富硒活性乳酸菌发酵剂的工艺研究
Effects of the Changes of Trace Elements Level in Human Boby
on Repetitive Respiratory Intection
LIAO Bing,WU Wei
(The Peoples Hospital of Xingan County,Jiangxi Xingan 331300,China)
Abstract:The trace element content of 240 children with repetitive respiratory infection was detected and studied.The results showed that Zn,Fe and Ca deficiencies were pervasive among children with repetitive respiratory infection,compared with the normal controls.However,Pb content of children with repetitive respiratory infection iacreased compared with the normal controls.
Key words:trace element;repetitive respiratory intection;children
摘 要：通过L9(33)正交试验确定了富硒活性乳酸菌发酵剂的适宜发酵条件，即发酵温度39℃，加硒量5 μg/mL，接种量7%。结果表明，研制的发酵剂硒转化率达5038%，冷藏5 d 后发酵活力达048，冷藏7 d后活菌数达72×108 cfu/mL，符合发酵剂的各项质量要求，可作为生产富硒活性乳酸菌功能性乳制品的工作发酵剂。
关键词：活性乳酸菌；发酵剂；富硒；工作发酵剂
研究表明，人体的克山病、大骨节病、癌症、心血管病、糖尿病、机体免疫力减弱和衰老等40余种疾病均与缺硒有关[1]。美国科学家研究委员会食品与营养委员会推荐的每日硒摄入量为50～200 μg，人体对于硒的摄入量如果长期低于正常水平，罹患癌症的几率就会加大。我国是个缺硒的国家，多数土壤中硒总量小于01 μg/g，严重缺硒的地区土壤中硒总量不到005 μg/g。调查表明，天然食物中硒含量普遍偏低，一般不足001 μg/g，例如普通乳及乳制品中硒的含量就低于001 μg/mL[3]，这对于要达到人体预防疾病的需要量来说，是微不足道的。适量补硒对于人体有益。但是如果服用过量则会产生一定毒副作用，会出现疲倦，体重下降，呕吐，口中有金属味感，皮肤改变，脱发，声音沙哑，牙齿脱落和指甲断裂等症状。因此科学补硒，研究开发安全的富硒乳制品非常必要[10]。
嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关，它能改善调节人体肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，减低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等，起到健康促进效果[2，9]。近年来，随着高新生物工程技术和食品科技的发展，一些含乳酸菌的保健食品相继出现，同时也出现了一些硒强化食品，但是把两者有机结合在一起的富硒活性乳酸菌功能性乳制品还没有。本研究计划通过研究开发富硒活性乳酸菌功能性乳制品，将上述两者结合起来，更好发挥两者的保健功能，从而推进乳业的发展，为人们预防疾病、提高健康水平起到积极的作用。
富硒活性乳酸菌发酵剂的制备是生产富硒活性乳酸菌功能性乳制品的重要环节，根据嗜热链球菌和保加利亚杆菌的共生作用推测嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚杆菌也有共生作用[5]。因此本文以嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚杆菌按1∶1∶1混合做菌种，在发酵过程中添加亚硒酸钠，通过乳酸菌的生物转化，使活性乳酸菌发酵剂富集有机硒。通过正交试验确定发酵温度、加硒量、接种量等最佳发酵条件，以期获得制作富硒活性乳酸菌功能性乳制品所用的活力较强的发酵剂。
1 材料与方法
