞外区。随后研究证实RAMP1还存在异构体RAMP2及RAMP3，并发现虽然RAMPs在氨基端均有一段包含4个半胱氨酸、对二级结构的形成有重要作用的基本结构，但它们的氨基 酸同源性只有30%，RAMP2同源性最低，比RAMP1 和RAMP3多26个氨基酸。
在哺乳动物细胞如COS-7、人胚肾细胞(HEK)-293和3T3细胞系中，单独转染CRLR或RAMP1的RNA均不能诱导CGRP的结合或反应，但同时表达这两种蛋白会有CGRP受体反应。值得注意的是，CRLR与RAMP2或RAMP3共表达的细胞会产生与CGRP药理学性质不同的受体—ADM受体。由此可看出不同的RAMPs与受体作用而表现其特异性。
除了与CRLR相互作用，RAMPs还可以与降钙素受体的基因产物作用产生胰淀粉样酶受体 [2] 。当然，不同的RAMPs功能不同。在COS-7细胞或兔主动脉内皮细胞(RAECs)中，RAMP1和RAMP3均可产生胰淀粉样酶受体表型，但它们与CGRP的亲和力不同;RAMP2不能诱导胰淀粉样酶受体表型。最近的研究提示RAMP2也可以诱导一个与RAMP1或RAMP3诱导的胰淀粉样酶受体不同的亚型;但是，RAMP2的作用很大程度上依赖于细胞内的状况和研究所用的CTR异构体的种类。
2 RAMPs的作用及机制
RAMPs的作用至少包括3种:1)从胞内运输受体蛋白到细胞表面;2)形成受体末端糖基化;3)可能通过直接或间接作用于配体结合位点而改变受体表型。
2.1 受体的转移 CRLR需要RAMPs的存在，才能转移到细胞表面发挥受体作用。应用荧光联合细胞分类和共焦显微镜分析用抗原标记的CRLR，发现三种RAMPs均能诱导CRLR转移到细胞表面;并且这是个相互作用的过程，RAMPs转移到细胞表面也需要CRLR的存在。
与CRLR不同，CTR到细胞表面的转位过程不需要RAMP的存在。到目前为止，对所有单独表达CTR的细胞应用功能性和放射性结合的方法跟踪，发现CTR可以有效的转移到细胞表面。但是，和CRLR一样，CTRs可以引起RAMPs向细胞表面的转位。
2.2 受体的糖基化 在RAMP1诱导CGRP受体表型的作用中，不仅可以使CRLR向细胞表面转位，还可以产生CRLR末端糖基化改变。应用标记蛋白进行免疫共沉淀研究证实，RAMP1可以与成熟的和不成熟的CRLR形成复合体，在细胞表面产生CGRP受体表型;而不能产生CGRP受体表型的RAMP2和RAMP3同样不能产生CRLR的糖基化改变，可以推测RAMP1对CRLR糖基化的改变对CGRP受体的形成非常重要。最近的研究还提示N-末端是RAMP功能发挥的关键部位，只有存在N-末端的RAMP1才能改变CRLR的糖基化，诱导CGRP与受体的结合，而没有N-末端的野生型RAMP1就没有这样的作用。糖基化改变不只对CRLR的作用很重要，还与RAMPs的作用密切相关。Flahaut [3] 等研究发现，细胞表面存在N-糖基化的RAMP2和RAMP3，并且它们往细胞表面的运输需要N-末端多糖的形成;而RAMP1的N-末端没有形成糖基化，它需要与CRLR形成二聚体才能到达细胞膜。目前，RAMPs是否可以引起CTR的糖基化尚不清楚。Perry [4] 对鼠α-TSH细胞共转染RAMP1-CTR后发现，虽然其分子量没有变化，但内源性表达的胰淀粉样酶和CTR的分子量有糖基化变化的迹象。与哺乳细胞的研究结果不同，Aldecoa [5] 对昆虫细胞Schneider2研究发现，hRAMP1不会引起hCRLR的糖基化改变，提示糖基化改变并不是RAMP与CRLR形成CGRP受体所必需的。