11 菌种
保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaria，简称LB)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，简称ST)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，简称LA)：由河南科技学院食品微生物学实验室与研究所提供。
12 培养基
MRS 琼脂营养培养基，复原脱脂乳培养基。
13 试剂
Na2SeO3(分析纯)，100 μg/mL 硒标准储备液，01 μg/mL 硒标准工作液，NaCl，01 mol/L NaOH，1∶1 HCl。EDTA 三乙醇胺掩蔽剂：EDTA_Na2·H2O 75 g，三乙醇胺25 mL，定容至500 mL。碱性硫化物溶液：NaS·9 H2O 74 g，Na2SO3 24 g，NaOH 4 g，定容至100 mL。甲醛溶液：36%～38%。005%亚甲蓝溶液。
14 仪器
SW-CJ-IF 超净工作台，LRH-150 B生化培养箱，101-2鼓风干燥箱，CRDX-28 高压蒸汽杀菌锅，MD 100-2电子分析天平，显微镜等。
15 方法
151 工艺流程
菌种活化→分离、纯化→鉴别→扩培→发酵剂菌种 ↓ 复原脱脂乳→杀菌→冷却→接种→培养→冷却冷藏→检验→工作发酵剂
152 菌种活化
酸奶在贮藏过程中菌种活力可能降低，因此需要活化一次，提高菌种活力。用无菌吸管吸取1 mL 酸奶于装有10 mL MRS 琼脂营养培养基的试管中，41℃培养24 h。
153 菌种分离、纯化
用接种环挑取菌液在 MRS 固体平板上划线接种，41℃培养24 h，挑取典型单菌落镜检，初步判断菌种类别后，用平板划线法分离纯化得到纯菌落。
154 菌种鉴别
观察平板上长出的菌落形态进行镜检，确认菌种的典型特征，将鉴别后的菌种接到 MRS 液体培养基中，41℃培养24 h 后，4℃保存。
155 发酵剂发酵条件的确定
以酸度作为评定标准，通过L9(33)正交试验确定发酵剂的最佳发酵条件。
156 发酵剂感官检验
按要求对所制备的发酵剂进行感官检验，评定其感官质量。
157 发酵剂化学检验
采用酸碱滴定法测定成品发酵剂的酸度。
158 酸度的测定方法
培养5 h 后，采用酸碱滴定法。
159 富硒能力的测定
亚甲蓝还原法[6]。
(1)原理：亚甲蓝被硫化物还原，硒对该反应有催化作用，使反应速度加快，硒质量浓度与亚甲蓝还原速度呈相关的关系，从而得到硒的含量。
(2)硒标准储备溶液(100 μg/mL)：溶解分析纯亚硒酸钠0219 0 g 于蒸馏水中，小心转入1 L 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升含硒100 μg。
(3)硒标准工作溶液(01 μg/mL)：采用10倍稀释法将硒标准储备溶液(100 μg/mL)稀释成01 μg/mL备用。
(4)残留无机硒含量的测定：将4℃保存3 d 后的发酵剂稀释10倍，吸取3 mL 发酵剂，定容至10 mL，用亚甲蓝还原法，测得褪色时间，然后由回归方程计算其含硒量。
(5)亚甲蓝还原法标准回归曲线的绘制：准确吸取01 μg/mL 的硒标准溶液00、10、30、50、70、100 mL置于25 mL 有塞管中，定容至10 mL，加入掩蔽剂5 mL、甲醛5 mL、碱性硫化物1 mL，分别混匀后，加入0005%亚甲蓝溶液2滴，立即混匀，置于31℃水浴中，秒表记时，记录褪色时间(见表1)，以反应速率(s-1)为横坐标，硒含量(μg)为纵坐标，绘制曲线(见图1)。表1 亚甲蓝还原法线性范围统计结果(略)
(6)回归分析：见图1。
(7)有机硒含量的测定[7，8]：有机硒含量＝总硒含量-残留无机硒含量。
(8)富硒能力(有机硒转化率)：有机硒转化率＝(有机硒含量/总硒含量)×100%。
1510 发酵剂活力的测定
在高压灭菌后的复原脱脂乳培养基中加入3%的发酵剂，并在39℃的培养箱内培养35 h，然后用酸度测定方法测定其酸度，酸度达04%则认为活力较好，并以酸度的数值(此时为04)来表示。
1511 发酵剂活菌数的测定
采用平板菌落记数法。
2 结果与讨论
21 发酵条件的确定
211 因素水平的确定
见表2。保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌的最适生长温度为37～43℃，故选37℃，39℃，41℃三水平。根据国家标准，成人硒日摄入量为50～250 μg，富硒食品要求液态奶类硒含量大于0025 μg/mL，所以选定5，10，15 μg/mL为加硒量的三水平。一般发酵剂接种量在5%左右，选3%，5%，7%为三水平。表2 富硒发酵剂正交试验因素水平表(略)
212 正交试验结果及分析
将纯化后的保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌按1∶1∶1混合，(因为对数期菌体代谢旺盛，硒转化率高，且加硒时间越早对菌体代谢抑制越强，从转化率和生产周期考虑，以第6 h 为加硒时间，培养时间为11 h，但本次试验为简便起见，在接种的同时加硒)。采用L9(33)，以酸度(注：表3中的酸度为两次测得的酸度之和)作为评定指标做正交试验，结果见表3、表4。表3 发酵剂正交试验直观分析表(略)表4 正交试验方差分析表(略)
从表3可知，RC>RA>RB>RD，因此试验结果是可靠的，影响发酵剂品质的因素由大到小的顺序为：C接种量，A发酵温度，B加硒量，应选最佳条件为A2B1C3，即采用发酵温度为39℃，加硒量为5 μg/mL，接种量为7%。
从表4的显著性分析可见，接种量(因素C)对发酵剂的酸度影响显著，发酵温度(A)、加硒量(B)对发酵剂的影响均不显著，其中加硒量在给定水平范围内对发酵剂的酸度影响很小，因而可根据实际需要选择其较高大水平。
22 发酵剂活力的测定
采用发酵温度39℃，加硒量5 μg/mL，接种量7%制得发酵剂，放置5 d 后在高压灭菌后的复原脱脂乳培养基中加入3%的发酵剂，并在39℃的培养箱内培养35 h，然后取10 mL 发酵剂，用酚酞作指示剂，以01 mol/L的氢氧化钠来滴定，消耗氢氧化钠715 mL，即此时发酵剂的酸度为715吉尔涅尔度，用公式计算得发酵剂活力为048%。
23 硒测定方法的选择
在食品中硒的测定(GB/T 500993-2003)国家标准中规定了用荧光法和氢化物原子荧光法测定食品中硒的方法。这两种方法具有很高的灵敏度，但受设备条件的限制，在基层不便采用；二氨基联苯胺法灵敏度太低，不能满足卫生检测要求。而陈安天[6]研究表明，亚甲蓝还原法测定微量硒，简便、灵敏、快速，最低检测量为01 μg，最低检测质量浓度为001 μg/mL，适宜的反应温度在20℃～35℃之间，方法稳定、线性良好，相关系数为0928 4～0993 8，回收率在98%～102%；变异系数：实验室内为56%～68%，实验室之间为78%～87%；能满足基层卫生检测的要求[6]。根据本试验的特点和要求，确定选择亚甲蓝还原法测定残留的微量无机硒。如在实际生产中，可采用亚甲蓝还原法和国标法相结合的方法。
24 硒转化率测定结果
将4℃保藏3 d 后的发酵剂稀释10倍，吸取3 mL 发酵剂，定容至10 mL，用亚甲蓝还原法，测得褪色时间为3675 s，由回归方程及转化率公式可得发酵剂的富硒率为5038%。
25 活菌数测定结果
测得发酵剂的活菌数为：72×108cfu/mL。
26 发酵剂感官检验及预试结果
按最佳条件制备A2B1C3发酵剂，经感官检验符合感官质量要求，然后以市售鲜奶为原料乳，接种量7%，加糖量8%，39℃培养5 h，成品酸奶硒转化率达8990%。将此酸奶置于4℃的冰箱中冷藏后熟12 h后品尝鉴定，此时酸奶风味良好，香味浓厚，酸甜柔和，甜酸比协调，酸奶组织均匀细腻。
3 结论
(1)通过正交试验确定富硒活性乳酸菌发酵剂的最佳发酵条件为：发酵温度39℃，加硒量5 μg/mL，接种量7%。
(2)混和菌种采用1∶1∶1的嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚杆菌可弥补单独嗜酸乳杆菌发酵剂发酵时间长及风味的不足。
(3)采用上述最佳发酵条件制备的发酵剂，经过各项检验，符合发酵剂的各项质量要求，可作为生产富硒活性乳酸菌乳制品的工作发酵剂。其中硒总量5 μg/mL，硒转化率达5038%，冷藏5 d 后发酵活力达048，冷藏7 d 后活菌数达72×108 cfu/mL，试验确定该发酵剂是制备富硒酸奶性能良好的发酵剂。
参考文献：
[1]谢丽琪，欧阳政.酵母同化无机硒作用的研究[J].微生物学报，1990，(1)：36-40.