2.3 受体表型 RAMPs到达细胞膜后，通过与受体的相互作用而决定配体结合位点的特异性。Foord和Marshall [6] 发现其作用机制可能是RAMPs直接作用配体结合位点或改变受体构型而决定对配体的特异性。利用放射性配体交叉结合方法观察细胞表面的作用，发现 125 I-CGRP除了可以与单独的CRLR及CRLR-RAMP复合物结合，还可以与单独的RAMP1结合，这证实了RAMPs可以直接与配体结合而发挥其作用。另外，Kuwasako [7] 等发现从CGRP与受体结合至诱导发生受体内陷的过程中，均可观察到RAMP1与CRLR形成的复合物，并且这种复合物进入溶酶体而降解;Aldecoa [5] 应用Western Blot研究抗原标记的RAMP2和CRLR，同样观察到配体与CRLR-RAMP形成的复合物;后来也发现了胰淀粉样 酶和CTR及RAMP1形成的复合物;对CGRP受体来说，CGRP与RAMP1的直接交叉连接提示RAMP1位于结合位点的附近，可能直接作用CRLR而促进其与CGRP的结合。RAMPs还能影响配体与CRLR结合的亲和力。Zumpe [8] 等的研究证实RAMP2与hC-TRI1的亲和力弱于RAMP1的，亲合力的大小由RAMP的跨膜结构/C-末端决定。许多研究证实RAMP的跨膜区/C-末端是与受体作用的基本部位;而N-末端与受体特异性密切相关。含有N-末端的RAMP1与CRLR共表达可诱导 125 I-CGRP与受体的特异性结合;同样，与CTR一起决定胰淀粉样酶的结合。
3 RAMP-受体的调控
RAMPs广泛分布于各种组织中;RAMP1在骨骼肌、胰腺及脑组织中高水平表达，但在肾和肝组织中表达水平很低;RAMP2在肺、心脏中有较高水平的表达，在肾、肝中同样低水平表达;RAMP3在组织中的表达有种系差异:人体各组织中存在高水平的RAMP3，而在鼠组织中普遍为低水平。
Chakravarty [9] 等为了探讨RAMP和CRLR的mRNA水平对内源性CGRP或ADM受体的作用，发现RAMP1的mRNA水平与CGRP的结合有很大联系;RAMP2的mRNA水平影响ADM的结合。当然，CGRP或ADM与受体的结合还与CRLR的表达水平有关，也可以说，RAMP-CRLR可以决定大部分CGRP和ADM的受体的特性。
最近研究证实RAMP的mRNA水平被一系列病理生理上的改变或药物治疗模型动态调节。Nagae [10] 等设计了一个由鼠肾纤维化引起的单侧输尿管阻塞模型，发现肾组织中RAMP1的表达水平升高了13倍，RAMP2水平升高了3倍，而RAMP3水平没有变化;14天后，CRLR水平也开始升高。Ono [11] 等对一个家鼠败血症模型进行研究，发现RAMPs的表达存在组织依赖性变化:肺组织中，RAMP1的mRNA水平略降低而RAMP3水平显著升高;脾组织中，RAMP1和RAMP2水平中度降低而RAMP3水平显著升高;心脏和甲状腺中，RAMP1和RAMP2水平下降，RAMP3水平不变或下降。RAMP3的显著上调可能是因为它是一个替代受体或是具有某些受体依赖性的作用。
Frayon [12] 等研究糖皮质激素作用人冠状动脉来源的血管平滑肌细胞发现，其可以升高RAMP1的mRNA水平，但对RAMP2没有作用。人体内血管存在这些激素或许可以解释其对CGRP的反应，而从血管平滑肌和RAEC分离的细胞却可以高水平表达RAMP2和ADM受体的特性。
曾有学者认为，对RAMP表达的调节可能是对受体特异性的调节，RAMP水平的改变可以使细胞失去CGRP的反应，而对ADM反应增加。这可能对与CGRP或ADM水平改变有关的疾病如周期性偏头痛、败血症、肌变性及坐骨神经炎的发生有关。 4 结语
对RAMPs的研究的不断深入，一方面更加全面的阐明了它作用的分子机制，一方面也发现了更多需要探索的新领域，如发现其它与RAMP相互作用的受体、特异性G蛋白在RAMP-受体的功能中的作用及RAMP表达调控在疾病发生发展中的潜在意义等;另外，RAMP-受体的相互作用为将来开发药物提供了一个有效的手段。