[2]郭本恒.功能性乳制品[M].北京：中国轻工业出版社，2001：56-103.
[3]骆承祥.乳与乳制品工艺学[M].北京：中国农业出版社，2003.
[4]刘邵军.食品微生物学实验技术[M].河北：中国农业科技出版社，2000.
[5]赵瑞香.快速功能性嗜酸乳杆菌发酵乳的研制[J].食品科技，2005，(2)：71-75.
[6]陈安天.亚甲蓝还原法测定微量硒的实验条件研究[J].交通医学，2002，(1)：724.
[7]宋照军.富硒乳酸菌的分离、筛选、驯化及富硒研究[J].中国酿造，2004，(11)：4-6.
[8]宋照军.乳酸菌富硒技术初步研究[J].食品科学，2004，(9)：137-140.
[9]毛跟年.功能食品生理特性与检测技术[M].北京：化学工业出版社，2005：252-256；608-611.
[10]陈历程.微量元素硒的研究现状及其食品强化[J].食品科学，2002，(10)：134-138.
[11]湖北省地方标准 DB 42/211-2002富硒食品标签[S].
[12](QB)Q/EFZ-01-93富硒食品含硒量标准[S].
[13]国家卫生标准：GB 13105-91食品中硒限量标准[S].
作者简介：马汉军(1965—)，男，博士，河南科技学院食品学院副教授，研究方向：畜产品贮藏加工及功能性食品研究与开发。
(河南科技学院食品学院，河南新乡 453003), 百拇医药(马汉军 宋照军 赵良 王树宁 潘润淑 裴延信)
on Repetitive Respiratory Intection
LIAO Bing,WU Wei
(The Peoples Hospital of Xingan County,Jiangxi Xingan 331300,China)
Abstract:The trace element content of 240 children with repetitive respiratory infection was detected and studied.The results showed that Zn,Fe and Ca deficiencies were pervasive among children with repetitive respiratory infection,compared with the normal controls.However,Pb content of children with repetitive respiratory infection iacreased compared with the normal controls.