参考文献
1 McLatchie LM，et al.Nature，1998;393∶333～339.
2 Jordan BA，Devi LA.Nature399(1999)，pp.697～700.
3 Flahaut M，Rossier BC，Firsov D.J Biol Chem2002Apr26;277(17)∶14731～7.
4 Perry KJ，Quiza M，Myers DE，et al.Endocrinology138(1997)，pp.3486～3496
5 Aldecoa A，Gujer R，Fischer JA，et al.FEBS Lett471(2000)，pp.156～160
6 SM Foord and FH Marshall.Trends Pharmacol Sci20(1999)，pp.184～187
7 Kuwasako K，Shimekake Y，Masuda M，et al.J Biol Chem275(2000)，pp.29602～29609
8 Zumpe E，Tilakaratne N，Fraser NJ，et al.Biochem Bio-phys Res Commun267(2000)，pp.368～372
9 Chakravarty P，Suthar TP，Coppock HA，et al.Br J Phar-macol130(2000)，pp.189～195.
10 Nagae T，Mukoyama M，Sugawara A，et al.Biochem Bio-phys Res Commun270(2000)，pp.89～93
11 Ono Y，Okano I，Kojima M，et al.Biochem Biophys Res Commun271(2000)，pp.197～202
12 Frayon S，Cueille C，Gnidehou S，et al.Biochem BiophysRes Commun270(1999)，pp.1063～1067
(山东金泰生物工程有限公司 济南 250100), 百拇医药(冯敏燕 刘晓黎 李素梅 解琨)
1 RAMPs的发现
1998年，McLatchie [1] 等发现从表达CGRP受体的细胞系SK-N-MC中提取RNA作用Xenopus细胞后，CGRP可以诱导细胞反应;cRNA相应的蛋白质称为人RAMP1，对其进行克隆研究，发现它由148个氨基酸组成，分子结构包括一段含有氨基端的长胞外区、跨膜区和一段短胞外区。随后研究证实RAMP1还存在异构体RAMP2及RAMP3，并发现虽然RAMPs在氨基端均有一段包含4个半胱氨酸、对二级结构的形成有重要作用的基本结构，但它们的氨基 酸同源性只有30%，RAMP2同源性最低，比RAMP1 和RAMP3多26个氨基酸。
在哺乳动物细胞如COS-7、人胚肾细胞(HEK)-293和3T3细胞系中，单独转染CRLR或RAMP1的RNA均不能诱导CGRP的结合或反应，但同时表达这两种蛋白会有CGRP受体反应。值得注意的是，CRLR与RAMP2或RAMP3共表达的细胞会产生与CGRP药理学性质不同的受体—ADM受体。由此可看出不同的RAMPs与受体作用而表现其特异性。
除了与CRLR相互作用，RAMPs还可以与降钙素受体的基因产物作用产生胰淀粉样酶受体 [2] 。当然，不同的RAMPs功能不同。在COS-7细胞或兔主动脉内皮细胞(RAECs)中，RAMP1和RAMP3均可产生胰淀粉样酶受体表型，但它们与CGRP的亲和力不同;RAMP2不能诱导胰淀粉样酶受体表型。最近的研究提示RAMP2也可以诱导一个与RAMP1或RAMP3诱导的胰淀粉样酶受体不同的亚型;但是，RAMP2的作用很大程度上依赖于细胞内的状况和研究所用的CTR异构体的种类。
2 RAMPs的作用及机制
RAMPs的作用至少包括3种:1)从胞内运输受体蛋白到细胞表面;2)形成受体末端糖基化;3)可能通过直接或间接作用于配体结合位点而改变受体表型。