Key words:trace element;repetitive respiratory intection;children
摘 要：通过L9(33)正交试验确定了富硒活性乳酸菌发酵剂的适宜发酵条件，即发酵温度39℃，加硒量5 μg/mL，接种量7%。结果表明，研制的发酵剂硒转化率达5038%，冷藏5 d 后发酵活力达048，冷藏7 d后活菌数达72×108 cfu/mL，符合发酵剂的各项质量要求，可作为生产富硒活性乳酸菌功能性乳制品的工作发酵剂。
关键词：活性乳酸菌；发酵剂；富硒；工作发酵剂
研究表明，人体的克山病、大骨节病、癌症、心血管病、糖尿病、机体免疫力减弱和衰老等40余种疾病均与缺硒有关[1]。美国科学家研究委员会食品与营养委员会推荐的每日硒摄入量为50～200 μg，人体对于硒的摄入量如果长期低于正常水平，罹患癌症的几率就会加大。我国是个缺硒的国家，多数土壤中硒总量小于01 μg/g，严重缺硒的地区土壤中硒总量不到005 μg/g。调查表明，天然食物中硒含量普遍偏低，一般不足001 μg/g，例如普通乳及乳制品中硒的含量就低于001 μg/mL[3]，这对于要达到人体预防疾病的需要量来说，是微不足道的。适量补硒对于人体有益。但是如果服用过量则会产生一定毒副作用，会出现疲倦，体重下降，呕吐，口中有金属味感，皮肤改变，脱发，声音沙哑，牙齿脱落和指甲断裂等症状。因此科学补硒，研究开发安全的富硒乳制品非常必要[10]。
嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关，它能改善调节人体肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，减低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等，起到健康促进效果[2，9]。近年来，随着高新生物工程技术和食品科技的发展，一些含乳酸菌的保健食品相继出现，同时也出现了一些硒强化食品，但是把两者有机结合在一起的富硒活性乳酸菌功能性乳制品还没有。本研究计划通过研究开发富硒活性乳酸菌功能性乳制品，将上述两者结合起来，更好发挥两者的保健功能，从而推进乳业的发展，为人们预防疾病、提高健康水平起到积极的作用。
富硒活性乳酸菌发酵剂的制备是生产富硒活性乳酸菌功能性乳制品的重要环节，根据嗜热链球菌和保加利亚杆菌的共生作用推测嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚杆菌也有共生作用[5]。因此本文以嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚杆菌按1∶1∶1混合做菌种，在发酵过程中添加亚硒酸钠，通过乳酸菌的生物转化，使活性乳酸菌发酵剂富集有机硒。通过正交试验确定发酵温度、加硒量、接种量等最佳发酵条件，以期获得制作富硒活性乳酸菌功能性乳制品所用的活力较强的发酵剂。
1 材料与方法
11 菌种
保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaria，简称LB)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，简称ST)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，简称LA)：由河南科技学院食品微生物学实验室与研究所提供。
12 培养基
MRS 琼脂营养培养基，复原脱脂乳培养基。
13 试剂
Na2SeO3(分析纯)，100 μg/mL 硒标准储备液，01 μg/mL 硒标准工作液，NaCl，01 mol/L NaOH，1∶1 HCl。EDTA 三乙醇胺掩蔽剂：EDTA_Na2·H2O 75 g，三乙醇胺25 mL，定容至500 mL。碱性硫化物溶液：NaS·9 H2O 74 g，Na2SO3 24 g，NaOH 4 g，定容至100 mL。甲醛溶液：36%～38%。005%亚甲蓝溶液。
14 仪器
SW-CJ-IF 超净工作台，LRH-150 B生化培养箱，101-2鼓风干燥箱，CRDX-28 高压蒸汽杀菌锅，MD 100-2电子分析天平，显微镜等。
15 方法
151 工艺流程
菌种活化→分离、纯化→鉴别→扩培→发酵剂菌种 ↓ 复原脱脂乳→杀菌→冷却→接种→培养→冷却冷藏→检验→工作发酵剂
152 菌种活化
酸奶在贮藏过程中菌种活力可能降低，因此需要活化一次，提高菌种活力。用无菌吸管吸取1 mL 酸奶于装有10 mL MRS 琼脂营养培养基的试管中，41℃培养24 h。
153 菌种分离、纯化
用接种环挑取菌液在 MRS 固体平板上划线接种，41℃培养24 h，挑取典型单菌落镜检，初步判断菌种类别后，用平板划线法分离纯化得到纯菌落。
154 菌种鉴别
观察平板上长出的菌落形态进行镜检，确认菌种的典型特征，将鉴别后的菌种接到 MRS 液体培养基中，41℃培养24 h 后，4℃保存。
155 发酵剂发酵条件的确定
以酸度作为评定标准，通过L9(33)正交试验确定发酵剂的最佳发酵条件。
156 发酵剂感官检验
按要求对所制备的发酵剂进行感官检验，评定其感官质量。
157 发酵剂化学检验
采用酸碱滴定法测定成品发酵剂的酸度。
158 酸度的测定方法
培养5 h 后，采用酸碱滴定法。
159 富硒能力的测定
亚甲蓝还原法[6]。
(1)原理：亚甲蓝被硫化物还原，硒对该反应有催化作用，使反应速度加快，硒质量浓度与亚甲蓝还原速度呈相关的关系，从而得到硒的含量。
(2)硒标准储备溶液(100 μg/mL)：溶解分析纯亚硒酸钠0219 0 g 于蒸馏水中，小心转入1 L 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，此溶液每毫升含硒100 μg。
(3)硒标准工作溶液(01 μg/mL)：采用10倍稀释法将硒标准储备溶液(100 μg/mL)稀释成01 μg/mL备用。
(4)残留无机硒含量的测定：将4℃保存3 d 后的发酵剂稀释10倍，吸取3 mL 发酵剂，定容至10 mL，用亚甲蓝还原法，测得褪色时间，然后由回归方程计算其含硒量。
(5)亚甲蓝还原法标准回归曲线的绘制：准确吸取01 μg/mL 的硒标准溶液00、10、30、50、70、100 mL置于25 mL 有塞管中，定容至10 mL，加入掩蔽剂5 mL、甲醛5 mL、碱性硫化物1 mL，分别混匀后，加入0005%亚甲蓝溶液2滴，立即混匀，置于31℃水浴中，秒表记时，记录褪色时间(见表1)，以反应速率(s-1)为横坐标，硒含量(μg)为纵坐标，绘制曲线(见图1)。表1 亚甲蓝还原法线性范围统计结果(略)
(6)回归分析：见图1。
(7)有机硒含量的测定[7，8]：有机硒含量＝总硒含量-残留无机硒含量。
(8)富硒能力(有机硒转化率)：有机硒转化率＝(有机硒含量/总硒含量)×100%。
1510 发酵剂活力的测定
在高压灭菌后的复原脱脂乳培养基中加入3%的发酵剂，并在39℃的培养箱内培养35 h，然后用酸度测定方法测定其酸度，酸度达04%则认为活力较好，并以酸度的数值(此时为04)来表示。
1511 发酵剂活菌数的测定
采用平板菌落记数法。
2 结果与讨论
21 发酵条件的确定
211 因素水平的确定
见表2。保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌的最适生长温度为37～43℃，故选37℃，39℃，41℃三水平。根据国家标准，成人硒日摄入量为50～250 μg，富硒食品要求液态奶类硒含量大于0025 μg/mL，所以选定5，10，15 μg/mL为加硒量的三水平。一般发酵剂接种量在5%左右，选3%，5%，7%为三水平。表2 富硒发酵剂正交试验因素水平表(略)
212 正交试验结果及分析