2.1 受体的转移 CRLR需要RAMPs的存在，才能转移到细胞表面发挥受体作用。应用荧光联合细胞分类和共焦显微镜分析用抗原标记的CRLR，发现三种RAMPs均能诱导CRLR转移到细胞表面;并且这是个相互作用的过程，RAMPs转移到细胞表面也需要CRLR的存在。
与CRLR不同，CTR到细胞表面的转位过程不需要RAMP的存在。到目前为止，对所有单独表达CTR的细胞应用功能性和放射性结合的方法跟踪，发现CTR可以有效的转移到细胞表面。但是，和CRLR一样，CTRs可以引起RAMPs向细胞表面的转位。
2.2 受体的糖基化 在RAMP1诱导CGRP受体表型的作用中，不仅可以使CRLR向细胞表面转位，还可以产生CRLR末端糖基化改变。应用标记蛋白进行免疫共沉淀研究证实，RAMP1可以与成熟的和不成熟的CRLR形成复合体，在细胞表面产生CGRP受体表型;而不能产生CGRP受体表型的RAMP2和RAMP3同样不能产生CRLR的糖基化改变，可以推测RAMP1对CRLR糖基化的改变对CGRP受体的形成非常重要。最近的研究还提示N-末端是RAMP功能发挥的关键部位，只有存在N-末端的RAMP1才能改变CRLR的糖基化，诱导CGRP与受体的结合，而没有N-末端的野生型RAMP1就没有这样的作用。糖基化改变不只对CRLR的作用很重要，还与RAMPs的作用密切相关。Flahaut [3] 等研究发现，细胞表面存在N-糖基化的RAMP2和RAMP3，并且它们往细胞表面的运输需要N-末端多糖的形成;而RAMP1的N-末端没有形成糖基化，它需要与CRLR形成二聚体才能到达细胞膜。目前，RAMPs是否可以引起CTR的糖基化尚不清楚。Perry [4] 对鼠α-TSH细胞共转染RAMP1-CTR后发现，虽然其分子量没有变化，但内源性表达的胰淀粉样酶和CTR的分子量有糖基化变化的迹象。与哺乳细胞的研究结果不同，Aldecoa [5] 对昆虫细胞Schneider2研究发现，hRAMP1不会引起hCRLR的糖基化改变，提示糖基化改变并不是RAMP与CRLR形成CGRP受体所必需的。
2.3 受体表型 RAMPs到达细胞膜后，通过与受体的相互作用而决定配体结合位点的特异性。Foord和Marshall [6] 发现其作用机制可能是RAMPs直接作用配体结合位点或改变受体构型而决定对配体的特异性。利用放射性配体交叉结合方法观察细胞表面的作用，发现 125 I-CGRP除了可以与单独的CRLR及CRLR-RAMP复合物结合，还可以与单独的RAMP1结合，这证实了RAMPs可以直接与配体结合而发挥其作用。另外，Kuwasako [7] 等发现从CGRP与受体结合至诱导发生受体内陷的过程中，均可观察到RAMP1与CRLR形成的复合物，并且这种复合物进入溶酶体而降解;Aldecoa [5] 应用Western Blot研究抗原标记的RAMP2和CRLR，同样观察到配体与CRLR-RAMP形成的复合物;后来也发现了胰淀粉样 酶和CTR及RAMP1形成的复合物;对CGRP受体来说，CGRP与RAMP1的直接交叉连接提示RAMP1位于结合位点的附近，可能直接作用CRLR而促进其与CGRP的结合。RAMPs还能影响配体与CRLR结合的亲和力。Zumpe [8] 等的研究证实RAMP2与hC-TRI1的亲和力弱于RAMP1的，亲合力的大小由RAMP的跨膜结构/C-末端决定。许多研究证实RAMP的跨膜区/C-末端是与受体作用的基本部位;而N-末端与受体特异性密切相关。含有N-末端的RAMP1与CRLR共表达可诱导 125 I-CGRP与受体的特异性结合;同样，与CTR一起决定胰淀粉样酶的结合。
3 RAMP-受体的调控
RAMPs广泛分布于各种组织中;RAMP1在骨骼肌、胰腺及脑组织中高水平表达，但在肾和肝组织中表达水平很低;RAMP2在肺、心脏中有较高水平的表达，在肾、肝中同样低水平表达;RAMP3在组织中的表达有种系差异:人体各组织中存在高水平的RAMP3，而在鼠组织中普遍为低水平。