将纯化后的保加利亚杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌按1∶1∶1混合，(因为对数期菌体代谢旺盛，硒转化率高，且加硒时间越早对菌体代谢抑制越强，从转化率和生产周期考虑，以第6 h 为加硒时间，培养时间为11 h，但本次试验为简便起见，在接种的同时加硒)。采用L9(33)，以酸度(注：表3中的酸度为两次测得的酸度之和)作为评定指标做正交试验，结果见表3、表4。表3 发酵剂正交试验直观分析表(略)表4 正交试验方差分析表(略)
从表3可知，RC>RA>RB>RD，因此试验结果是可靠的，影响发酵剂品质的因素由大到小的顺序为：C接种量，A发酵温度，B加硒量，应选最佳条件为A2B1C3，即采用发酵温度为39℃，加硒量为5 μg/mL，接种量为7%。
从表4的显著性分析可见，接种量(因素C)对发酵剂的酸度影响显著，发酵温度(A)、加硒量(B)对发酵剂的影响均不显著，其中加硒量在给定水平范围内对发酵剂的酸度影响很小，因而可根据实际需要选择其较高大水平。
22 发酵剂活力的测定
采用发酵温度39℃，加硒量5 μg/mL，接种量7%制得发酵剂，放置5 d 后在高压灭菌后的复原脱脂乳培养基中加入3%的发酵剂，并在39℃的培养箱内培养35 h，然后取10 mL 发酵剂，用酚酞作指示剂，以01 mol/L的氢氧化钠来滴定，消耗氢氧化钠715 mL，即此时发酵剂的酸度为715吉尔涅尔度，用公式计算得发酵剂活力为048%。
23 硒测定方法的选择
在食品中硒的测定(GB/T 500993-2003)国家标准中规定了用荧光法和氢化物原子荧光法测定食品中硒的方法。这两种方法具有很高的灵敏度，但受设备条件的限制，在基层不便采用；二氨基联苯胺法灵敏度太低，不能满足卫生检测要求。而陈安天[6]研究表明，亚甲蓝还原法测定微量硒，简便、灵敏、快速，最低检测量为01 μg，最低检测质量浓度为001 μg/mL，适宜的反应温度在20℃～35℃之间，方法稳定、线性良好，相关系数为0928 4～0993 8，回收率在98%～102%；变异系数：实验室内为56%～68%，实验室之间为78%～87%；能满足基层卫生检测的要求[6]。根据本试验的特点和要求，确定选择亚甲蓝还原法测定残留的微量无机硒。如在实际生产中，可采用亚甲蓝还原法和国标法相结合的方法。
24 硒转化率测定结果
将4℃保藏3 d 后的发酵剂稀释10倍，吸取3 mL 发酵剂，定容至10 mL，用亚甲蓝还原法，测得褪色时间为3675 s，由回归方程及转化率公式可得发酵剂的富硒率为5038%。
25 活菌数测定结果
测得发酵剂的活菌数为：72×108cfu/mL。
26 发酵剂感官检验及预试结果
按最佳条件制备A2B1C3发酵剂，经感官检验符合感官质量要求，然后以市售鲜奶为原料乳，接种量7%，加糖量8%，39℃培养5 h，成品酸奶硒转化率达8990%。将此酸奶置于4℃的冰箱中冷藏后熟12 h后品尝鉴定，此时酸奶风味良好，香味浓厚，酸甜柔和，甜酸比协调，酸奶组织均匀细腻。
3 结论
(1)通过正交试验确定富硒活性乳酸菌发酵剂的最佳发酵条件为：发酵温度39℃，加硒量5 μg/mL，接种量7%。
(2)混和菌种采用1∶1∶1的嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚杆菌可弥补单独嗜酸乳杆菌发酵剂发酵时间长及风味的不足。
(3)采用上述最佳发酵条件制备的发酵剂，经过各项检验，符合发酵剂的各项质量要求，可作为生产富硒活性乳酸菌乳制品的工作发酵剂。其中硒总量5 μg/mL，硒转化率达5038%，冷藏5 d 后发酵活力达048，冷藏7 d 后活菌数达72×108 cfu/mL，试验确定该发酵剂是制备富硒酸奶性能良好的发酵剂。
参考文献：
[1]谢丽琪，欧阳政.酵母同化无机硒作用的研究[J].微生物学报，1990，(1)：36-40.
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作者简介：马汉军(1965—)，男，博士，河南科技学院食品学院副教授，研究方向：畜产品贮藏加工及功能性食品研究与开发。
(河南科技学院食品学院，河南新乡 453003), 百拇医药(马汉军 宋照军 赵良 王树宁 潘润淑 裴延信)