Chakravarty [9] 等为了探讨RAMP和CRLR的mRNA水平对内源性CGRP或ADM受体的作用，发现RAMP1的mRNA水平与CGRP的结合有很大联系;RAMP2的mRNA水平影响ADM的结合。当然，CGRP或ADM与受体的结合还与CRLR的表达水平有关，也可以说，RAMP-CRLR可以决定大部分CGRP和ADM的受体的特性。
最近研究证实RAMP的mRNA水平被一系列病理生理上的改变或药物治疗模型动态调节。Nagae [10] 等设计了一个由鼠肾纤维化引起的单侧输尿管阻塞模型，发现肾组织中RAMP1的表达水平升高了13倍，RAMP2水平升高了3倍，而RAMP3水平没有变化;14天后，CRLR水平也开始升高。Ono [11] 等对一个家鼠败血症模型进行研究，发现RAMPs的表达存在组织依赖性变化:肺组织中，RAMP1的mRNA水平略降低而RAMP3水平显著升高;脾组织中，RAMP1和RAMP2水平中度降低而RAMP3水平显著升高;心脏和甲状腺中，RAMP1和RAMP2水平下降，RAMP3水平不变或下降。RAMP3的显著上调可能是因为它是一个替代受体或是具有某些受体依赖性的作用。
Frayon [12] 等研究糖皮质激素作用人冠状动脉来源的血管平滑肌细胞发现，其可以升高RAMP1的mRNA水平，但对RAMP2没有作用。人体内血管存在这些激素或许可以解释其对CGRP的反应，而从血管平滑肌和RAEC分离的细胞却可以高水平表达RAMP2和ADM受体的特性。
曾有学者认为，对RAMP表达的调节可能是对受体特异性的调节，RAMP水平的改变可以使细胞失去CGRP的反应，而对ADM反应增加。这可能对与CGRP或ADM水平改变有关的疾病如周期性偏头痛、败血症、肌变性及坐骨神经炎的发生有关。 4 结语
对RAMPs的研究的不断深入，一方面更加全面的阐明了它作用的分子机制，一方面也发现了更多需要探索的新领域，如发现其它与RAMP相互作用的受体、特异性G蛋白在RAMP-受体的功能中的作用及RAMP表达调控在疾病发生发展中的潜在意义等;另外，RAMP-受体的相互作用为将来开发药物提供了一个有效的手段。
参考文献
1 McLatchie LM，et al.Nature，1998;393∶333～339.
2 Jordan BA，Devi LA.Nature399(1999)，pp.697～700.
3 Flahaut M，Rossier BC，Firsov D.J Biol Chem2002Apr26;277(17)∶14731～7.
4 Perry KJ，Quiza M，Myers DE，et al.Endocrinology138(1997)，pp.3486～3496
5 Aldecoa A，Gujer R，Fischer JA，et al.FEBS Lett471(2000)，pp.156～160
6 SM Foord and FH Marshall.Trends Pharmacol Sci20(1999)，pp.184～187
7 Kuwasako K，Shimekake Y，Masuda M，et al.J Biol Chem275(2000)，pp.29602～29609
8 Zumpe E，Tilakaratne N，Fraser NJ，et al.Biochem Bio-phys Res Commun267(2000)，pp.368～372
9 Chakravarty P，Suthar TP，Coppock HA，et al.Br J Phar-macol130(2000)，pp.189～195.
10 Nagae T，Mukoyama M，Sugawara A，et al.Biochem Bio-phys Res Commun270(2000)，pp.89～93
11 Ono Y，Okano I，Kojima M，et al.Biochem Biophys Res Commun271(2000)，pp.197～202
12 Frayon S，Cueille C，Gnidehou S，et al.Biochem BiophysRes Commun270(1999)，pp.1063～1067
(山东金泰生物工程有限公司 济南 250100), 百拇医药(冯敏燕 刘晓黎 李素梅 解琨)